骨骼肌细胞葡萄糖运载体4的实验研究*
作者：杨晓冰1 吴 毅1 李云霞1 胡永善1 张新堂2 平蓓芳2 朱尚权2
单位：1 上海医科大学附属华山医院康复医学科，上海乌鲁木齐中路12号，200040；2 中国科学院上海生化所，200032
关键词：多克隆抗体；骨骼肌；GLUT4；Western印迹法
中国康复医学杂志980301 摘要 目的：制备大鼠骨骼肌葡萄糖运载体4(glucose transporter 4,GLUT4)羧基端13肽的多克隆抗体，分离正常大鼠骨骼肌细胞内、外膜，并测定膜上GLUT4的含量。方法：采用Merrifield固相合成法制备GLUT4羧基端13肽，免疫兔子后得到抗血清和抗体。运用蔗糖梯度超速离心法分离大鼠骨骼肌细胞内外膜，并以Western印迹法测定细胞内外膜GLUT4蛋白的含量。结果：正常大鼠骨骼肌外膜和内膜中均有GLUT4的存在，其中内膜中的含量大于外膜。结论：运用免疫法获得的GLUT4多克隆抗体具有高效价，对骨骼肌细胞内外膜GLUT4的研究，将有助于糖代谢紊乱、葡萄糖转运机制障碍的研究。
, 百拇医药
An experimental study of the distribution of GLUT4 in rat skeletal muscle/YANG Xiaobing , WU Yi, LI Yunxia, et al//Chinese Journal of Rehabilitation Medicine,1998,13(3):98～100
Abstract Objective:To prepare the polyclonal antibodies against the peptide corresponding carboxyl terminus of GLUT4,and study the distrubution of GLUT4 glucose carriers in normal SD rat′s skeletal muscle. Method:The 13-aa peptide corresponding carboxyl terminus of GLUT4 was prepared by Merrifield′s solid phase synthesis.After immuning rabbits with immunogen which was mixed 13-aa peptide with typhoid bacillus, we tested polyclonal antibody with ELISA. The distribution of GLUT4 glucose carriers in skeletal muscle which was seperated by using sucrose gradient ultracentrifugation was examined with Western-blot analysis. Result:The polyclonal antibody had high titer. There were more GLUT4 in intracellular membrane fraction than membrane preparation enriched in sarcolemma.Conclusion:Polyclonal antibody against the peptide corresponding carboxyl terminus of GLUT4 we prepared mihgt provide quantified assessment of curative effect for diabetes.
, 百拇医药
Author′s address Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai, 200040
Key words Polyclonal antibody;Skeletal muscle;Glucose transporter 4; Western-blot
研究表明，葡萄糖的跨膜转运是骨骼肌葡萄糖代谢的限速步骤，这一过程是由细胞膜上的葡萄糖运载体(glucose transporter, GLUT)介导并通过易化扩散来完成的〔1〕。目前发现骨骼肌内存在两种GLUT，分别为GLUT1和GLUT4。前者活性低，只在基础状态下起作用；而后者活性高，在基础状态及胰岛素刺激下都起主要的转运葡萄糖的作用。通常GLUT4存在于细胞内膜中。在胰岛素的作用下，GLUT4从细胞内膜转位至细胞外膜，从而发挥其生理作用〔2〕。骨骼肌是全身葡萄糖利用的最主要组织，也是胰岛素介导葡萄糖进入细胞内的重要部位，约占整个葡萄糖转运的90% (脂肪组织只占5%左右),并且是糖尿病胰岛素受体后抵抗的主要部位〔3〕。因此，对骨骼肌GLUT4的研究有很重要意义，本研究的目的是制备GLUT4的多克隆抗体，然后用Western印迹法对正常大鼠骨骼肌细胞内膜和外膜GLUT4蛋白的分布进行检测，为进一步研究糖尿病的病理机制和治疗机制打下基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 多克隆抗体的制备
参照James方法〔4〕，采用Merrifield固相合成法制备GLUT4羧基端13肽(Cys-Thr-Glu-Leu-Glu-Tyr-Ile-Gly-Pro-Asp-Glu-Asn-Asp)，以灭活的伤寒杆菌菌壳为载体，用福氏完全佐剂乳化，制备免疫原免疫兔子，每两周免疫1次，用ELISA法测血清抗体滴度，获满意结果后，处死兔子取血清，经饱和硫酸铵沉淀，透析，冷冻干燥，得GLUT4多克隆抗体干粉。
1.2 大鼠骨骼肌细胞内膜和外膜的分离
用改良Klips方法〔5〕制备大鼠骨骼肌细胞内外膜。大鼠断头处死后，取后肢大腿肌肉，浸至0℃溶液A(250mm Sucrose, 50mm Tris,0.2mm EDTA)中，剔除血管、脂肪及筋膜后，剪碎，匀浆，匀浆液以9000g 高速离心10min(4℃)，保留上清，沉淀如上再匀浆、离心，两次上清以19000g超离心1h，取沉淀铺于25%、30%、35%的蔗糖梯度上，15000g超离心16h。于25%蔗糖层上得到细胞外膜，35%层上得到细胞内膜，用改良Lowry法〔6〕测蛋白浓度，测定细胞内膜和外膜的蛋白含量。
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1.3 GLUT4的检测
取骨骼肌细胞内膜和外膜各100μg进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，再与含5%脱脂奶粉的PBS 水浴摇床温育1h(37℃)，再与GLUT4多克隆抗体反应过夜(4℃)，洗涤后与HRP标记的羊抗兔IgG 温育2h(37℃)，充分洗涤后与ECL(增强化学发光剂，美国Amersham公司)反应1min，即刻与Kodak底片曝光，洗片后进行扫描、定量(岛津双波长薄层扫描仪)。
2 结果
2.1 制备得到的GLUT4多克隆抗体具有高效价
见表1。
2.2 骨骼肌细胞内膜和外膜蛋白含量的比较
见表2。通过梯度离心法获得细胞内膜和外膜的的总蛋白量不同，细胞内膜的总蛋白量大大超过细胞外膜的总蛋白量，约为细胞外膜的8倍。
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表1 4只兔子产生的多克隆抗体的效价比较 兔子编号
抗体滴度
免疫次数
1
1∶25600
3
2
1∶25600
3
3
1∶51200
3
4
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1∶51200
3
5
1∶51200
2
表2 骨骼肌细胞内膜和外膜蛋白含量的比较
体积
(ml)
蛋白浓度
(mg/ml)
蛋白含量
(μg/g组织)
细胞内膜
, 百拇医药
2.40
7.8
418
细胞外膜
0.33
6.3
51
2.3 细胞内膜和外膜GLUT4蛋白含量的比较
在相同蛋白量时(同为100mg蛋白)细胞内膜和外膜上GLUT4蛋白量无显著差异(P>0.05)(见图1、2)，而实验中所得到内膜的量约为外膜的8倍，故在基础状态下，内膜GLUT4蛋白的含量大于外膜。
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图1 Western blot 法检测大鼠骨骼肌细胞内、外膜上GLUT4
图2 相同蛋白量时(100μg)，骨骼肌细胞
内膜和外膜GLUT4含量的比较
3 讨论
细胞内膜是细胞器膜和核膜的统称，其作用是把原生质分成既互相隔离、互不干扰，又互相关联、彼此依存的多相微环境。由于内膜和外膜的密度不同，内膜的沉降系数大于外膜，可通过梯度离心方法将其分离。Klip的实验〔5〕表明，将细胞粗膜进行蔗糖梯度的超速离心，在25%的蔗糖浓度层收集的细胞膜富含5-核苷酸酶和Mg2+-ATP酶，确定为细胞外膜，而在35%层收集的细胞膜不含5-核苷酸酶和Mg2+-ATP酶，确定为细胞内膜，主要是以微粒体为主。本实验参照Klip的实验方法进行骨骼肌细胞内外膜的分离，表明细胞内膜的含量大大超过外膜的量(表2)，与Klip的结果相一致。
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GLUT4是一种糖蛋白，由509个氨基酸组成，分子量约为45～55KD。图1所示在48000分子量处见明显的GLUT4蛋白条带，经扫描定量，在相同蛋白量时，细胞内外膜的GLUT4蛋白含量无显著差异，由于细胞内膜含量大大超过外膜，故内膜中GLUT4蛋白的绝对含量大大超过外膜，这与Marette等〔7、8〕的报道相一致。在静息状态下，绝大部分GLUT4蛋白位于细胞内膜中，如微粒体、高尔基体、及其它对胰岛素敏感的富含GLUT4的囊泡样膜结构〔2〕，只有2%位于细胞外膜上。当胰岛素与受体相结合后，触发细胞的排粒过程，GLUT4从细胞内向细胞外膜移动并与细胞外膜融合，转位于细胞外膜上，发挥其转运葡萄糖的生理作用。当胰岛素与受体脱离后，GLUT4又重新回至细胞内，恢复原来水平。
近年来，许多研究表明GLUT4质和量的异常是胰岛素受体后抵抗的主要原因之一。本研究通过制备GLUT4的多克隆抗体并对骨骼肌细胞内膜和外膜GLUT4蛋白的分布进行研究，这些研究将有助于进一步对糖尿病胰岛素后抵抗的研究，因此有着很重要的意义。
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4 参考文献
1 Flink P, Wallace P, Brechtel G, et al. Evidence that glucose transport is rate limiting for in vivo glucose uptake. Metabolism, 1992, 41:897.
2 Kandror KV, Coderre L, Pushkin AV, et al. Comparison of glucose transporter containing vesicles from rat fat and muscle tissues evidence for a unique endoxomal compartant . Biochem J, 1995,307:383.
3 Garvey WT, Huecksteadt TP, Matthaki S, et al. Role of glucose transporters in the cellular insulin resistance of type II non insulin-dependent diabetes mellitus. J Clin Invest ,1988, 81:1528.
, 百拇医药
4 James D, Strube M,Mueckler M. Molecular cloning and characterization of an insulin-regulatable glucose transporter. Nature ,1989, 338: 83.
5 Klip A, Ramlal T, Young DA, et al.Insulin-induced translocation of glucose transporters in rat hindlimb muscles. FEBS Lett,1987,224: 224.
6 Lowery OH. Protein measurement with the folinphenol reagent, J Biol Chem, 1951,193:265.
7 Marette A, Richardson JM. Ramlal T, et al.Abundance,localization, and insulin-induced translocation of glucose transporters in red and white muscle. Am J Phsiol,1992, 263:C433.
8 Zorzano A, Munoz P, Camps M, et al.Insulin-induced redistribution of GLUT4 glucose carriers in the muscle fiber. Diabetes,1996, 45(Suppl 1):s70.
本课题为国家自然科学基金资助项目
收稿日期：1997-12-03, http://www.100md.com(杨晓冰1 吴 毅1 李云霞1 胡永善1 张新堂2 平蓓芳2 朱尚权2)
单位：1 上海医科大学附属华山医院康复医学科，上海乌鲁木齐中路12号，200040；2 中国科学院上海生化所，200032
关键词：多克隆抗体；骨骼肌；GLUT4；Western印迹法
中国康复医学杂志980301 摘要 目的：制备大鼠骨骼肌葡萄糖运载体4(glucose transporter 4,GLUT4)羧基端13肽的多克隆抗体，分离正常大鼠骨骼肌细胞内、外膜，并测定膜上GLUT4的含量。方法：采用Merrifield固相合成法制备GLUT4羧基端13肽，免疫兔子后得到抗血清和抗体。运用蔗糖梯度超速离心法分离大鼠骨骼肌细胞内外膜，并以Western印迹法测定细胞内外膜GLUT4蛋白的含量。结果：正常大鼠骨骼肌外膜和内膜中均有GLUT4的存在，其中内膜中的含量大于外膜。结论：运用免疫法获得的GLUT4多克隆抗体具有高效价，对骨骼肌细胞内外膜GLUT4的研究，将有助于糖代谢紊乱、葡萄糖转运机制障碍的研究。
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An experimental study of the distribution of GLUT4 in rat skeletal muscle/YANG Xiaobing , WU Yi, LI Yunxia, et al//Chinese Journal of Rehabilitation Medicine,1998,13(3):98～100
Abstract Objective:To prepare the polyclonal antibodies against the peptide corresponding carboxyl terminus of GLUT4,and study the distrubution of GLUT4 glucose carriers in normal SD rat′s skeletal muscle. Method:The 13-aa peptide corresponding carboxyl terminus of GLUT4 was prepared by Merrifield′s solid phase synthesis.After immuning rabbits with immunogen which was mixed 13-aa peptide with typhoid bacillus, we tested polyclonal antibody with ELISA. The distribution of GLUT4 glucose carriers in skeletal muscle which was seperated by using sucrose gradient ultracentrifugation was examined with Western-blot analysis. Result:The polyclonal antibody had high titer. There were more GLUT4 in intracellular membrane fraction than membrane preparation enriched in sarcolemma.Conclusion:Polyclonal antibody against the peptide corresponding carboxyl terminus of GLUT4 we prepared mihgt provide quantified assessment of curative effect for diabetes.
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Author′s address Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai, 200040
Key words Polyclonal antibody;Skeletal muscle;Glucose transporter 4; Western-blot
研究表明，葡萄糖的跨膜转运是骨骼肌葡萄糖代谢的限速步骤，这一过程是由细胞膜上的葡萄糖运载体(glucose transporter, GLUT)介导并通过易化扩散来完成的〔1〕。目前发现骨骼肌内存在两种GLUT，分别为GLUT1和GLUT4。前者活性低，只在基础状态下起作用；而后者活性高，在基础状态及胰岛素刺激下都起主要的转运葡萄糖的作用。通常GLUT4存在于细胞内膜中。在胰岛素的作用下，GLUT4从细胞内膜转位至细胞外膜，从而发挥其生理作用〔2〕。骨骼肌是全身葡萄糖利用的最主要组织，也是胰岛素介导葡萄糖进入细胞内的重要部位，约占整个葡萄糖转运的90% (脂肪组织只占5%左右),并且是糖尿病胰岛素受体后抵抗的主要部位〔3〕。因此，对骨骼肌GLUT4的研究有很重要意义，本研究的目的是制备GLUT4的多克隆抗体，然后用Western印迹法对正常大鼠骨骼肌细胞内膜和外膜GLUT4蛋白的分布进行检测，为进一步研究糖尿病的病理机制和治疗机制打下基础。
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1 材料和方法
1.1 多克隆抗体的制备
参照James方法〔4〕，采用Merrifield固相合成法制备GLUT4羧基端13肽(Cys-Thr-Glu-Leu-Glu-Tyr-Ile-Gly-Pro-Asp-Glu-Asn-Asp)，以灭活的伤寒杆菌菌壳为载体，用福氏完全佐剂乳化，制备免疫原免疫兔子，每两周免疫1次，用ELISA法测血清抗体滴度，获满意结果后，处死兔子取血清，经饱和硫酸铵沉淀，透析，冷冻干燥，得GLUT4多克隆抗体干粉。
1.2 大鼠骨骼肌细胞内膜和外膜的分离
用改良Klips方法〔5〕制备大鼠骨骼肌细胞内外膜。大鼠断头处死后，取后肢大腿肌肉，浸至0℃溶液A(250mm Sucrose, 50mm Tris,0.2mm EDTA)中，剔除血管、脂肪及筋膜后，剪碎，匀浆，匀浆液以9000g 高速离心10min(4℃)，保留上清，沉淀如上再匀浆、离心，两次上清以19000g超离心1h，取沉淀铺于25%、30%、35%的蔗糖梯度上，15000g超离心16h。于25%蔗糖层上得到细胞外膜，35%层上得到细胞内膜，用改良Lowry法〔6〕测蛋白浓度，测定细胞内膜和外膜的蛋白含量。
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1.3 GLUT4的检测
取骨骼肌细胞内膜和外膜各100μg进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，再与含5%脱脂奶粉的PBS 水浴摇床温育1h(37℃)，再与GLUT4多克隆抗体反应过夜(4℃)，洗涤后与HRP标记的羊抗兔IgG 温育2h(37℃)，充分洗涤后与ECL(增强化学发光剂，美国Amersham公司)反应1min，即刻与Kodak底片曝光，洗片后进行扫描、定量(岛津双波长薄层扫描仪)。
2 结果
2.1 制备得到的GLUT4多克隆抗体具有高效价
见表1。
2.2 骨骼肌细胞内膜和外膜蛋白含量的比较
见表2。通过梯度离心法获得细胞内膜和外膜的的总蛋白量不同，细胞内膜的总蛋白量大大超过细胞外膜的总蛋白量，约为细胞外膜的8倍。
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表1 4只兔子产生的多克隆抗体的效价比较 兔子编号
抗体滴度
免疫次数
1
1∶25600
3
2
1∶25600
3
3
1∶51200
3
4
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1∶51200
3
5
1∶51200
2
表2 骨骼肌细胞内膜和外膜蛋白含量的比较
体积
(ml)
蛋白浓度
(mg/ml)
蛋白含量
(μg/g组织)
细胞内膜
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2.40
7.8
418
细胞外膜
0.33
6.3
51
2.3 细胞内膜和外膜GLUT4蛋白含量的比较
在相同蛋白量时(同为100mg蛋白)细胞内膜和外膜上GLUT4蛋白量无显著差异(P>0.05)(见图1、2)，而实验中所得到内膜的量约为外膜的8倍，故在基础状态下，内膜GLUT4蛋白的含量大于外膜。
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图1 Western blot 法检测大鼠骨骼肌细胞内、外膜上GLUT4
图2 相同蛋白量时(100μg)，骨骼肌细胞
内膜和外膜GLUT4含量的比较
3 讨论
细胞内膜是细胞器膜和核膜的统称，其作用是把原生质分成既互相隔离、互不干扰，又互相关联、彼此依存的多相微环境。由于内膜和外膜的密度不同，内膜的沉降系数大于外膜，可通过梯度离心方法将其分离。Klip的实验〔5〕表明，将细胞粗膜进行蔗糖梯度的超速离心，在25%的蔗糖浓度层收集的细胞膜富含5-核苷酸酶和Mg2+-ATP酶，确定为细胞外膜，而在35%层收集的细胞膜不含5-核苷酸酶和Mg2+-ATP酶，确定为细胞内膜，主要是以微粒体为主。本实验参照Klip的实验方法进行骨骼肌细胞内外膜的分离，表明细胞内膜的含量大大超过外膜的量(表2)，与Klip的结果相一致。
, 百拇医药
GLUT4是一种糖蛋白，由509个氨基酸组成，分子量约为45～55KD。图1所示在48000分子量处见明显的GLUT4蛋白条带，经扫描定量，在相同蛋白量时，细胞内外膜的GLUT4蛋白含量无显著差异，由于细胞内膜含量大大超过外膜，故内膜中GLUT4蛋白的绝对含量大大超过外膜，这与Marette等〔7、8〕的报道相一致。在静息状态下，绝大部分GLUT4蛋白位于细胞内膜中，如微粒体、高尔基体、及其它对胰岛素敏感的富含GLUT4的囊泡样膜结构〔2〕，只有2%位于细胞外膜上。当胰岛素与受体相结合后，触发细胞的排粒过程，GLUT4从细胞内向细胞外膜移动并与细胞外膜融合，转位于细胞外膜上，发挥其转运葡萄糖的生理作用。当胰岛素与受体脱离后，GLUT4又重新回至细胞内，恢复原来水平。
近年来，许多研究表明GLUT4质和量的异常是胰岛素受体后抵抗的主要原因之一。本研究通过制备GLUT4的多克隆抗体并对骨骼肌细胞内膜和外膜GLUT4蛋白的分布进行研究，这些研究将有助于进一步对糖尿病胰岛素后抵抗的研究，因此有着很重要的意义。
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Flink P, Wallace P, Brechtel G, et al. Evidence that glucose transport is rate limiting for in vivo glucose uptake. Metabolism, 1992, 41:897.
2 Kandror KV, Coderre L, Pushkin AV, et al. Comparison of glucose transporter containing vesicles from rat fat and muscle tissues evidence for a unique endoxomal compartant . Biochem J, 1995,307:383.
3 Garvey WT, Huecksteadt TP, Matthaki S, et al. Role of glucose transporters in the cellular insulin resistance of type II non insulin-dependent diabetes mellitus. J Clin Invest ,1988, 81:1528.
, 百拇医药
4 James D, Strube M,Mueckler M. Molecular cloning and characterization of an insulin-regulatable glucose transporter. Nature ,1989, 338: 83.
5 Klip A, Ramlal T, Young DA, et al.Insulin-induced translocation of glucose transporters in rat hindlimb muscles. FEBS Lett,1987,224: 224.
6 Lowery OH. Protein measurement with the folinphenol reagent, J Biol Chem, 1951,193:265.
7 Marette A, Richardson JM. Ramlal T, et al.Abundance,localization, and insulin-induced translocation of glucose transporters in red and white muscle. Am J Phsiol,1992, 263:C433.
8 Zorzano A, Munoz P, Camps M, et al.Insulin-induced redistribution of GLUT4 glucose carriers in the muscle fiber. Diabetes,1996, 45(Suppl 1):s70.
本课题为国家自然科学基金资助项目
收稿日期：1997-12-03, http://www.100md.com(杨晓冰1 吴 毅1 李云霞1 胡永善1 张新堂2 平蓓芳2 朱尚权2)