“脑功复得”治疗脑伤外后学习记忆障碍的实验研究
作者：涂兰波 张可成 蔡文琴 张文坡
单位：涂兰波(第三军医大学新桥医院神经外科,重庆市新桥，400037)；张可成(第三军医大学新桥医院神经外科,重庆市新桥，400037)；张文坡1(第三军医大学新桥医院神经外科,重庆市新桥，400037)；蔡文琴(第三军医大学组织胚胎学教研室)
关键词：颅脑损伤；“脑功复得”；学习记忆障碍
中国康复医学杂志000110 摘要 目的：研究“脑功复得”(一种中药复方制剂)对脑外伤大鼠学习记忆障碍的治疗作用及作用机理。方法：以液压冲击致颅脑损伤的大鼠为模型，经“脑功复得”治疗后以主动回避试验测定大鼠学习记忆能力，运用光镜行形态学检查，并检测其脑组织中乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、谷氨酸含量。结果：“脑功复得”治疗组大鼠学习记忆能力提高，脑组织中乙酰胆碱和谷氨酸含量增加，存活的海马神经元增多。结论：“脑功复得”通过提高脑组织中乙酰胆碱和谷氨酸含量及保护海马神经元而发挥其治疗作用。
, http://www.100md.com
An experimental study on Naogongfude in treatment for dysfunction of learning and memory in rats post brain trauma
TU Lanbo,ZHANG Kecheng,CAI Wenqin,et al
Dept. of Neurosurgery,Xinqiao Hospital,Chongqing,400037
Abstract Objective：To evaluate the effects of Naogongfude(a kind of compound prescripition of Chinese herbs) on brain injury in the Wistar rats.Method:The model was induced by machine of fluid-percussion. The ability of learning and memory ,the levels of acetycholine and gamma-aminobutyric acid(GABA),and glutamate,and histopathological changes were examined.Result & Conclusion: Naogongfude could improve the ability of learning and memory by increasing the levels of acetycholine and glutamate and protecting the neurons in hippocampal.
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Key words Brain injury;Nangongfude;Dysfunction of learning and memory
颅脑损伤，特别是重型颅脑损伤患者往往遗留不同程度的神经精神症状和智力障碍，给家庭及社会带来巨大的负担，甚至造成危害。经临床验证，“脑功复得”这一中药复方制剂对颅脑损伤、脑缺血性疾病、帕金森病〔1〕的恢复有较好疗效。由于临床研究的复杂性及难控制性，我们以大鼠为对象对其治疗脑损伤后学习记忆障碍的作用及机理进行探讨。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及处理
选用第三军医大学实验动物中心提供的雄性Wistar大鼠，体重250±20g。将成功制作的大鼠模型随机分为正常组、对照组、治疗组，各组处理方法如下。
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1.1.1 治疗组 模型制作采用电脑控制的液压冲击致伤仪参照Dixon〔2〕建立的方法施行。麻醉苏醒后放回笼中饲养。术后饲以普通饲料，第2天以灌胃法喂服“脑功复得”口服液(由第三军医大学神经科学中心提供)，每只每次0.2ml，每天3次。
1.1.2 对照组 致伤过程及制作同治疗组，术后只饲以普通饲料。
1.1.3 正常组 手术过程同治疗组，不行冲击致伤，术后饲以普通饲料。
1.2 测定指标及方法
1.2.1 大鼠主动回避反应的测定：参照邬力祥〔3〕等的方法进行，每天训练20次，以正确反应率连续3天都在80%以上为习得标准。达习得标准后制作损伤模型，于术后第1、3、7、14d测定正确反应率。
1.2.2 乙酰胆碱的测定：参照鲁祖荪〔4〕等的碱性羟胺比色法进行。
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1.2.3 γ-氨基丁酸、谷氨酸的测定：取上述脑组织中称量，按每50mg脑组织加入1ml 10%磺基水杨酸钠进行冰浴匀浆。在4℃条件下以18000r/min离心20min。取上清于-20℃条件下保存，低温下送检，以美国Beckman公司的6300黄金系统高效氨基酸分析仪检测。
1.2.4 形态学检查：将大鼠断头处死后快速取脑。冠状切取脑组织浸入10%福尔马林溶液中固定，于4℃保存。按常规石蜡包埋组织，冠状切片，厚约5μm，作HE染色光镜观察海马锥体细胞变化情况。
1.2.5 统计学方法：数据采用Microsoft Excel软件处理，数据以平均数±标准差表示，采用t检验进行检验。
2 结果
脑液压冲击致伤仪显示出良好的重复性和稳定性，经电脑测试显示致伤强度在150±20kPa可复制出中度脑损伤模型。
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2.1 爬杆主动回避反应
爬杆主动回避反应反映动物学习和记忆能力。主动回避反应的习得主要表现动物学习和短时记忆能力的强弱。主动回避反应的消退主要反映动物长时记忆的巩固水平。损伤前各组大鼠达习得标准的训练时间无明显差异(表1)，说明损伤前各组大鼠记忆力无明显差别。损伤后第1、3天主动回避反应正确率无显著性差别，第7、14天治疗组较对照组有明显升高(表2)。
表1 损伤前大鼠主动回避反应达习得标准的训练时间
(
±s) 组别
例数
训练时间(天)
正常组
, 百拇医药
9
12.5±0.55
对照组
9
12.3±0.33
治疗组
9
12.2±0.60
表2 损伤后第1、3、7、14天主动回避反应正确率
(±s) (%) 术后天数
例数
, 百拇医药
正常组
对照组
治疗组
1天
9
27.4±6.54
26.5±5.46
27.8±6.74
3天
9
56.7±6.83
45.3±4.08
43.3±6.06
, 百拇医药
7天
9
75.8±3.76
46.0±8.37
68.3±5.16①
14天
9
82.4±4.76
48.8±5.78
70.4±6.56①
①与对照组比较P<0.012.2 乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、谷氨酸含量测定
, 百拇医药
见表3。脑外伤后对照组大鼠脑组织中乙酰胆碱的含量稍高于正常组，但无统计学意义；治疗组乙酰胆碱含量明显增高，具有显著性差异，说明“脑功复得”能升高脑组织中乙酰胆碱的含量。谷氨酸的浓度在对照组中低于正常组，治疗组较对照组明显升高，具有显著性差异，说明“脑功复得”可提高脑组织中谷氨酸的浓度。
表3 脑组织中乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、谷氨酸含量
(±s) (μmol/g) 组别
例数
乙酰胆碱
γ-氨基丁酸
谷氨酸
正常组
, 百拇医药
9
1.12±0.67
2.90±0.43
7.92±0.25
对照组
10
1.40±0.62
3.16±0.50
7.26±0.83
治疗组
10
3.27±0.68①
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3.24±0.54
8.46±0.57②
①与对照组比较P<0.01,②与对照组比较P<0.052.3 形态学检查
治疗组海马CA2、CA3区锥体细胞较对照组明显增多，而CA1区差别则不如上述二区明显。
3 讨论
1987年，美国Dixon博士建立了大鼠的液压颅脑伤模型〔2〕。由于其稳定性和重复性好，致伤能量可以测定，伤情可以分组，故此模型已广泛应用于颅脑损伤后神经病理、神经生化、神经电生理、神经递质和受体，神经行为功能，脑能量代谢、脑血流量和药物疗效的判断研究。本实验采用此模型制作中度脑损伤模型，经致伤当时动物的观察，计算机屏幕上致伤强度的显示及病理切片的观察均可见同组动物之间致伤差别小，进一步说明了该模型的重复性、稳定性好，是一个较理想的脑外伤模型。
, 百拇医药
“脑功复得”是由天麻、人参、党参、川芎、北五味子等多种中草药精制提取而成。这些中药材含有神经活化营养因子、神经细胞必需的氨基酸、类皮质激素、皂甙和生物碱成分，因而具有扩张毛细血管、镇静、镇痛、解痉、利尿、提高白细胞含量和增强免疫力等药理性能，并具有改善脑微循环、增强学习记忆能力、提高大脑皮质的工作能力、促进损伤神经元恢复和延缓衰老的作用。人的大脑功能与作用机理非常复杂，“脑功复得”的优点可能在于其神经药理活性的多样性，通过不同途径作用于多种神经传递机制，从而发挥其促进神经功能恢复的作用。
主动回避反应是通过对“灯光-电击”的多次学习，使大鼠当条件(灯光)出现时，产生一种自发的回避行为(躲避电击)。主动回避能力的获得更接近人类在通常情况下学习记忆的行为动作。本实验资料显示“脑功复得”治疗组损伤后第7天及第14天主动回避正确率明显高于对照组，表明治疗组的记忆能力均较对照组高，显示脑功复得对颅脑损伤后大鼠的学习记忆能力的恢复有较好的疗效。
有资料表明，大鼠经训练后，皮层和海马乙酰胆碱和胆碱转移酶含量升高。拟胆碱能药物能改善学习和记忆功能〔5〕。Miranda〔6〕等通过对特定的新皮层损伤和实验研究发现，大鼠厌恶性条件反射行为的学习功能的形成和恢复与该区域脑皮层乙酰胆碱的正常释放密切相关。为了排除由于大鼠通过主动回避反应训练行为所可能引起的神经递质和氨基酸类递质的变化给乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、谷氨酸等递质测定带来混杂影响，本实验中所有训练大鼠均于学习记忆能力测定后处死弃去。本实验显示治疗组大鼠脑组织乙酰胆碱含量高于对照组，表明脑功复得通过增加乙酰胆碱的释放量而增强胆碱能系统的活动，从而使大鼠的学习记忆能力获得改善。本实验再次表明脑组织中乙酰胆碱含量与大鼠的学习记忆能力有密切的关系，也说明脑功复得通过提高大鼠脑组织乙酰胆碱含量而增强学习记忆能力。
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GABA受体阻滞剂可导致大鼠海马长时程增强抑制，空间学习能力受损。本组实验显示治疗组与对照组GABA的浓度高于正常组，但均未显示出有显著差异性，不能显示其与学习记忆能力有较大的相关性，故认为脑外伤后脑功复得口服液可能并不通过此途径而发挥其治疗作用。本实验结果显示，损伤对照组的谷氨酸浓度较正常组稍低，治疗组较正常组升高，治疗组较对照组明显增高并具显著差异性，表明脑功复得通过提高脑中谷氨酸浓度而发挥其促进学习记忆的作用。
4 参考文献
1，吕胜青，张可成，蔡文琴，等.脑功复得治疗帕金森病的实验研究.立体定向和功能性神经外科杂志,1999，12(2)：4-6.
2，Dixon CE,Leyth BG,John T,et al.A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat.J Neurosurg,1987,67:110-119.
, http://www.100md.com
3，邬力祥，朱新裘，罗志勇,等.噪声对大鼠学习记忆的影响.中国应用生理学杂志,1992,8(2)：164-166.
4，鲁祖荪，叶菲,都本业.碱性羟胺比色法测定全血乙酰胆碱.临床检验杂志，1992，10：84-85.
5，Pike BR,Hamm RI.Activating the posttraumatic cholinergic system for the treatment of cognitive impairment following traumatic brain injury.Parmacol Biochem Behav,1997,57(4):785-791.
6，Miranda MI,Lopez-Colome AM,Bermudez-Rattoni F.Recovery of taste aversion learning induced by fetal neocortex grafts: correlation with in vivo extracellular acetylcholine.Brain Res,1997,759(1):141-148.
收稿日期：1999-09-20, 百拇医药
单位：涂兰波(第三军医大学新桥医院神经外科,重庆市新桥，400037)；张可成(第三军医大学新桥医院神经外科,重庆市新桥，400037)；张文坡1(第三军医大学新桥医院神经外科,重庆市新桥，400037)；蔡文琴(第三军医大学组织胚胎学教研室)
关键词：颅脑损伤；“脑功复得”；学习记忆障碍
中国康复医学杂志000110 摘要 目的：研究“脑功复得”(一种中药复方制剂)对脑外伤大鼠学习记忆障碍的治疗作用及作用机理。方法：以液压冲击致颅脑损伤的大鼠为模型，经“脑功复得”治疗后以主动回避试验测定大鼠学习记忆能力，运用光镜行形态学检查，并检测其脑组织中乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、谷氨酸含量。结果：“脑功复得”治疗组大鼠学习记忆能力提高，脑组织中乙酰胆碱和谷氨酸含量增加，存活的海马神经元增多。结论：“脑功复得”通过提高脑组织中乙酰胆碱和谷氨酸含量及保护海马神经元而发挥其治疗作用。
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An experimental study on Naogongfude in treatment for dysfunction of learning and memory in rats post brain trauma
TU Lanbo,ZHANG Kecheng,CAI Wenqin,et al
Dept. of Neurosurgery,Xinqiao Hospital,Chongqing,400037
Abstract Objective：To evaluate the effects of Naogongfude(a kind of compound prescripition of Chinese herbs) on brain injury in the Wistar rats.Method:The model was induced by machine of fluid-percussion. The ability of learning and memory ,the levels of acetycholine and gamma-aminobutyric acid(GABA),and glutamate,and histopathological changes were examined.Result & Conclusion: Naogongfude could improve the ability of learning and memory by increasing the levels of acetycholine and glutamate and protecting the neurons in hippocampal.
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Key words Brain injury;Nangongfude;Dysfunction of learning and memory
颅脑损伤，特别是重型颅脑损伤患者往往遗留不同程度的神经精神症状和智力障碍，给家庭及社会带来巨大的负担，甚至造成危害。经临床验证，“脑功复得”这一中药复方制剂对颅脑损伤、脑缺血性疾病、帕金森病〔1〕的恢复有较好疗效。由于临床研究的复杂性及难控制性，我们以大鼠为对象对其治疗脑损伤后学习记忆障碍的作用及机理进行探讨。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及处理
选用第三军医大学实验动物中心提供的雄性Wistar大鼠，体重250±20g。将成功制作的大鼠模型随机分为正常组、对照组、治疗组，各组处理方法如下。
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1.1.1 治疗组 模型制作采用电脑控制的液压冲击致伤仪参照Dixon〔2〕建立的方法施行。麻醉苏醒后放回笼中饲养。术后饲以普通饲料，第2天以灌胃法喂服“脑功复得”口服液(由第三军医大学神经科学中心提供)，每只每次0.2ml，每天3次。
1.1.2 对照组 致伤过程及制作同治疗组，术后只饲以普通饲料。
1.1.3 正常组 手术过程同治疗组，不行冲击致伤，术后饲以普通饲料。
1.2 测定指标及方法
1.2.1 大鼠主动回避反应的测定：参照邬力祥〔3〕等的方法进行，每天训练20次，以正确反应率连续3天都在80%以上为习得标准。达习得标准后制作损伤模型，于术后第1、3、7、14d测定正确反应率。
1.2.2 乙酰胆碱的测定：参照鲁祖荪〔4〕等的碱性羟胺比色法进行。
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1.2.3 γ-氨基丁酸、谷氨酸的测定：取上述脑组织中称量，按每50mg脑组织加入1ml 10%磺基水杨酸钠进行冰浴匀浆。在4℃条件下以18000r/min离心20min。取上清于-20℃条件下保存，低温下送检，以美国Beckman公司的6300黄金系统高效氨基酸分析仪检测。
1.2.4 形态学检查：将大鼠断头处死后快速取脑。冠状切取脑组织浸入10%福尔马林溶液中固定，于4℃保存。按常规石蜡包埋组织，冠状切片，厚约5μm，作HE染色光镜观察海马锥体细胞变化情况。
1.2.5 统计学方法：数据采用Microsoft Excel软件处理，数据以平均数±标准差表示，采用t检验进行检验。
2 结果
脑液压冲击致伤仪显示出良好的重复性和稳定性，经电脑测试显示致伤强度在150±20kPa可复制出中度脑损伤模型。
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2.1 爬杆主动回避反应
爬杆主动回避反应反映动物学习和记忆能力。主动回避反应的习得主要表现动物学习和短时记忆能力的强弱。主动回避反应的消退主要反映动物长时记忆的巩固水平。损伤前各组大鼠达习得标准的训练时间无明显差异(表1)，说明损伤前各组大鼠记忆力无明显差别。损伤后第1、3天主动回避反应正确率无显著性差别，第7、14天治疗组较对照组有明显升高(表2)。
表1 损伤前大鼠主动回避反应达习得标准的训练时间
(
±s) 组别例数
训练时间(天)
正常组
, 百拇医药
9
12.5±0.55
对照组
9
12.3±0.33
治疗组
9
12.2±0.60
表2 损伤后第1、3、7、14天主动回避反应正确率
(
±s) (%) 术后天数例数
, 百拇医药
正常组
对照组
治疗组
1天
9
27.4±6.54
26.5±5.46
27.8±6.74
3天
9
56.7±6.83
45.3±4.08
43.3±6.06
, 百拇医药
7天
9
75.8±3.76
46.0±8.37
68.3±5.16①
14天
9
82.4±4.76
48.8±5.78
70.4±6.56①
①与对照组比较P<0.012.2 乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、谷氨酸含量测定
, 百拇医药
见表3。脑外伤后对照组大鼠脑组织中乙酰胆碱的含量稍高于正常组，但无统计学意义；治疗组乙酰胆碱含量明显增高，具有显著性差异，说明“脑功复得”能升高脑组织中乙酰胆碱的含量。谷氨酸的浓度在对照组中低于正常组，治疗组较对照组明显升高，具有显著性差异，说明“脑功复得”可提高脑组织中谷氨酸的浓度。
表3 脑组织中乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、谷氨酸含量
(
±s) (μmol/g) 组别例数
乙酰胆碱
γ-氨基丁酸
谷氨酸
正常组
, 百拇医药
9
1.12±0.67
2.90±0.43
7.92±0.25
对照组
10
1.40±0.62
3.16±0.50
7.26±0.83
治疗组
10
3.27±0.68①
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3.24±0.54
8.46±0.57②
①与对照组比较P<0.01,②与对照组比较P<0.052.3 形态学检查
治疗组海马CA2、CA3区锥体细胞较对照组明显增多，而CA1区差别则不如上述二区明显。
3 讨论
1987年，美国Dixon博士建立了大鼠的液压颅脑伤模型〔2〕。由于其稳定性和重复性好，致伤能量可以测定，伤情可以分组，故此模型已广泛应用于颅脑损伤后神经病理、神经生化、神经电生理、神经递质和受体，神经行为功能，脑能量代谢、脑血流量和药物疗效的判断研究。本实验采用此模型制作中度脑损伤模型，经致伤当时动物的观察，计算机屏幕上致伤强度的显示及病理切片的观察均可见同组动物之间致伤差别小，进一步说明了该模型的重复性、稳定性好，是一个较理想的脑外伤模型。
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“脑功复得”是由天麻、人参、党参、川芎、北五味子等多种中草药精制提取而成。这些中药材含有神经活化营养因子、神经细胞必需的氨基酸、类皮质激素、皂甙和生物碱成分，因而具有扩张毛细血管、镇静、镇痛、解痉、利尿、提高白细胞含量和增强免疫力等药理性能，并具有改善脑微循环、增强学习记忆能力、提高大脑皮质的工作能力、促进损伤神经元恢复和延缓衰老的作用。人的大脑功能与作用机理非常复杂，“脑功复得”的优点可能在于其神经药理活性的多样性，通过不同途径作用于多种神经传递机制，从而发挥其促进神经功能恢复的作用。
主动回避反应是通过对“灯光-电击”的多次学习，使大鼠当条件(灯光)出现时，产生一种自发的回避行为(躲避电击)。主动回避能力的获得更接近人类在通常情况下学习记忆的行为动作。本实验资料显示“脑功复得”治疗组损伤后第7天及第14天主动回避正确率明显高于对照组，表明治疗组的记忆能力均较对照组高，显示脑功复得对颅脑损伤后大鼠的学习记忆能力的恢复有较好的疗效。
有资料表明，大鼠经训练后，皮层和海马乙酰胆碱和胆碱转移酶含量升高。拟胆碱能药物能改善学习和记忆功能〔5〕。Miranda〔6〕等通过对特定的新皮层损伤和实验研究发现，大鼠厌恶性条件反射行为的学习功能的形成和恢复与该区域脑皮层乙酰胆碱的正常释放密切相关。为了排除由于大鼠通过主动回避反应训练行为所可能引起的神经递质和氨基酸类递质的变化给乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、谷氨酸等递质测定带来混杂影响，本实验中所有训练大鼠均于学习记忆能力测定后处死弃去。本实验显示治疗组大鼠脑组织乙酰胆碱含量高于对照组，表明脑功复得通过增加乙酰胆碱的释放量而增强胆碱能系统的活动，从而使大鼠的学习记忆能力获得改善。本实验再次表明脑组织中乙酰胆碱含量与大鼠的学习记忆能力有密切的关系，也说明脑功复得通过提高大鼠脑组织乙酰胆碱含量而增强学习记忆能力。
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GABA受体阻滞剂可导致大鼠海马长时程增强抑制，空间学习能力受损。本组实验显示治疗组与对照组GABA的浓度高于正常组，但均未显示出有显著差异性，不能显示其与学习记忆能力有较大的相关性，故认为脑外伤后脑功复得口服液可能并不通过此途径而发挥其治疗作用。本实验结果显示，损伤对照组的谷氨酸浓度较正常组稍低，治疗组较正常组升高，治疗组较对照组明显增高并具显著差异性，表明脑功复得通过提高脑中谷氨酸浓度而发挥其促进学习记忆的作用。
4 参考文献
1，吕胜青，张可成，蔡文琴，等.脑功复得治疗帕金森病的实验研究.立体定向和功能性神经外科杂志,1999，12(2)：4-6.
2，Dixon CE,Leyth BG,John T,et al.A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat.J Neurosurg,1987,67:110-119.
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3，邬力祥，朱新裘，罗志勇,等.噪声对大鼠学习记忆的影响.中国应用生理学杂志,1992,8(2)：164-166.
4，鲁祖荪，叶菲,都本业.碱性羟胺比色法测定全血乙酰胆碱.临床检验杂志，1992，10：84-85.
5，Pike BR,Hamm RI.Activating the posttraumatic cholinergic system for the treatment of cognitive impairment following traumatic brain injury.Parmacol Biochem Behav,1997,57(4):785-791.
6，Miranda MI,Lopez-Colome AM,Bermudez-Rattoni F.Recovery of taste aversion learning induced by fetal neocortex grafts: correlation with in vivo extracellular acetylcholine.Brain Res,1997,759(1):141-148.
收稿日期：1999-09-20, 百拇医药