电镜冷冻蚀刻技术在肌营养不良症研究中的应用
作者：钟秀容 陈文列 陈莲云 王柠 吴翊饮 慕容慎行
单位：福建医科大学附属一院神经内科 350004 福州市
关键词：电镜冷冻蚀刻；肌营养不良；骨骼肌；红细胞；细胞膜
中国临床解剖学杂志000140摘 要：目的：探讨电镜冷冻蚀刻技术在Duchenne型肌营养不良症(DMD)研究中的应用。方法：电镜观察DMD及正常对照的骨骼肌和红细胞的冷冻蚀刻样品。结果：DMD患者红细胞与肌细胞一样，其细胞膜中的蛋白颗粒显著减少。结论：①冷冻蚀刻技术有助于DMD的诊断，其细胞膜存在缺陷；②可取红细胞代替肌组织进行诊断。
Application of freeze-etching electron microscopy in study of muscular dystophy
, 百拇医药
Zhong Xiurong Chen Wenlei Chen Lianyun,et al.
Laboratory of Electron Microscopy,Fujian Medical University,Fuzhou 350004
Abstract：Objective:To explore the application of freeze-etching electrom microscopy in the study of Duchenne muscular dystrophy(DMD).Methods:The freeze-etching samples for skeletal muscles and erythrocytes of DMD and the normal skeletal muscles were observed under electron microscope.Results:The intramembrane proteinic particles of cell membranes of erythrocyte as well as of muscular cells were diminished significantly in DMD.Conclusions:Freeze-etching technique conduces to the diagnosis of DMD that has defect in cell membrane.The erythrocytes can be collected to substitute for the muscle in diagnosis of DMD.
, 百拇医药
Key words：Freeze-etching electron microscopy Muscular dystrophy Skeletal muscle Erythrocyte Cell membrane▲
近年来，由于常规电镜技术的应用以及遗传学、生物化学、组织化学、酶学研究的迅速发展，对肌病的诊断有重大进展[1]。Duchenne型肌营养不良症(DMD)是一组由遗传因素所致的的X连锁隐性遗传病，越来越多的学者认为细胞膜的缺陷在本病中有重要地位。作者曾在国内首次应用电镜冷冻蚀刻技术对该病骨骼肌细胞膜及红细胞膜内的蛋白颗粒进行定量研究[2，3]，探讨其发病机理。本文就该技术的应用价值及其技术改进、操作要点予以介绍。
1 材料和方法
1.1 骨骼肌活检
选择具有典型临床特征与经实验诊断包括生化、肌电图、肌肉活检确诊为DMD的患者，根据病情选择肱二头肌或腓肠肌，将2%利多卡因注入皮下脂肪，局部麻醉深至肌筋膜外层，小心分离暴露出肌组织，切取2 mm×3 mm×4 mm长方形小块，迅速投入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定液(pH7.2)中，预固定0.5h成型后，再切成1 mm×1 mm×3 mm的小块保存于4℃固定液中。另取骨折手术的健康人骨骼肌标本，作为正常对照。
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1.2 红细胞取材
抽取DMD患者及正常供血员外周静脉血4 ml，迅速注入含有肝素抗凝剂的离心管中，2300r/min离心10 min后，弃上层的血浆及白细胞层，沿试管壁缓慢加入上述固定液，置4℃固定过夜，然后挑取上层固定成型的红细胞团切成长方形小块，保存于4℃固定液中备用。
1.3 冷冻蚀刻技术
分别将上述标本用0.1 mol/L PBS漂洗3次， 放入30%甘油-生理盐水(pH7.2)冷冻保护剂中，置4℃浸泡8～12h后，将标本装入样品杯，迅速浸入-196℃液氮中，移入日立HUS-5型真空喷镀仪，使用HFZ-1与FE-1冷冻复型与蚀刻装置，在真空度1×10-5 Toor与温度-100℃条件下将样品断裂蚀刻；然后往样品劈裂面喷镀铂-碳膜，再经腐蚀标本、清洗与捞膜等步骤制成复型膜；在Hu-12A型透射电镜75kV下观察并摄影。
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1.4 蛋白颗粒计数
为使计算结果准确可靠，取每份标本的5张照片统一放大5.5万倍，在5.5×5.5 cm2单位面积范围内，分别计算细胞膜劈裂面的EF面(即面向细胞质的那一面)与PF面(即面向细胞外隙的那一面)上之膜蛋白颗粒数，即1μm2单位面积的颗粒数。每份标本均由3人分别计数，取其平均值进行统计学处理。DMD患者组与正常对照组比较为成组数据比较，而PF面与EF面颗粒数比较属成对数据比较。
2 结果
电镜下见复型膜完整、面积大，污染少，图像清晰，立体感强，很少产生冰晶损伤。冷冻断裂后，其劈裂面均在细胞膜中的疏水端，镶嵌在膜内的蛋白颗粒，有的附于膜的外片即EF面，有的附在膜的内片即PF面。骨骼肌DMD组与正常对照组相比，其PF面和EF面的膜蛋白颗粒数均明显减少；正常组和DMD组的EF面膜蛋白颗粒数均比PF面少(图1～4)，上述结果的差异均有显著的统计学意义(P值分别<0.001～0.05)。红细胞的观察、统计结果与骨骼肌一致(图5～8)。
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1.正常对照样品PF面 2.DMD样品PF面 3.正常对照样品EF面 4.DMD样品EF面
图1～4 骨骼肌细胞冷冻蚀刻样品(×55000)
5.正常对照样品PF面 6.DMD样品PF面 7.正常对照样品EF面 8.DMD样品EF面
图5～8 红细胞冷冻蚀刻样品(×55000)
(注：示细胞膜内蛋白颗粒)
3 讨论
3.1 本技术在DMD诊断中的应用价值与特点
DMD是儿童中最常见的肌营养不良症，目前尚无特殊疗法，进一步阐明其发病机理可为指导临床治疗提供重要理论依据。Schotland[5](1977)和Shivers[6](1986)曾应用冷冻蚀刻技术对该病骨骼肌与红细胞进行研究，从分子水平证实DMD细胞膜存在结构异常。Shivers指出膜内颗粒计数是诊断DMD基因携带者的一种较快而精确的方法[6]。该技术不仅使组织细胞相对保持近于生活状态，而且可充分显示组织不同层次的结构，展示细胞的各种生物膜结构特点，已成为研究生物膜结构的重要方法之一。对该病骨骼肌与红细胞进行研究的结果表明两者细胞膜中的蛋白颗粒均明显减少，对阐明本病的“膜缺陷”学说提供了重要证据。由于DMD红细胞膜与肌细胞膜蛋白颗粒变化相似，且红细胞与肌内相比具有取材简便、快速、病人痛苦少、可重复等优点，故建立红细胞冷冻蚀刻技术，对诊断DMD患者及基因携带者，进一步开展优生优育有较大的实用价值。
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3.2 技术改进及操作要点
3.2.1 骨骼肌取材 肌活检部位应据临床检查和初步诊断结果而定，通常可根据肌电图检查结果选择中等程度损害的肌群，以确保能取得有病理价值的标本。活检时手法要轻巧细致，严禁直接钳夹、牵拉所需部位肌纤维束，以免造成机械损伤。活检肌组织经固定成型后，在解剖镜下要按与肌丝走向垂直的方向切成长条状，并在进行冷冻蚀刻时，将标本垂直装入样品杯中。这样才可保证冷冻断裂时是沿与肌丝基本平行的方向劈裂开，也即沿与梭形的肌细胞长轴平行的方向，在细胞膜中疏水端劈开，使观察到细胞膜劈裂面的机率大、成功率高。由于冷冻断裂是随机的，作者曾将标本长轴与肌丝平行的方向切成长方形小块，结果样品断裂时是沿与肌细胞长轴垂直的方向劈开，观察到细胞膜的机率很小，成功率极低。故骨骼肌取材的方向对实验研究能否成功有很大影响。
3.2.2 实验准备 影响冷冻蚀刻技术成功的因素很多，每一个小差错都可能引起实验失败。故在整个操作过程中，要求动作要快、稳且准确。实验前应充分做好准备工作，冷冻断裂装置等要用抛光膏把表面氧化层擦掉，再用丙酮擦洗干净，并连续抽真空3～5d，以保证实验时能快速达到高真空，减少产生冰晶的机会。
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3.2.3 复型膜制备 为了得到尽量大的复型膜，郑树林[7]从喷镀孔向带有复型膜的样品滴加火棉胶。但使用该法虽可得到完整复型膜，却易产生碳渣污染。针对存在问题，作者将样品杯从冷冻蚀刻装置中取出后，先放在白炽灯下烘烤10 min，使表明结霜熔化后，用尖细的滤纸条把复型膜周围带有许多铂碳渣的水分擦干净，但注意不要污染及损伤复型膜；再将样品杯烘烤10 min，使膜上水分蒸发干，往膜上滴一小滴0.8%火棉胶液，用滤纸条吸去多余液体；烘干后用细针把带有复型膜的组织从样品杯中小心挑出，按文献[7]进行腐蚀、清洗、捞膜、溶火棉胶等操作，制得大而干净的复型膜。■
(致谢：冷冻蚀刻技术承蒙河北医大电镜中心李向印、张玉英老师指导，谨致谢忱.)
参考文献：
[1]慕容慎行，姚宜卿，王 柠，等.进行性肌营养不良症的临床、组织化学和超微结构研究.临床神经病学杂志，1988，1(1)：17
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[2]吴翊钦，梁 平，钟秀容，等.Duchenne型肌营养不良症的冷冻断裂电镜观察.福建医学院学报，1994，28(3)：236
[3]吴翊钦，梁 平，钟秀容，等.Duchenne型肌营养不良症红细胞冷冻断裂电镜观察.电子显微学报，1998，17(1)：30
[4]李文镇.组织细胞冷冻复型电镜图谱.北京：人民卫生出版社，1981.6～9
[5]Schotland DL,Bonilla E,Meter MV.Duchenne dystrophy alteration in muscle plasma membrane structure.Science,1977,196:1005
[6]Shivers RR,Martin K,Atkinson BG.Detection of carriers of human Duchenne muscular dystrophy by freeze-frecture analysis of erythrocyte plasmale mmal intramembrane particles.Am J Clin Pathol,1986,85:131
[7]郑树森.一种避免冷冻蚀刻复型膜破碎的方法.中华物理医学杂志，1984,6(2)：113
收稿日期：1999-01-21, 百拇医药
单位：福建医科大学附属一院神经内科 350004 福州市
关键词：电镜冷冻蚀刻；肌营养不良；骨骼肌；红细胞；细胞膜
中国临床解剖学杂志000140摘 要：目的：探讨电镜冷冻蚀刻技术在Duchenne型肌营养不良症(DMD)研究中的应用。方法：电镜观察DMD及正常对照的骨骼肌和红细胞的冷冻蚀刻样品。结果：DMD患者红细胞与肌细胞一样，其细胞膜中的蛋白颗粒显著减少。结论：①冷冻蚀刻技术有助于DMD的诊断，其细胞膜存在缺陷；②可取红细胞代替肌组织进行诊断。
Application of freeze-etching electron microscopy in study of muscular dystophy
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Zhong Xiurong Chen Wenlei Chen Lianyun,et al.
Laboratory of Electron Microscopy,Fujian Medical University,Fuzhou 350004
Abstract：Objective:To explore the application of freeze-etching electrom microscopy in the study of Duchenne muscular dystrophy(DMD).Methods:The freeze-etching samples for skeletal muscles and erythrocytes of DMD and the normal skeletal muscles were observed under electron microscope.Results:The intramembrane proteinic particles of cell membranes of erythrocyte as well as of muscular cells were diminished significantly in DMD.Conclusions:Freeze-etching technique conduces to the diagnosis of DMD that has defect in cell membrane.The erythrocytes can be collected to substitute for the muscle in diagnosis of DMD.
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Key words：Freeze-etching electron microscopy Muscular dystrophy Skeletal muscle Erythrocyte Cell membrane▲
近年来，由于常规电镜技术的应用以及遗传学、生物化学、组织化学、酶学研究的迅速发展，对肌病的诊断有重大进展[1]。Duchenne型肌营养不良症(DMD)是一组由遗传因素所致的的X连锁隐性遗传病，越来越多的学者认为细胞膜的缺陷在本病中有重要地位。作者曾在国内首次应用电镜冷冻蚀刻技术对该病骨骼肌细胞膜及红细胞膜内的蛋白颗粒进行定量研究[2，3]，探讨其发病机理。本文就该技术的应用价值及其技术改进、操作要点予以介绍。
1 材料和方法
1.1 骨骼肌活检
选择具有典型临床特征与经实验诊断包括生化、肌电图、肌肉活检确诊为DMD的患者，根据病情选择肱二头肌或腓肠肌，将2%利多卡因注入皮下脂肪，局部麻醉深至肌筋膜外层，小心分离暴露出肌组织，切取2 mm×3 mm×4 mm长方形小块，迅速投入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定液(pH7.2)中，预固定0.5h成型后，再切成1 mm×1 mm×3 mm的小块保存于4℃固定液中。另取骨折手术的健康人骨骼肌标本，作为正常对照。
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1.2 红细胞取材
抽取DMD患者及正常供血员外周静脉血4 ml，迅速注入含有肝素抗凝剂的离心管中，2300r/min离心10 min后，弃上层的血浆及白细胞层，沿试管壁缓慢加入上述固定液，置4℃固定过夜，然后挑取上层固定成型的红细胞团切成长方形小块，保存于4℃固定液中备用。
1.3 冷冻蚀刻技术
分别将上述标本用0.1 mol/L PBS漂洗3次， 放入30%甘油-生理盐水(pH7.2)冷冻保护剂中，置4℃浸泡8～12h后，将标本装入样品杯，迅速浸入-196℃液氮中，移入日立HUS-5型真空喷镀仪，使用HFZ-1与FE-1冷冻复型与蚀刻装置，在真空度1×10-5 Toor与温度-100℃条件下将样品断裂蚀刻；然后往样品劈裂面喷镀铂-碳膜，再经腐蚀标本、清洗与捞膜等步骤制成复型膜；在Hu-12A型透射电镜75kV下观察并摄影。
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1.4 蛋白颗粒计数
为使计算结果准确可靠，取每份标本的5张照片统一放大5.5万倍，在5.5×5.5 cm2单位面积范围内，分别计算细胞膜劈裂面的EF面(即面向细胞质的那一面)与PF面(即面向细胞外隙的那一面)上之膜蛋白颗粒数，即1μm2单位面积的颗粒数。每份标本均由3人分别计数，取其平均值进行统计学处理。DMD患者组与正常对照组比较为成组数据比较，而PF面与EF面颗粒数比较属成对数据比较。
2 结果
电镜下见复型膜完整、面积大，污染少，图像清晰，立体感强，很少产生冰晶损伤。冷冻断裂后，其劈裂面均在细胞膜中的疏水端，镶嵌在膜内的蛋白颗粒，有的附于膜的外片即EF面，有的附在膜的内片即PF面。骨骼肌DMD组与正常对照组相比，其PF面和EF面的膜蛋白颗粒数均明显减少；正常组和DMD组的EF面膜蛋白颗粒数均比PF面少(图1～4)，上述结果的差异均有显著的统计学意义(P值分别<0.001～0.05)。红细胞的观察、统计结果与骨骼肌一致(图5～8)。
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1.正常对照样品PF面 2.DMD样品PF面 3.正常对照样品EF面 4.DMD样品EF面
图1～4 骨骼肌细胞冷冻蚀刻样品(×55000)
5.正常对照样品PF面 6.DMD样品PF面 7.正常对照样品EF面 8.DMD样品EF面
图5～8 红细胞冷冻蚀刻样品(×55000)
(注：示细胞膜内蛋白颗粒)
3 讨论
3.1 本技术在DMD诊断中的应用价值与特点
DMD是儿童中最常见的肌营养不良症，目前尚无特殊疗法，进一步阐明其发病机理可为指导临床治疗提供重要理论依据。Schotland[5](1977)和Shivers[6](1986)曾应用冷冻蚀刻技术对该病骨骼肌与红细胞进行研究，从分子水平证实DMD细胞膜存在结构异常。Shivers指出膜内颗粒计数是诊断DMD基因携带者的一种较快而精确的方法[6]。该技术不仅使组织细胞相对保持近于生活状态，而且可充分显示组织不同层次的结构，展示细胞的各种生物膜结构特点，已成为研究生物膜结构的重要方法之一。对该病骨骼肌与红细胞进行研究的结果表明两者细胞膜中的蛋白颗粒均明显减少，对阐明本病的“膜缺陷”学说提供了重要证据。由于DMD红细胞膜与肌细胞膜蛋白颗粒变化相似，且红细胞与肌内相比具有取材简便、快速、病人痛苦少、可重复等优点，故建立红细胞冷冻蚀刻技术，对诊断DMD患者及基因携带者，进一步开展优生优育有较大的实用价值。
, http://www.100md.com
3.2 技术改进及操作要点
3.2.1 骨骼肌取材 肌活检部位应据临床检查和初步诊断结果而定，通常可根据肌电图检查结果选择中等程度损害的肌群，以确保能取得有病理价值的标本。活检时手法要轻巧细致，严禁直接钳夹、牵拉所需部位肌纤维束，以免造成机械损伤。活检肌组织经固定成型后，在解剖镜下要按与肌丝走向垂直的方向切成长条状，并在进行冷冻蚀刻时，将标本垂直装入样品杯中。这样才可保证冷冻断裂时是沿与肌丝基本平行的方向劈裂开，也即沿与梭形的肌细胞长轴平行的方向，在细胞膜中疏水端劈开，使观察到细胞膜劈裂面的机率大、成功率高。由于冷冻断裂是随机的，作者曾将标本长轴与肌丝平行的方向切成长方形小块，结果样品断裂时是沿与肌细胞长轴垂直的方向劈开，观察到细胞膜的机率很小，成功率极低。故骨骼肌取材的方向对实验研究能否成功有很大影响。
3.2.2 实验准备 影响冷冻蚀刻技术成功的因素很多，每一个小差错都可能引起实验失败。故在整个操作过程中，要求动作要快、稳且准确。实验前应充分做好准备工作，冷冻断裂装置等要用抛光膏把表面氧化层擦掉，再用丙酮擦洗干净，并连续抽真空3～5d，以保证实验时能快速达到高真空，减少产生冰晶的机会。
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3.2.3 复型膜制备 为了得到尽量大的复型膜，郑树林[7]从喷镀孔向带有复型膜的样品滴加火棉胶。但使用该法虽可得到完整复型膜，却易产生碳渣污染。针对存在问题，作者将样品杯从冷冻蚀刻装置中取出后，先放在白炽灯下烘烤10 min，使表明结霜熔化后，用尖细的滤纸条把复型膜周围带有许多铂碳渣的水分擦干净，但注意不要污染及损伤复型膜；再将样品杯烘烤10 min，使膜上水分蒸发干，往膜上滴一小滴0.8%火棉胶液，用滤纸条吸去多余液体；烘干后用细针把带有复型膜的组织从样品杯中小心挑出，按文献[7]进行腐蚀、清洗、捞膜、溶火棉胶等操作，制得大而干净的复型膜。■
(致谢：冷冻蚀刻技术承蒙河北医大电镜中心李向印、张玉英老师指导，谨致谢忱.)
参考文献：
[1]慕容慎行，姚宜卿，王 柠，等.进行性肌营养不良症的临床、组织化学和超微结构研究.临床神经病学杂志，1988，1(1)：17
, http://www.100md.com
[2]吴翊钦，梁 平，钟秀容，等.Duchenne型肌营养不良症的冷冻断裂电镜观察.福建医学院学报，1994，28(3)：236
[3]吴翊钦，梁 平，钟秀容，等.Duchenne型肌营养不良症红细胞冷冻断裂电镜观察.电子显微学报，1998，17(1)：30
[4]李文镇.组织细胞冷冻复型电镜图谱.北京：人民卫生出版社，1981.6～9
[5]Schotland DL,Bonilla E,Meter MV.Duchenne dystrophy alteration in muscle plasma membrane structure.Science,1977,196:1005
[6]Shivers RR,Martin K,Atkinson BG.Detection of carriers of human Duchenne muscular dystrophy by freeze-frecture analysis of erythrocyte plasmale mmal intramembrane particles.Am J Clin Pathol,1986,85:131
[7]郑树森.一种避免冷冻蚀刻复型膜破碎的方法.中华物理医学杂志，1984,6(2)：113
收稿日期：1999-01-21, 百拇医药