骨粒羟基磷灰石加粘合剂植入后骨生长过程的实验研究
作者：施长友 崔功浩
单位：施长友(310004 杭州市 杭州卫生学校解剖学教研室)；崔功浩(浙江大学医学院解剖学教研室)
关键词：骨粒；羟基磷灰石；粘合剂
中国临床解剖学杂志000328 【摘 要】 目的：研究以骨粒羟基磷灰石为粉碎性骨折及骨肿瘤切除术后作为骨质缺损的填充和固定应用，提供科学依据。方法：将骨粒羟基磷灰石加粘合剂，填入钻孔后的兔胫骨孔内，每月一次，分四批处死兔子，取出填入处胫骨作组织学切片，观察新生骨形成过程。结果：发现单纯羟基磷灰石填入处的羟基磷灰石周围，形成紧密包裹的骨膜样组织，新生骨细胞不能长入到羟基磷灰石内；而加入骨粒后的羟基磷灰石的材料，能见到新生骨组织长入到羟基磷灰石内，形成网状结构与受体骨组织牢固紧密结合。结论：骨粒羟基磷灰石加粘合剂作为填充材料，能使骨粒吸收，新生骨组织通过被破坏、吸收的骨粒的通道长入新生骨，从而使受体骨组织和羟基磷灰石紧密牢固地结合在一起。
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Experimental studies on the bone development after the implantation of HA combined with bone granules
Shi Changyou,Cui Gonghao.
Department of Anatomy,Hangzhou Health School,Hangzhou 310004
Objective:To provide the scientific basis for the filling and repairing of the postoperative bone defect and comminuted fracture.Methods:Hydroxyapatite(HA)combined with bone granules and cement was implanted into the holes of rabbit tibias.The implanted parts of the tibias were observed with tissue slice technique at four monthly stages.Results:Periosteal tissues were formed around the HA implanted area which prevented the filtration of the osteoblast cell.When the bone granule and HA were implanted together,new bone tissue could be found in the HA,forming a network structure and combining tightly with the recipient’s bone tissues.Conclusion:When the bone granules were implanted into the hole of bone with HA together,they can be absorbed and from tunnels.The new bone tissue can develop along the tunnels and form a network,therefore combine with the implanted HA tightly.
, 百拇医药
Key words Bone granules HA Cement
本课题研究的人工骨材料为骨科粉碎性骨折及骨肿瘤切除后造成的骨质缺损时作为填充和固定应用。近几十年来国内外常用骨水泥作为骨质缺损后的填充材料。但许多文献报道表明，临床上应用的各种骨水泥，均不能保持长期的固定，后期骨面处松动、破裂率可高达10%～40%，因此目前很少应用。近年来多采用异体和自体植骨，但异体骨的供应有限，保存困难。因此许多学者均在寻求新的填充材料，和改进骨水泥方面的研究[1，2]，均取得一定的成果，但均不能达到理想的效果。为此，本研究采用骨粒和羟基磷灰石作为材料，再加入粘合剂使其迅速粘固作为填充材料，在兔胫骨处钻孔填充后动物分笼饲养，分四批处死，每月一批，取胫骨作切片检查，光镜下观察骨粒羟基磷灰石的内部结构，以及新生骨长入该材料内部的形态学演变过程。
1 材料和方法
1.1 骨粒的制备
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取人体股骨凿成碎片，清除软组织及骨髓，用5倍体积的100%乙醇浸泡1 h，乙醚浸泡30 min，在空气中干燥。将骨片磨成骨粒，过筛留取150～300 μm的骨粒，用清水冲洗2 h，再用5倍体积的100%乙醇浸泡1h， 乙醚浸泡30 min， 37℃恒温箱干燥，最后将骨粒装入安瓿，每瓿含5g骨粒，经消毒灭菌处理。在手术前和羟基磷灰石以1∶3重量混合待用。
1.2 立粘妥LENTTAL医用粘合剂
本研究应用的立粘妥LENI TAL医用粘合剂系广州白云医用胶总公司生产，批文号：国医械准字[94]第165005号，其主要成分为α-氰基丙烯酸异丁脂，在组织液、血液等带阴离子物质存在下迅速固化，其性能符合医用要求。本研究将立粘妥粘合剂与骨粒羟基磷灰石均匀混合后填入骨缺损处，在4～6 s便可牢固粘合。
1.3 动物实验
选择健康成年新西兰兔12只，重2.5～2.7 kg，以2%利多卡因3 ml局部皮下麻醉，在无菌条件下，切开胫骨上段内侧皮肤1.5 cm，暴露胫骨内上侧骨皮质，用斯氏针钻孔至骨髓腔，每侧钻1孔，直径3.5 mm，深5.0 mm的隧道，在手术中左侧填入按1：3重量骨粒和羟基磷灰石，右侧填入单纯羟基磷灰石，均在术中加入粘合剂。将孔封闭全层缝合包扎，动物分笼饲养4个月。每月分批处死3只。取出填有材料的胫骨上段标本，每侧取出一块，每块在低倍显微镜下切成2块约5 mm，供组织切片。
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1.4 组织学切片制作
将截取的材料经中性甲醛固定，乙醇逐级脱水，0.5N HCl脱钙3 h，37℃恒温干燥。用石腊包埋经HE染色切片，在显微镜下观察。
2 结果
观察发现在单纯羟基磷灰石材料表面形成骨膜样组织及异物巨细胞包裹，并无新生骨组织长入羟基磷灰石内(图A)，与骨粒羟基磷灰石的实验结果相比，在形态结构上有较大差异。观察加入骨粒后羟基磷灰石内不同时期的演变过程：(1)术后1个月时在光镜下可见骨膜样组织包围填入骨粒羟基磷灰石周围，并将骨粒逐渐吸收；(2)术后2个月时可见骨粒被吸收形成通道，并有结缔组织长入；(3)术后3个月时可见骨膜细胞包裹羟基磷灰石周围，骨粒被吸收有胶原纤维长入，出现大量破骨细胞及少量骨母细胞(图B)；(4)术后4个月时骨母细胞长入羟基磷灰石骨内，骨粒被破骨细胞破坏、吸收，骨母细胞及胶原纤维形成网状、 并相互连结，使新生骨组织、羟基磷灰石和受体骨组织紧密、牢固地结合成为一整体结构(图C)。
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1 羟基磷灰石 2 骨膜样细胞 3 骨粒被吸收后胶原
纤维长入量 4 纤维结缔组织 5 破骨细胞
6 骨母细胞 7 残余骨基质
图A 羟基磷灰石植入后3个月，在羟基磷灰石周围有骨膜细胞包裹，其内未见新生骨组织长入 ×100
图B 骨粒羟基磷灰石植入后2个月时，植入骨粒逐渐被吸收，形成通道内有结缔组织及破骨细胞长入×100
图C 骨粒羟基磷灰石植入后4个月，被吸收的骨粒周围
出现较多的破骨细胞及骨母细胞 ×200
3 讨论
3.1 填入材料后的异变过程
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本研究系骨粒、羟基磷灰石加立粘妥粘合剂混合后作为填充材料，填入兔胫骨内，每月处死兔子后取出该处骨块，作石腊包埋切片经HE染色，在显微镜下观察可见1、2个月时填充的骨粒逐渐被破坏、吸收形成通道，内有大量胶原纤维组织及结缔组织充填在通道内，并在羟基磷灰石周围出现骨膜细胞及破骨细胞。当第3、4个月时，在羟基磷灰石周围出现成纤维细胞、胶原纤维、骨膜细胞及骨细胞，并充填在羟基磷灰石之间。说明羟基磷灰石植入后2个月内首先是骨粒被吸收形成通道，内有结缔组织生长。3个月以后在羟基磷灰石周围及通道内出现成纤维细胞、骨膜细胞及骨细胞，说明此时骨组织逐渐形成。这样，受体骨、羟基磷灰石及新生骨组织就构成一个牢固的整体。同时，有机骨粒内的某些成份如骨生长因子等，能促使上皮细胞分化形成骨细胞[3]。采用羟基磷灰石作为骨的填充材料，是由于羟基磷灰石有较好的生物相容性，增加了羟基磷灰石—骨界面的剪切强度，但新生的骨组织均未能长入羟基磷灰石内部，只能获得机械性固定作用。
3.2 羟基磷灰石的性能
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羟基磷灰石有较好的生物相容性，其与人体无机盐中的羟基磷灰石成分相同，无抗原性不含有机质。经半定量分光摄谱仪分析，除了Ca、P以外，还含有Mg、Si、Sr、Ni、Na等元素，经高温、高压灭菌，与人体组织高度相容，把它植入体内能构成骨的基本成分。经动物实验和临床应用的生物学和组织学观察证明，羟基磷灰石所引起的正常生理过程无明显改变，无炎症反应，无异物巨细胞，无排斥反应，能长期共存，表现出良好的生物相容性能，完全符合作为骨填充材料的基本条件[4]，因此本研究采用该材料为填充剂。
Hoogen[5]等认为羟基磷灰石晶体能刺激骨细胞，使其围绕羟基磷灰石颗粒增生，并以其为中心形成成骨区。在骨盐的沉积过程中，羟基磷灰石晶核加速钙化成骨，使新骨与羟基磷灰石紧密融合。
我们曾在2例骨肿瘤病患者作骨肿瘤切除术时，应用骨粒羟基磷灰石加立粘妥粘合剂为填充材料。临床医师认为该材料能迅速牢固粘合，效果良好。
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参考文献
1，裘世静，戴克戎，董 凡，等.有面骨粒骨水泥内部形成的扫描电镜观察.中华骨科杂志，1991，11(5)：369
2，戴克戎，裘世静，王 友，等.无机骨粒骨水泥植入后骨生成过程的实验观察.中华外科杂志，1992，30(10)：588
3，朱建民.细胞因子及其骨作用机制.中华创伤杂志，1993，9(6)：369
4，Holmes RE.Bone regeneration within a coralline hydoxypatite implant.Plast Reconstr Surg,1979,63:626
5，Hoogen,Doorn HA,et al.Congterm study of large ceramic implants in dog temora.Clin orthorp,1984,181:281
(收稿：1999-09-21), 百拇医药
单位：施长友(310004 杭州市 杭州卫生学校解剖学教研室)；崔功浩(浙江大学医学院解剖学教研室)
关键词：骨粒；羟基磷灰石；粘合剂
中国临床解剖学杂志000328 【摘 要】 目的：研究以骨粒羟基磷灰石为粉碎性骨折及骨肿瘤切除术后作为骨质缺损的填充和固定应用，提供科学依据。方法：将骨粒羟基磷灰石加粘合剂，填入钻孔后的兔胫骨孔内，每月一次，分四批处死兔子，取出填入处胫骨作组织学切片，观察新生骨形成过程。结果：发现单纯羟基磷灰石填入处的羟基磷灰石周围，形成紧密包裹的骨膜样组织，新生骨细胞不能长入到羟基磷灰石内；而加入骨粒后的羟基磷灰石的材料，能见到新生骨组织长入到羟基磷灰石内，形成网状结构与受体骨组织牢固紧密结合。结论：骨粒羟基磷灰石加粘合剂作为填充材料，能使骨粒吸收，新生骨组织通过被破坏、吸收的骨粒的通道长入新生骨，从而使受体骨组织和羟基磷灰石紧密牢固地结合在一起。
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Experimental studies on the bone development after the implantation of HA combined with bone granules
Shi Changyou,Cui Gonghao.
Department of Anatomy,Hangzhou Health School,Hangzhou 310004
Objective:To provide the scientific basis for the filling and repairing of the postoperative bone defect and comminuted fracture.Methods:Hydroxyapatite(HA)combined with bone granules and cement was implanted into the holes of rabbit tibias.The implanted parts of the tibias were observed with tissue slice technique at four monthly stages.Results:Periosteal tissues were formed around the HA implanted area which prevented the filtration of the osteoblast cell.When the bone granule and HA were implanted together,new bone tissue could be found in the HA,forming a network structure and combining tightly with the recipient’s bone tissues.Conclusion:When the bone granules were implanted into the hole of bone with HA together,they can be absorbed and from tunnels.The new bone tissue can develop along the tunnels and form a network,therefore combine with the implanted HA tightly.
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Key words Bone granules HA Cement
本课题研究的人工骨材料为骨科粉碎性骨折及骨肿瘤切除后造成的骨质缺损时作为填充和固定应用。近几十年来国内外常用骨水泥作为骨质缺损后的填充材料。但许多文献报道表明，临床上应用的各种骨水泥，均不能保持长期的固定，后期骨面处松动、破裂率可高达10%～40%，因此目前很少应用。近年来多采用异体和自体植骨，但异体骨的供应有限，保存困难。因此许多学者均在寻求新的填充材料，和改进骨水泥方面的研究[1，2]，均取得一定的成果，但均不能达到理想的效果。为此，本研究采用骨粒和羟基磷灰石作为材料，再加入粘合剂使其迅速粘固作为填充材料，在兔胫骨处钻孔填充后动物分笼饲养，分四批处死，每月一批，取胫骨作切片检查，光镜下观察骨粒羟基磷灰石的内部结构，以及新生骨长入该材料内部的形态学演变过程。
1 材料和方法
1.1 骨粒的制备
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取人体股骨凿成碎片，清除软组织及骨髓，用5倍体积的100%乙醇浸泡1 h，乙醚浸泡30 min，在空气中干燥。将骨片磨成骨粒，过筛留取150～300 μm的骨粒，用清水冲洗2 h，再用5倍体积的100%乙醇浸泡1h， 乙醚浸泡30 min， 37℃恒温箱干燥，最后将骨粒装入安瓿，每瓿含5g骨粒，经消毒灭菌处理。在手术前和羟基磷灰石以1∶3重量混合待用。
1.2 立粘妥LENTTAL医用粘合剂
本研究应用的立粘妥LENI TAL医用粘合剂系广州白云医用胶总公司生产，批文号：国医械准字[94]第165005号，其主要成分为α-氰基丙烯酸异丁脂，在组织液、血液等带阴离子物质存在下迅速固化，其性能符合医用要求。本研究将立粘妥粘合剂与骨粒羟基磷灰石均匀混合后填入骨缺损处，在4～6 s便可牢固粘合。
1.3 动物实验
选择健康成年新西兰兔12只，重2.5～2.7 kg，以2%利多卡因3 ml局部皮下麻醉，在无菌条件下，切开胫骨上段内侧皮肤1.5 cm，暴露胫骨内上侧骨皮质，用斯氏针钻孔至骨髓腔，每侧钻1孔，直径3.5 mm，深5.0 mm的隧道，在手术中左侧填入按1：3重量骨粒和羟基磷灰石，右侧填入单纯羟基磷灰石，均在术中加入粘合剂。将孔封闭全层缝合包扎，动物分笼饲养4个月。每月分批处死3只。取出填有材料的胫骨上段标本，每侧取出一块，每块在低倍显微镜下切成2块约5 mm，供组织切片。
, 百拇医药
1.4 组织学切片制作
将截取的材料经中性甲醛固定，乙醇逐级脱水，0.5N HCl脱钙3 h，37℃恒温干燥。用石腊包埋经HE染色切片，在显微镜下观察。
2 结果
观察发现在单纯羟基磷灰石材料表面形成骨膜样组织及异物巨细胞包裹，并无新生骨组织长入羟基磷灰石内(图A)，与骨粒羟基磷灰石的实验结果相比，在形态结构上有较大差异。观察加入骨粒后羟基磷灰石内不同时期的演变过程：(1)术后1个月时在光镜下可见骨膜样组织包围填入骨粒羟基磷灰石周围，并将骨粒逐渐吸收；(2)术后2个月时可见骨粒被吸收形成通道，并有结缔组织长入；(3)术后3个月时可见骨膜细胞包裹羟基磷灰石周围，骨粒被吸收有胶原纤维长入，出现大量破骨细胞及少量骨母细胞(图B)；(4)术后4个月时骨母细胞长入羟基磷灰石骨内，骨粒被破骨细胞破坏、吸收，骨母细胞及胶原纤维形成网状、 并相互连结，使新生骨组织、羟基磷灰石和受体骨组织紧密、牢固地结合成为一整体结构(图C)。
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1 羟基磷灰石 2 骨膜样细胞 3 骨粒被吸收后胶原
纤维长入量 4 纤维结缔组织 5 破骨细胞
6 骨母细胞 7 残余骨基质
图A 羟基磷灰石植入后3个月，在羟基磷灰石周围有骨膜细胞包裹，其内未见新生骨组织长入 ×100
图B 骨粒羟基磷灰石植入后2个月时，植入骨粒逐渐被吸收，形成通道内有结缔组织及破骨细胞长入×100
图C 骨粒羟基磷灰石植入后4个月，被吸收的骨粒周围
出现较多的破骨细胞及骨母细胞 ×200
3 讨论
3.1 填入材料后的异变过程
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本研究系骨粒、羟基磷灰石加立粘妥粘合剂混合后作为填充材料，填入兔胫骨内，每月处死兔子后取出该处骨块，作石腊包埋切片经HE染色，在显微镜下观察可见1、2个月时填充的骨粒逐渐被破坏、吸收形成通道，内有大量胶原纤维组织及结缔组织充填在通道内，并在羟基磷灰石周围出现骨膜细胞及破骨细胞。当第3、4个月时，在羟基磷灰石周围出现成纤维细胞、胶原纤维、骨膜细胞及骨细胞，并充填在羟基磷灰石之间。说明羟基磷灰石植入后2个月内首先是骨粒被吸收形成通道，内有结缔组织生长。3个月以后在羟基磷灰石周围及通道内出现成纤维细胞、骨膜细胞及骨细胞，说明此时骨组织逐渐形成。这样，受体骨、羟基磷灰石及新生骨组织就构成一个牢固的整体。同时，有机骨粒内的某些成份如骨生长因子等，能促使上皮细胞分化形成骨细胞[3]。采用羟基磷灰石作为骨的填充材料，是由于羟基磷灰石有较好的生物相容性，增加了羟基磷灰石—骨界面的剪切强度，但新生的骨组织均未能长入羟基磷灰石内部，只能获得机械性固定作用。
3.2 羟基磷灰石的性能
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羟基磷灰石有较好的生物相容性，其与人体无机盐中的羟基磷灰石成分相同，无抗原性不含有机质。经半定量分光摄谱仪分析，除了Ca、P以外，还含有Mg、Si、Sr、Ni、Na等元素，经高温、高压灭菌，与人体组织高度相容，把它植入体内能构成骨的基本成分。经动物实验和临床应用的生物学和组织学观察证明，羟基磷灰石所引起的正常生理过程无明显改变，无炎症反应，无异物巨细胞，无排斥反应，能长期共存，表现出良好的生物相容性能，完全符合作为骨填充材料的基本条件[4]，因此本研究采用该材料为填充剂。
Hoogen[5]等认为羟基磷灰石晶体能刺激骨细胞，使其围绕羟基磷灰石颗粒增生，并以其为中心形成成骨区。在骨盐的沉积过程中，羟基磷灰石晶核加速钙化成骨，使新骨与羟基磷灰石紧密融合。
我们曾在2例骨肿瘤病患者作骨肿瘤切除术时，应用骨粒羟基磷灰石加立粘妥粘合剂为填充材料。临床医师认为该材料能迅速牢固粘合，效果良好。
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参考文献
1，裘世静，戴克戎，董 凡，等.有面骨粒骨水泥内部形成的扫描电镜观察.中华骨科杂志，1991，11(5)：369
2，戴克戎，裘世静，王 友，等.无机骨粒骨水泥植入后骨生成过程的实验观察.中华外科杂志，1992，30(10)：588
3，朱建民.细胞因子及其骨作用机制.中华创伤杂志，1993，9(6)：369
4，Holmes RE.Bone regeneration within a coralline hydoxypatite implant.Plast Reconstr Surg,1979,63:626
5，Hoogen,Doorn HA,et al.Congterm study of large ceramic implants in dog temora.Clin orthorp,1984,181:281
(收稿：1999-09-21), 百拇医药