人骨形态发生蛋白-2完整成熟肽基因的克隆
作者：熊绍虎 刘大庸 余磊 蒋立新 王朝阳
单位：熊绍虎(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)；刘大庸(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)；余磊(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)；蒋立新(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)；王朝阳(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)
关键词：骨形态发生蛋白-2；基因；克隆
中国临床解剖学杂志000325 【摘 要】 目的：克隆人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)完整成熟肽基因。方法：依据Genbank中hBMP-2的序列化学合成两条引物，从人胎儿骨组织中提取得到的总RNA中，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到hBMP-2完整成熟肽基因。将所得的基因片段插入克隆载体pUC-19并转化大肠杆菌JM109，提取重组质粒，酶切鉴定并测序。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳显示：PCR产物为一长约400 bp的带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约400bp的片段。全自动DNA测序表明与Genbank中的序列完全相符。结论：通过反转录聚合酶链式反应从人胎儿骨组织中成功地克隆了人BMP-2完整成熟肽基因，基因序列完全正确。
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【关键词】
The cloning of integral human BMP-2 mature peptide gene.
Xiong Shaohu, Liu Dayong, Yu lei, et al.
Department of Anatomy, The First Military Medical University, Guangzhou 510515
Objective: To clone integral human bone morphogenetic protein-2(BMP-2) mature peptide gene. Methods: Two primers were chemosynthesized according to the hBMP-2 sequence reported in Genbank. The hBMP-2 gene was gained by RT-PCR from the cDNA which was extracted from human fetus bone tissue, and was cloned into vector pUC-19. The seqence of recombinanted plasmid pUC-19-hBMP-2 was analyzed by sequence analysis. Results: DNA agarose gel electrophoresis showed that the product of RT-PCR was about 400bp, and double enzyme digestion of the recombinanted plasmid corresponded with it. The result of sequence assay was in agreement with the reported hBMP-2 sequence in Genbank. Conclusion: The integral human BMP-2 mature peptide gene was cloned successfully, and totally identified with the sequence of human BMP-2 in Genbank.
, 百拇医药
Keywords Bone morphogenetic protein-2 Gene Clone
骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)是一种具有诱导成骨活性的酸性糖蛋白，其中以BMP-2的活性最强[1]。BMP-2在组织中含量较微，每千克皮质骨仅含1～2μg[2]，因而利用基因工程重组BMP-2成为必需，并已取得较好成果。国外较多采用真核细胞表达，如CHO，COS及杆状病毒系统，亦有其完整成熟肽在大肠杆菌中表达的报道[3,4]。国内多采用原核细胞表达，但多为人骨形态发生蛋白-2成熟肽的不同长短的片段[5,6]。本文以人胎儿骨组织为材料提取cDNA，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，成功克隆hBMP-2完整成熟肽基因，为其进一步在大肠杆菌中表达打下基础。
1 材料与方法
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1.1 材料
①引产人胎儿骨组织;②质粒与菌株：克隆载体pUC-19由王朝阳硕士惠赠，JM109菌株由吴振龙硕士惠赠;③主要试剂： Trizol、反转录酶AMV、EX-Taq酶、限制性核酸内切酶KpnI、PstI及T4 DNA连接酶分别为Gibco、日本TaKaRa和NEB产品，其他为国产分析纯。
1. 2 方法
1.2.1 引物设计 从Genbank检索hBMP-2成熟肽基因，由徐兵博士设计两段引物。5′端加上Met+Ala序列、KpnI酶切序列及保护序列，构成上游引物；3′端加上PstI酶切序列及保护序列，构成下游引物。引物经GOLDKEY软件检验，无发夹结构。序列如下：
上游引物：5′-CGGGGTACCATGAAT-CAAGCCAAACACAAACAGCGG，划线为KpnI 酶切序列；
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下游引物：5′-AAACTGCAGTTA-CTAGCGACACCCACAACCCTC，划线为PstI酶切序列。
引物由宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa Biotech)合成。
1.2.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) ①提取总RNA 液氮保存引产人胎儿骨组织经研钵研碎、组织匀浆器制成匀浆后按Trizol Reagent说明书进行；②反转录：反应体系20 μl，其中RNA液5 μl，3端引物100 pMol，AMV酶1 μl(5U)。室温10 min后42℃保温1 h，冰浴2 min；③聚合酶链式反应：反应体系为 50 μl，其中cDNA 5μl，引物100 pMol。反应如下：预变性94℃，10 min，加入Taq酶5U(即采用热启动技术[8])。变性94 ℃，60 s；退火Tm 65℃，40 s；延伸72℃，60 s。30循环。
1.2.3 克隆载体的构建 ①DNA回收、酶切：挖块-冻融法回收DNA，用KpnI、PstI双酶切；②连接：经KpnI、PstI双酶切后的pUC-19及目的基因片段，用T4 DNA连接酶，于16℃连接15 h。
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1.2.4 阳性克隆的筛选 ①感受态细胞制备及转化参照《分子克隆》[9]；②筛选克隆 取上述菌液涂IPTG-X-gal LB平板(Amp100μg/ml)，37℃电热培养箱倒置培养。随机挑取白色菌落10个于5 ml LB(Amp100μg/ml)培养基，37℃摇床，过夜。碱裂解法提取质粒，KpnI、PstI双酶切，1.5%琼脂糖电泳鉴定。
1.2.5 序列测定 由宝生物工程(大连)有限公司完成。
2 结果
2.1 RT-PCR结果
RT-PCR样品做DNA琼脂糖(1.5%)电泳，长波紫外光下与100bp ladder Marker相比较，在400 bp稍下方见一条带，与所要之DNA片段372 bp相符(见附图)。
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①100bp ladder marker ②pUC-19/KpnI+PstI
③target gene /KpnI+PstI ④pUC19-hBMP-2/KpnI+PstI
⑤RT-PCR product ⑥λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ
附图 RT-PCR产物及重组pUC19-hBMP-2的酶切鉴定
2. 2 克隆筛选结果
阳性克隆提取质粒经KpnI、PstI双酶切后在DNA琼脂糖电泳凝胶上显示两条带，分别与对照相吻合(见附图)。
2. 3 测序结果
测序结果显示所得目的基因的序列与从Genbank所检索到的序列完全吻合。
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3 讨论
3.1 人BMP-2的基因克隆及基因表达
1988年，Wozney等[10]首先从人U-20s细胞等cDNA文库中成功克隆了人BMP-2。BMP-2 cDNA全长为1587 bp，ORF(Open reading frames)1188bp，编码为396个氨基酸的多肽，包括N端的信号肽，中间的前肽及C端的成熟肽。翻译后的前体蛋白经进一步加工修饰，包括切掉信号肽及前肽后，得到成熟的人BMP-2成熟肽。BMP-2在组织中含量很少，故而关于其在原核及真核细胞中表达的研究遂成热点。由于BMP-2在真核细胞中的表达量较低且耗时耗资。人们开始研究其在原核细胞中的表达。1994年，赵明等[5]用限制性内切酶AFL-Ⅱ切取编码hBMP-2成熟肽的0.36kb基因片段并克隆于E.Coli表达载体pMX-1中，温度诱导表达，重组产物具有较强诱骨活性。E.Coli中表达的rhBMP-2(recombinanted human BMP-2)因成骨活性较理想，其表达以包涵体形式存在， 易于纯化， 相对产量较高， 花费低廉而受到青睐。此后，有报道将编码hBMP-2羧基端不同长短的氨基酸肽段的hBMP-2 cDNA放入E.Coli中表达，具有不同程度的成骨活性，且愈接近成熟肽长度活性愈高[6]。因此，克隆其全长成为必需。本文成功地克隆了完整人BMP-2成熟肽基因，为其在大肠杆菌中地进一步表达打下基础。
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3.2 RT-PCR条件的选择
PCR技术自80年代发展至今日趋完善。在常规的PCR体系中，能有效扩增小片段，通常扩增小于1kb的片段，都能得到满意的结果。RT-PCR较传统PCR，仅需增加一步反转录，操作简便，不需特殊设备。本文采用的方法则更简便，只须提取总RNA即可，无须再提取mRNA，更不需要建cDNA文库，仅须RT-PCR一步即可从特定组织中成功克隆目的基因。该方法简便而可靠，为基因的克隆提供了一种快捷的方法。
有研究表明，在胚胎期和成年期的某些组织器官中都有BMP-2 mRNA的表达，其中以骨组织中的mRNA丰度最高，而其他组织细胞如心、肝、脑、肺和肾脏，虽有BMP-2 mRNA转录物的产生，但其水平均不高[5]。故而在我们的实验中选择了以人胎儿骨组织为材料提取总RNA。在PCR反应的条件中，引物的特异性是特异性扩增的基础。我们通过检索Genbank，确定了hBMP-2成熟肽的基因序列，以指导设计特异性的引物。一般而言，如果把PCR 混合物在显著低于Tm 值的温度下哪怕是作简短的保温，也可能产生引物二聚体和非特异配对。在本实验中，PCR 的两段引物存在引物二聚体，但因其为基因本身所固有，故而未予改动，而是采用热启动技术[8]即预变性后加入Taq酶，很好地解决了这个问题。测序结果也证明了这一点。再者，引物浓度过高，也可引起非特异性扩增。我们在实验中选择较低浓度的引物浓度(100pmol)[11]以消除非特异性片段的扩增。
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(研究用的标本材料得到秦立君和王燕两位医师帮助，表示衷心的感谢!)
参考文献
1，Tabas JA, Zasloff M, Wasmuth JJ, et al. Human bone morphogenetic protein-2:chromosomal localization of human gene for BMP-1,BMP-2A and BMP-3.Genomics，1991，9:283
2，Riley EH, Lane JM, Urist MR,et al. Bone morphogenetic protein-2:Biology and application .Clin Orthop Rel Res，1996，324:39
3，Ruppert R,Hoffmann E,Sebald W. Human bone morphogenetic protein -2 contains a heparin binding site. Which modifies its biological activity. Eur J Biochem，1996，237:295
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4，Kubler NR , Reuther JF ,Faller G, et al. Inductive of recombinant human BMP-2 produced in a bacterial expression system. Int J Oral Maxillofac Surg，1998，27:305
5，赵 明，王会信，周廷冲.重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性.生物化学杂志，1994，10(2)：318
6，林 松，徐印钦，李伯良.人骨形成蛋白-2A活性片段的E.Coli中高效表达.生物化学与生物物理学报，1996，28(1)：8
7，蒲 勤，陈苏民，陈南春. 重组人骨形成蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达.第四军医大学学报，1998，19(1)：8
8，Diefferbach CW, Dveksler GS. PCR Primer(A Laboratory Manual) .New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.39
9，J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇. 分子克隆实验指南. 第2版. 北京：科学出版社，1992.55
10，Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et al. Novel regulators of bone formation: Molecular clones and activities.Science,1988，242:1528
11，卢圣栋，主编. 现代分子生物学实验技术.第2版.北京：中国协和医科大学出版社，1999.460
(收稿：1999-08-02), http://www.100md.com
单位：熊绍虎(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)；刘大庸(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)；余磊(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)；蒋立新(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)；王朝阳(510515 广州市 第一军医大学解剖学教研室)
关键词：骨形态发生蛋白-2；基因；克隆
中国临床解剖学杂志000325 【摘 要】 目的：克隆人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)完整成熟肽基因。方法：依据Genbank中hBMP-2的序列化学合成两条引物，从人胎儿骨组织中提取得到的总RNA中，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到hBMP-2完整成熟肽基因。将所得的基因片段插入克隆载体pUC-19并转化大肠杆菌JM109，提取重组质粒，酶切鉴定并测序。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳显示：PCR产物为一长约400 bp的带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约400bp的片段。全自动DNA测序表明与Genbank中的序列完全相符。结论：通过反转录聚合酶链式反应从人胎儿骨组织中成功地克隆了人BMP-2完整成熟肽基因，基因序列完全正确。
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【关键词】
The cloning of integral human BMP-2 mature peptide gene.
Xiong Shaohu, Liu Dayong, Yu lei, et al.
Department of Anatomy, The First Military Medical University, Guangzhou 510515
Objective: To clone integral human bone morphogenetic protein-2(BMP-2) mature peptide gene. Methods: Two primers were chemosynthesized according to the hBMP-2 sequence reported in Genbank. The hBMP-2 gene was gained by RT-PCR from the cDNA which was extracted from human fetus bone tissue, and was cloned into vector pUC-19. The seqence of recombinanted plasmid pUC-19-hBMP-2 was analyzed by sequence analysis. Results: DNA agarose gel electrophoresis showed that the product of RT-PCR was about 400bp, and double enzyme digestion of the recombinanted plasmid corresponded with it. The result of sequence assay was in agreement with the reported hBMP-2 sequence in Genbank. Conclusion: The integral human BMP-2 mature peptide gene was cloned successfully, and totally identified with the sequence of human BMP-2 in Genbank.
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Keywords Bone morphogenetic protein-2 Gene Clone
骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)是一种具有诱导成骨活性的酸性糖蛋白，其中以BMP-2的活性最强[1]。BMP-2在组织中含量较微，每千克皮质骨仅含1～2μg[2]，因而利用基因工程重组BMP-2成为必需，并已取得较好成果。国外较多采用真核细胞表达，如CHO，COS及杆状病毒系统，亦有其完整成熟肽在大肠杆菌中表达的报道[3,4]。国内多采用原核细胞表达，但多为人骨形态发生蛋白-2成熟肽的不同长短的片段[5,6]。本文以人胎儿骨组织为材料提取cDNA，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，成功克隆hBMP-2完整成熟肽基因，为其进一步在大肠杆菌中表达打下基础。
1 材料与方法
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1.1 材料
①引产人胎儿骨组织;②质粒与菌株：克隆载体pUC-19由王朝阳硕士惠赠，JM109菌株由吴振龙硕士惠赠;③主要试剂： Trizol、反转录酶AMV、EX-Taq酶、限制性核酸内切酶KpnI、PstI及T4 DNA连接酶分别为Gibco、日本TaKaRa和NEB产品，其他为国产分析纯。
1. 2 方法
1.2.1 引物设计 从Genbank检索hBMP-2成熟肽基因，由徐兵博士设计两段引物。5′端加上Met+Ala序列、KpnI酶切序列及保护序列，构成上游引物；3′端加上PstI酶切序列及保护序列，构成下游引物。引物经GOLDKEY软件检验，无发夹结构。序列如下：
上游引物：5′-CGGGGTACCATGAAT-CAAGCCAAACACAAACAGCGG，划线为KpnI 酶切序列；
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下游引物：5′-AAACTGCAGTTA-CTAGCGACACCCACAACCCTC，划线为PstI酶切序列。
引物由宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa Biotech)合成。
1.2.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) ①提取总RNA 液氮保存引产人胎儿骨组织经研钵研碎、组织匀浆器制成匀浆后按Trizol Reagent说明书进行；②反转录：反应体系20 μl，其中RNA液5 μl，3端引物100 pMol，AMV酶1 μl(5U)。室温10 min后42℃保温1 h，冰浴2 min；③聚合酶链式反应：反应体系为 50 μl，其中cDNA 5μl，引物100 pMol。反应如下：预变性94℃，10 min，加入Taq酶5U(即采用热启动技术[8])。变性94 ℃，60 s；退火Tm 65℃，40 s；延伸72℃，60 s。30循环。
1.2.3 克隆载体的构建 ①DNA回收、酶切：挖块-冻融法回收DNA，用KpnI、PstI双酶切；②连接：经KpnI、PstI双酶切后的pUC-19及目的基因片段，用T4 DNA连接酶，于16℃连接15 h。
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1.2.4 阳性克隆的筛选 ①感受态细胞制备及转化参照《分子克隆》[9]；②筛选克隆 取上述菌液涂IPTG-X-gal LB平板(Amp100μg/ml)，37℃电热培养箱倒置培养。随机挑取白色菌落10个于5 ml LB(Amp100μg/ml)培养基，37℃摇床，过夜。碱裂解法提取质粒，KpnI、PstI双酶切，1.5%琼脂糖电泳鉴定。
1.2.5 序列测定 由宝生物工程(大连)有限公司完成。
2 结果
2.1 RT-PCR结果
RT-PCR样品做DNA琼脂糖(1.5%)电泳，长波紫外光下与100bp ladder Marker相比较，在400 bp稍下方见一条带，与所要之DNA片段372 bp相符(见附图)。
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①100bp ladder marker ②pUC-19/KpnI+PstI
③target gene /KpnI+PstI ④pUC19-hBMP-2/KpnI+PstI
⑤RT-PCR product ⑥λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ
附图 RT-PCR产物及重组pUC19-hBMP-2的酶切鉴定
2. 2 克隆筛选结果
阳性克隆提取质粒经KpnI、PstI双酶切后在DNA琼脂糖电泳凝胶上显示两条带，分别与对照相吻合(见附图)。
2. 3 测序结果
测序结果显示所得目的基因的序列与从Genbank所检索到的序列完全吻合。
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3 讨论
3.1 人BMP-2的基因克隆及基因表达
1988年，Wozney等[10]首先从人U-20s细胞等cDNA文库中成功克隆了人BMP-2。BMP-2 cDNA全长为1587 bp，ORF(Open reading frames)1188bp，编码为396个氨基酸的多肽，包括N端的信号肽，中间的前肽及C端的成熟肽。翻译后的前体蛋白经进一步加工修饰，包括切掉信号肽及前肽后，得到成熟的人BMP-2成熟肽。BMP-2在组织中含量很少，故而关于其在原核及真核细胞中表达的研究遂成热点。由于BMP-2在真核细胞中的表达量较低且耗时耗资。人们开始研究其在原核细胞中的表达。1994年，赵明等[5]用限制性内切酶AFL-Ⅱ切取编码hBMP-2成熟肽的0.36kb基因片段并克隆于E.Coli表达载体pMX-1中，温度诱导表达，重组产物具有较强诱骨活性。E.Coli中表达的rhBMP-2(recombinanted human BMP-2)因成骨活性较理想，其表达以包涵体形式存在， 易于纯化， 相对产量较高， 花费低廉而受到青睐。此后，有报道将编码hBMP-2羧基端不同长短的氨基酸肽段的hBMP-2 cDNA放入E.Coli中表达，具有不同程度的成骨活性，且愈接近成熟肽长度活性愈高[6]。因此，克隆其全长成为必需。本文成功地克隆了完整人BMP-2成熟肽基因，为其在大肠杆菌中地进一步表达打下基础。
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3.2 RT-PCR条件的选择
PCR技术自80年代发展至今日趋完善。在常规的PCR体系中，能有效扩增小片段，通常扩增小于1kb的片段，都能得到满意的结果。RT-PCR较传统PCR，仅需增加一步反转录，操作简便，不需特殊设备。本文采用的方法则更简便，只须提取总RNA即可，无须再提取mRNA，更不需要建cDNA文库，仅须RT-PCR一步即可从特定组织中成功克隆目的基因。该方法简便而可靠，为基因的克隆提供了一种快捷的方法。
有研究表明，在胚胎期和成年期的某些组织器官中都有BMP-2 mRNA的表达，其中以骨组织中的mRNA丰度最高，而其他组织细胞如心、肝、脑、肺和肾脏，虽有BMP-2 mRNA转录物的产生，但其水平均不高[5]。故而在我们的实验中选择了以人胎儿骨组织为材料提取总RNA。在PCR反应的条件中，引物的特异性是特异性扩增的基础。我们通过检索Genbank，确定了hBMP-2成熟肽的基因序列，以指导设计特异性的引物。一般而言，如果把PCR 混合物在显著低于Tm 值的温度下哪怕是作简短的保温，也可能产生引物二聚体和非特异配对。在本实验中，PCR 的两段引物存在引物二聚体，但因其为基因本身所固有，故而未予改动，而是采用热启动技术[8]即预变性后加入Taq酶，很好地解决了这个问题。测序结果也证明了这一点。再者，引物浓度过高，也可引起非特异性扩增。我们在实验中选择较低浓度的引物浓度(100pmol)[11]以消除非特异性片段的扩增。
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(研究用的标本材料得到秦立君和王燕两位医师帮助，表示衷心的感谢!)
参考文献
1，Tabas JA, Zasloff M, Wasmuth JJ, et al. Human bone morphogenetic protein-2:chromosomal localization of human gene for BMP-1,BMP-2A and BMP-3.Genomics，1991，9:283
2，Riley EH, Lane JM, Urist MR,et al. Bone morphogenetic protein-2:Biology and application .Clin Orthop Rel Res，1996，324:39
3，Ruppert R,Hoffmann E,Sebald W. Human bone morphogenetic protein -2 contains a heparin binding site. Which modifies its biological activity. Eur J Biochem，1996，237:295
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4，Kubler NR , Reuther JF ,Faller G, et al. Inductive of recombinant human BMP-2 produced in a bacterial expression system. Int J Oral Maxillofac Surg，1998，27:305
5，赵 明，王会信，周廷冲.重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性.生物化学杂志，1994，10(2)：318
6，林 松，徐印钦，李伯良.人骨形成蛋白-2A活性片段的E.Coli中高效表达.生物化学与生物物理学报，1996，28(1)：8
7，蒲 勤，陈苏民，陈南春. 重组人骨形成蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达.第四军医大学学报，1998，19(1)：8
8，Diefferbach CW, Dveksler GS. PCR Primer(A Laboratory Manual) .New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.39
9，J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇. 分子克隆实验指南. 第2版. 北京：科学出版社，1992.55
10，Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et al. Novel regulators of bone formation: Molecular clones and activities.Science,1988，242:1528
11，卢圣栋，主编. 现代分子生物学实验技术.第2版.北京：中国协和医科大学出版社，1999.460
(收稿：1999-08-02), http://www.100md.com