臂丛神经根性损伤后脊髓运动神经元死亡的实验研究
作者：张立群 朱维钦 林建华
单位：福建医科大学附属第一医院骨科，福州 350005
关键词：臂丛损伤；运动神经元；脊髓；大鼠
福建医科大学学报000210
摘要:目的 研究臂丛神经根性切断伤及根性撕脱伤后脊髓前角运动神经元的死亡情况。方法 选用60只健康成年SD大鼠，分别造成臂丛神经根性切断伤和根性撕脱伤，于手术后不同时间点取脊髓标本，观察颈髓前角运动神经元数目的变化。结果 臂丛神经根性切断伤后，脊髓前角运动神经元数目无明显变化；而根性撕脱伤1周后神经元数目开始减少，2周时神经元数目已减少30%，6周时达70%。撕脱伤与切断伤之间差异有显著性(P<0.01)。结论 臂丛神经根性切断伤与根性撕脱伤后脊髓运动神经元数目变化不同。臂丛神经根性撕脱伤后脊髓运动神经元发生死亡，死亡速度快，程度高。
, 百拇医药
中图分类号:R651.3;R339.38;R329.25 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0126-03
Cell Death of Spinal Motoneurons after Different Brachial Complex Root Injuries
ZHANG Li-qun,ZHU Wei-qin,LIN Jian-hua
(Department of Orthopedics,The First Affiliated Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China)
ABSTRACT:Objective Investigation of the cell death of spinal motoneurons after different brachial complex root injuries.Methods 60 adult healthy SD rats were made for the model of brachial complex root avulsion and root axotomy.The spinal region was dissected out for motoneuron count and morphological analysis in 1 and 3 day,1,2,3,4 and 6 week respectively after injury.Results Cell death of spinal motoneurons occurred 1 week after root avulsion.30% motoneurons lost 2 weeks after avulsion and 70% in 6 weeks after injury.However,no significant motoneuron death was observed after spinal root axotomy.Conclusion Cell loss of spinal motoneurons in brachial complex root avulsion and root axotomy is different,which has significant statistical meaning.The decrease of motoneurons following root avulsion is rapid and severe.
, 百拇医药
KEY WORDS:brachial complex injury;motor neuron;spinal cord;rat
周围神经损伤外科修复后，神经功能恢复的关键在于受损神经元存活且有再生能力，能调控轴突再生成功。因此，研究周围神经损伤后其相应运动神经元胞体存活数量及质量，对手术方法的选择有重要意义。臂丛损伤是一种严重创伤，损伤后脊髓运动神经元是否发生死亡及死亡的速度和程度如何，不同的实验设计有不同的结果[1，2]。笔者于1999年6～10月以成年大鼠制成臂丛神经根性损伤模型，探讨不同类型、不同时间臂丛神经根性损伤后脊髓运动神经元的死亡情况、死亡程度及速度，从神经元角度为临床臂丛神经损伤选择合适的手术方法提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物 选用健康成年SD大鼠60只(福建医科大学实验动物中心提供)，体重200～300 g，雌雄不拘。随机分成臂丛神经根性切断组和根性撕脱组，每组又根据损伤后取材时间的不同分成损伤后1,3天,1,2,3,4,6周7个时间组，每个时间组4只大鼠，另有4只大鼠作为正常对照组。
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1.2 方法 实验组选取左侧为实验侧，右侧为对照侧。将大鼠用氯胺酮(60～80 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于手术台上，术野脱毛消毒。取双侧锁骨下横切口，长约4 cm，切开皮肤，分离胸大肌后暴露臂丛神经，沿着神经逆行分离，显露C5～T1 5条神经根。根性切断组于神经根出椎间孔处,用显微剪紧贴骨面剪断神经根；根性撕脱组用显微止血钳将神经根完全撕脱(将前后根及脊神经节拉出)。切断或撕脱后，将远端神经分别切除8 mm和10 mm，断端缝扎，阻止轴突的再生。正常组及实验组对照侧同法显露5条神经根，但不造成损伤。术后于术腔内放置少许庆大霉素，逐层关闭切口，将大鼠分笼饲养。
于术后不同时间将大鼠麻醉，打开胸腔，于左心室插管至升主动脉，灌注肝素生理盐水(25 U/100 ml)100 ml，同时右心房切开放血。而后灌注含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4)300 ml。随后在手术显微镜下将大鼠C5～T1节段脊髓取出，置于10%中性甲醛中固定24 h，常规脱水、包埋。
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1.3 结果分析 每例标本均采用连续切片，厚度为 4 μm，每隔20张留取切片1张，共留5张，苏木精-伊红染色，光学显微镜观察、计数。计数方法：计算每张切片上直径>20 μm，有明显细胞核的双侧前角运动神经元数目，求出每个时间组左右侧运动神经元数目之比(L/R)。结果采用t检验。
2 结 果
臂丛神经根性切断伤后，各时间组实验侧及对照(假手术)侧的脊髓前角运动神经元饱满，形态正常，细胞核及核仁清楚，神经元数目无明显变化。而根性撕脱伤后，实验侧存活神经元数目随时间延长而明显减少，可见神经元皱缩，细胞核溶解等细胞死亡征象。各组左右侧神经元数目之比见附表。两种损伤后脊髓运动神经元的死亡率见附图。
附表 臂丛神经根性损伤后两侧神经元数目比值(n=4,
±s) 损伤后时间
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根性切断组
根性撕脱组
1天
0.9751±0.0695
0.9056±0.0714
3天
0.9943±0.1073
0.8962±0.0560
1周
0.9961±0.0385
0.8809±0.0869*
, http://www.100md.com 2周
0.9292±0.0081
0.7056±0.0833*Δ
3周
1.0093±0.0600
0.5711±0.0681*Δ
4周
0.9459±0.0573
0.4320±0.0331*Δ
6周
0.9080±0.0458
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0.2971±0.0776*Δ
正常组为0.9992±0.0508.根性撕脱组组间比较，*：P<0.05；与根性切断组比较，Δ：P<0.01.
附图 损伤后脊髓前角运动神经元死亡率
3 讨 论
周围神经损伤后相应神经元胞体会发生一系列形态、生化、代谢及基因表达的改变，这是神经元胞体对轴突损伤的反映。但如果损伤过于严重，超过细胞反应的代偿能力，将会造成神经元胞体的死亡[3]。神经元胞体是整个周围神经系统的营养中心，是一种终末分化细胞，它一旦死亡，就不可能有成功的再生，肢体功能也不可能恢复。周围神经损伤后受损神经元存活的数量与质量决定着外科手术修复的疗效。目前研究认为，轴突离断后神经元胞体是否死亡与动物年龄、轴突损伤部位、损伤性质以及神经元类型有关[4，5]。
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臂丛神经靠近脊髓，结构复杂，其损伤暴力一般比较大，损伤后脊髓运动神经元是否死亡及死亡程度、死亡速度、根性切断伤与根性撕脱伤后脊髓运动神经元死亡是否有差异，不同的实验设计结果不同。有报告称在椎管内切断C6神经根，4个月内相应节段脊髓运动神经元无明显死亡，而C7神经根撕脱伤后脊髓神经元明显死亡。撕脱伤2周时神经元死亡开始增多，6周时死亡率达70%，4个月内都维持在这个水平[1]。笔者的结果显示，根性切断伤后脊髓运动神经元无明显死亡，根性撕脱伤后则明显死亡。撕脱1周后死亡率随时间延长而逐渐增高，至6周时死亡率高达70%，与上述报道相似；但与有的实验结果也有较大差异[2]。究其原因可能是实验中固定脊髓标本所采用的固定液不同，导致在计数过程中出现误差。
根性撕脱伤与根性切断伤后脊髓运动神经元死亡有显著差异，其原因可能是：(1)根性切断伤仍保留有一定长度的近端轴突，近端神经纤维可合成分泌一些神经元存活所必须的营养物质，如多种神经营养因子等。这些营养物质可保护受损神经元免于死亡；而撕脱伤几乎无残留轴突，使受损运动神经元缺乏足够的营养支持而死亡。有的研究表明，轴突切断后保留一定长度轴突的运动神经元无明显死亡，而当轴突切断部位非常靠近脊髓(<4 mm)时，也同撕脱伤一样造成运动神经元大量死亡[6]，说明周围神经完全离断后保留一定长度轴突本身对受损运动神经元的存活起决定作用。(2)根性切断伤由于在椎间孔外切断，臂丛神经根保留了脊神经前后根以及脊神经的小分支(如脊髓支、后支等)在椎管及椎间孔内的连续性，受损运动神经元可从这些细小侧支和起于神经节细胞的轴突获得来自靶器官的营养物质。这些营养物质对受损运动神经元的存活起重要作用。而根性撕脱伤由于无残留轴突侧支提供这些靶源性神经营养物质而死亡。进一步的实验还表明，颈神经根性撕脱后移植一小段自体神经连接于颈旁肌和撕脱神经根，可以明显减少但不能完全阻止受损运动神经元死亡[7]。
, 百拇医药
目前临床上治疗臂丛根性损伤主要采用神经移位术[8]。从笔者的结果看，根性切断后运动神经元无明显死亡，而根性撕脱后死亡明显。根据这一点，临床上对根性臂丛神经损伤的病人，若近端残留有足够长度可供缝合的神经根且断端损伤变性不严重，神经断面有明显的神经乳突，可试行原位神经缝合或神经移植，以尽量恢复原有的神经支配模式。而对于根性撕脱伤的病人，由于损伤程度严重，神经元死亡速度快，临床上宜选择神经移位术。近来有人试验在椎管内根性撕脱部位修复重建与神经末端的连接，并在动物身上获得了有功能的神经再生[9]。但笔者的实验结果显示，臂丛根性撕脱伤后运动神经元死亡速度很快，损伤后1周已见死亡，6周时最大死亡率达70%，因此行椎管内手术恢复神经根的连续性也很难恢复肢体功能；即使是早期修复，损伤严重的运动神经元是否有再生能力，是否有足够多的神经纤维再生以满足肢体功能活动的需要，这些问题尚需进一步研究。
基金项目:福建省科委科研基金资助项目(98-Z-166)
, 百拇医药
作者简介:张立群(1973～)，男，住院医师.
参考文献
[1]Wu W.Expression of nitric oxide synthase (NOS) in injuried CNS neurons as shown by NADPH diaphorase histochemistry[J].Exp Neurol,1993,120:153～159.
[2]顾玉东.臂丛神经损伤与疾病的诊治[M].上海:上海医科大学出版社,1992.308～320.
[3]Sterman AB,Delannoy MR.Cell body response to axonal injury: traumatic axotomy versus toxic neuropathy[J].Exp Neurol,1985,89:408～419.
, 百拇医药
[4]Himes BT,Tessler A.Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats[J].J Comp Neurol,1989,284:215～230.
[5]Rich KM,Disch SP,Eichler ME.The influence of regeneration and nerve growth factor on the neuronal cell body reaction to injury[J].J Neurocytol,1989,18:569～576.
[6]Gu Y,Spasic Z,Wu W.The effects of remaining axons on motoneuron survival and NOS expression following axotomy in the adult rat[J].Dev Neurosci,1997,19:255～259.
, 百拇医药
[7]Wu W,Han K,Li L,et al.Implantation of PNS graft inhibits the induction of neuronal nitric oxide synthase and enhance the survival of spinal motoneurons following root avulsion[J].Exp Neurol,1994,129:335～339.
[8]顾玉东.臂丛损伤诊治的进展[J].上海医科大学学报,1997,24(5):327～330.
[9]Hoffmann CF,Marani E,Gert van DJ,et al.Reinnervation of avulsed and reimplanted ventral rootlets in the cervical spinal cord of the cat[J].J Neurosurg,1996,84:234～243.
收稿日期:2000-01-12, 百拇医药
单位：福建医科大学附属第一医院骨科，福州 350005
关键词：臂丛损伤；运动神经元；脊髓；大鼠
福建医科大学学报000210
摘要:目的 研究臂丛神经根性切断伤及根性撕脱伤后脊髓前角运动神经元的死亡情况。方法 选用60只健康成年SD大鼠，分别造成臂丛神经根性切断伤和根性撕脱伤，于手术后不同时间点取脊髓标本，观察颈髓前角运动神经元数目的变化。结果 臂丛神经根性切断伤后，脊髓前角运动神经元数目无明显变化；而根性撕脱伤1周后神经元数目开始减少，2周时神经元数目已减少30%，6周时达70%。撕脱伤与切断伤之间差异有显著性(P<0.01)。结论 臂丛神经根性切断伤与根性撕脱伤后脊髓运动神经元数目变化不同。臂丛神经根性撕脱伤后脊髓运动神经元发生死亡，死亡速度快，程度高。
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中图分类号:R651.3;R339.38;R329.25 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0126-03
Cell Death of Spinal Motoneurons after Different Brachial Complex Root Injuries
ZHANG Li-qun,ZHU Wei-qin,LIN Jian-hua
(Department of Orthopedics,The First Affiliated Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China)
ABSTRACT:Objective Investigation of the cell death of spinal motoneurons after different brachial complex root injuries.Methods 60 adult healthy SD rats were made for the model of brachial complex root avulsion and root axotomy.The spinal region was dissected out for motoneuron count and morphological analysis in 1 and 3 day,1,2,3,4 and 6 week respectively after injury.Results Cell death of spinal motoneurons occurred 1 week after root avulsion.30% motoneurons lost 2 weeks after avulsion and 70% in 6 weeks after injury.However,no significant motoneuron death was observed after spinal root axotomy.Conclusion Cell loss of spinal motoneurons in brachial complex root avulsion and root axotomy is different,which has significant statistical meaning.The decrease of motoneurons following root avulsion is rapid and severe.
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KEY WORDS:brachial complex injury;motor neuron;spinal cord;rat
周围神经损伤外科修复后，神经功能恢复的关键在于受损神经元存活且有再生能力，能调控轴突再生成功。因此，研究周围神经损伤后其相应运动神经元胞体存活数量及质量，对手术方法的选择有重要意义。臂丛损伤是一种严重创伤，损伤后脊髓运动神经元是否发生死亡及死亡的速度和程度如何，不同的实验设计有不同的结果[1，2]。笔者于1999年6～10月以成年大鼠制成臂丛神经根性损伤模型，探讨不同类型、不同时间臂丛神经根性损伤后脊髓运动神经元的死亡情况、死亡程度及速度，从神经元角度为临床臂丛神经损伤选择合适的手术方法提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物 选用健康成年SD大鼠60只(福建医科大学实验动物中心提供)，体重200～300 g，雌雄不拘。随机分成臂丛神经根性切断组和根性撕脱组，每组又根据损伤后取材时间的不同分成损伤后1,3天,1,2,3,4,6周7个时间组，每个时间组4只大鼠，另有4只大鼠作为正常对照组。
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1.2 方法 实验组选取左侧为实验侧，右侧为对照侧。将大鼠用氯胺酮(60～80 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于手术台上，术野脱毛消毒。取双侧锁骨下横切口，长约4 cm，切开皮肤，分离胸大肌后暴露臂丛神经，沿着神经逆行分离，显露C5～T1 5条神经根。根性切断组于神经根出椎间孔处,用显微剪紧贴骨面剪断神经根；根性撕脱组用显微止血钳将神经根完全撕脱(将前后根及脊神经节拉出)。切断或撕脱后，将远端神经分别切除8 mm和10 mm，断端缝扎，阻止轴突的再生。正常组及实验组对照侧同法显露5条神经根，但不造成损伤。术后于术腔内放置少许庆大霉素，逐层关闭切口，将大鼠分笼饲养。
于术后不同时间将大鼠麻醉，打开胸腔，于左心室插管至升主动脉，灌注肝素生理盐水(25 U/100 ml)100 ml，同时右心房切开放血。而后灌注含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4)300 ml。随后在手术显微镜下将大鼠C5～T1节段脊髓取出，置于10%中性甲醛中固定24 h，常规脱水、包埋。
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1.3 结果分析 每例标本均采用连续切片，厚度为 4 μm，每隔20张留取切片1张，共留5张，苏木精-伊红染色，光学显微镜观察、计数。计数方法：计算每张切片上直径>20 μm，有明显细胞核的双侧前角运动神经元数目，求出每个时间组左右侧运动神经元数目之比(L/R)。结果采用t检验。
2 结 果
臂丛神经根性切断伤后，各时间组实验侧及对照(假手术)侧的脊髓前角运动神经元饱满，形态正常，细胞核及核仁清楚，神经元数目无明显变化。而根性撕脱伤后，实验侧存活神经元数目随时间延长而明显减少，可见神经元皱缩，细胞核溶解等细胞死亡征象。各组左右侧神经元数目之比见附表。两种损伤后脊髓运动神经元的死亡率见附图。
附表 臂丛神经根性损伤后两侧神经元数目比值(n=4,
±s) 损伤后时间, 百拇医药
根性切断组
根性撕脱组
1天
0.9751±0.0695
0.9056±0.0714
3天
0.9943±0.1073
0.8962±0.0560
1周
0.9961±0.0385
0.8809±0.0869*
, http://www.100md.com 2周
0.9292±0.0081
0.7056±0.0833*Δ
3周
1.0093±0.0600
0.5711±0.0681*Δ
4周
0.9459±0.0573
0.4320±0.0331*Δ
6周
0.9080±0.0458
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0.2971±0.0776*Δ
正常组为0.9992±0.0508.根性撕脱组组间比较，*：P<0.05；与根性切断组比较，Δ：P<0.01.
附图 损伤后脊髓前角运动神经元死亡率
3 讨 论
周围神经损伤后相应神经元胞体会发生一系列形态、生化、代谢及基因表达的改变，这是神经元胞体对轴突损伤的反映。但如果损伤过于严重，超过细胞反应的代偿能力，将会造成神经元胞体的死亡[3]。神经元胞体是整个周围神经系统的营养中心，是一种终末分化细胞，它一旦死亡，就不可能有成功的再生，肢体功能也不可能恢复。周围神经损伤后受损神经元存活的数量与质量决定着外科手术修复的疗效。目前研究认为，轴突离断后神经元胞体是否死亡与动物年龄、轴突损伤部位、损伤性质以及神经元类型有关[4，5]。
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臂丛神经靠近脊髓，结构复杂，其损伤暴力一般比较大，损伤后脊髓运动神经元是否死亡及死亡程度、死亡速度、根性切断伤与根性撕脱伤后脊髓运动神经元死亡是否有差异，不同的实验设计结果不同。有报告称在椎管内切断C6神经根，4个月内相应节段脊髓运动神经元无明显死亡，而C7神经根撕脱伤后脊髓神经元明显死亡。撕脱伤2周时神经元死亡开始增多，6周时死亡率达70%，4个月内都维持在这个水平[1]。笔者的结果显示，根性切断伤后脊髓运动神经元无明显死亡，根性撕脱伤后则明显死亡。撕脱1周后死亡率随时间延长而逐渐增高，至6周时死亡率高达70%，与上述报道相似；但与有的实验结果也有较大差异[2]。究其原因可能是实验中固定脊髓标本所采用的固定液不同，导致在计数过程中出现误差。
根性撕脱伤与根性切断伤后脊髓运动神经元死亡有显著差异，其原因可能是：(1)根性切断伤仍保留有一定长度的近端轴突，近端神经纤维可合成分泌一些神经元存活所必须的营养物质，如多种神经营养因子等。这些营养物质可保护受损神经元免于死亡；而撕脱伤几乎无残留轴突，使受损运动神经元缺乏足够的营养支持而死亡。有的研究表明，轴突切断后保留一定长度轴突的运动神经元无明显死亡，而当轴突切断部位非常靠近脊髓(<4 mm)时，也同撕脱伤一样造成运动神经元大量死亡[6]，说明周围神经完全离断后保留一定长度轴突本身对受损运动神经元的存活起决定作用。(2)根性切断伤由于在椎间孔外切断，臂丛神经根保留了脊神经前后根以及脊神经的小分支(如脊髓支、后支等)在椎管及椎间孔内的连续性，受损运动神经元可从这些细小侧支和起于神经节细胞的轴突获得来自靶器官的营养物质。这些营养物质对受损运动神经元的存活起重要作用。而根性撕脱伤由于无残留轴突侧支提供这些靶源性神经营养物质而死亡。进一步的实验还表明，颈神经根性撕脱后移植一小段自体神经连接于颈旁肌和撕脱神经根，可以明显减少但不能完全阻止受损运动神经元死亡[7]。
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目前临床上治疗臂丛根性损伤主要采用神经移位术[8]。从笔者的结果看，根性切断后运动神经元无明显死亡，而根性撕脱后死亡明显。根据这一点，临床上对根性臂丛神经损伤的病人，若近端残留有足够长度可供缝合的神经根且断端损伤变性不严重，神经断面有明显的神经乳突，可试行原位神经缝合或神经移植，以尽量恢复原有的神经支配模式。而对于根性撕脱伤的病人，由于损伤程度严重，神经元死亡速度快，临床上宜选择神经移位术。近来有人试验在椎管内根性撕脱部位修复重建与神经末端的连接，并在动物身上获得了有功能的神经再生[9]。但笔者的实验结果显示，臂丛根性撕脱伤后运动神经元死亡速度很快，损伤后1周已见死亡，6周时最大死亡率达70%，因此行椎管内手术恢复神经根的连续性也很难恢复肢体功能；即使是早期修复，损伤严重的运动神经元是否有再生能力，是否有足够多的神经纤维再生以满足肢体功能活动的需要，这些问题尚需进一步研究。
基金项目:福建省科委科研基金资助项目(98-Z-166)
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作者简介:张立群(1973～)，男，住院医师.
参考文献
[1]Wu W.Expression of nitric oxide synthase (NOS) in injuried CNS neurons as shown by NADPH diaphorase histochemistry[J].Exp Neurol,1993,120:153～159.
[2]顾玉东.臂丛神经损伤与疾病的诊治[M].上海:上海医科大学出版社,1992.308～320.
[3]Sterman AB,Delannoy MR.Cell body response to axonal injury: traumatic axotomy versus toxic neuropathy[J].Exp Neurol,1985,89:408～419.
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[4]Himes BT,Tessler A.Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats[J].J Comp Neurol,1989,284:215～230.
[5]Rich KM,Disch SP,Eichler ME.The influence of regeneration and nerve growth factor on the neuronal cell body reaction to injury[J].J Neurocytol,1989,18:569～576.
[6]Gu Y,Spasic Z,Wu W.The effects of remaining axons on motoneuron survival and NOS expression following axotomy in the adult rat[J].Dev Neurosci,1997,19:255～259.
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[7]Wu W,Han K,Li L,et al.Implantation of PNS graft inhibits the induction of neuronal nitric oxide synthase and enhance the survival of spinal motoneurons following root avulsion[J].Exp Neurol,1994,129:335～339.
[8]顾玉东.臂丛损伤诊治的进展[J].上海医科大学学报,1997,24(5):327～330.
[9]Hoffmann CF,Marani E,Gert van DJ,et al.Reinnervation of avulsed and reimplanted ventral rootlets in the cervical spinal cord of the cat[J].J Neurosurg,1996,84:234～243.
收稿日期:2000-01-12, 百拇医药