慢性缺氧和二氧化碳潴留大鼠脑阴离子转运蛋白的研究
作者：张献全 钱桂生 范卫东
单位：第三军医大学附属新桥医院 呼吸病研究所(重庆 400037)
关键词：缺氧症；高碳酸血；肺；脑
中国病理生理杂志990124 摘 要 目的：观测慢性缺氧和二氧化碳潴留大鼠脑桥组织中脑阴离子转运蛋白(AE3)mRNA的变化。方法：采用密闭舱内灌注混合气体的方法，分别复制慢性缺氧，慢性缺氧伴二氧化碳潴留及慢性呼吸性酸中毒大鼠模型，以地高辛标记的(AE3)cDNA探针，应用点杂交技术，对各实验组及对照组大鼠脑桥组织中AE3mRNA的相对含量进行测定。结果：(1)慢性缺氧组AE3 mRNA的相对含量明显地低于对照组(P<0.05)，慢性缺氧伴二氧化碳潴留及慢性呼吸性酸中毒组的AE3 mRNA降低更为明显；(2)慢性缺氧伴二氧化碳潴留及慢性呼吸性酸中毒二组之间无显著差异(P>0.05)，但都明显低于慢性缺氧组(P<0.01)。结论：提示AE3在呼吸衰竭及其导致的肺性脑病的发生中可能具有一定作用。
, 百拇医药
Chronic hypoxia and hypercapnia on the expression
of anion exchanger mRNA in rat brains
ZHANG Xian-Quan,QIAN Gui-Sheng,FAN Wei-Dong
Institute of Respiratory Disease, Third Military Medical University, Chongqing(400037)
Abstract AIM：To study the expression of anion exchanger (AE3) of brain in rats under chronic hypoxia and hypercapnia.METHODS:With a sensitive digoxigenin labelled AE3 cDNA probe,dot blot was used to evaluated changes of AE3 mRNA in rats models of chronic hypoxia,chronic hypoxia with hypercapnia and chronic acidosis established by pouring mixed gases into the chamber respectively as compared with control.RESULTS:It was found that the relative contents of AE3 mRNA in rat brains in experimental group were significantly lower than that in control group(P<0.05),and the relative contents of AE3 mRNA in rat brains of hypoxia with hypercapnia and chronic acidosis were also significantly lower than that of chronic hypoxia(P<0.01),but there was no significant difference between chronic hypoxia with hypercapnia group and chronic acidosis group(P>0.05).CONCLUSION:AE3 may play an important role in the respiratory failure and pulmonary encephalophathy.
, 百拇医药
MeSH Anoxia;Hypercapnia;Lung;Brain
慢性胸肺疾患导致呼吸衰竭时，常因缺氧和二氧化碳潴留引起肺性脑病，但其确切的机制尚未阐明。近年的研究发现，细胞膜氯离子通道在神经元细胞兴奋性中起重要的作用[1]。脑阴离子转运蛋白作为神经元细胞膜上三种氯离子通道中的一种主要氯离子转运载体[2]，其在呼吸衰竭时的变化如何尚不清楚。本研究旨在测定缺氧和二氧化碳潴留时大鼠脑桥组织中AE3mRNA的变化，探讨其在肺性脑病中的作用。
材料与方法
(一)主要材料：质粒PRG108(含小鼠脑AE3cDNA，美国Stanford大学Kopito教授惠赠)，地高辛标记检测试剂盒、硝酸纤维素膜(德国Boehringer产品，)蛋白酶K、聚蔗糖、聚乙烯吡铬烷酮、鲑鱼精子DNA，硫酸葡聚糖、MOPS(美国Sigma产品，)限制性内切酶HindⅢ、λDNA/HindⅢ Marker(华美生物工程公司产品，)核糖核酸酶A(Promega产品，)其它试剂均为国产优质纯或分析纯。菌种HB101为第三军医大学遗传教研室保存菌种。IL-1303血气分析仪，754紫外/可见分光光度计，CSG10型双波长薄层扫描仪，C-RIB型数据记录仪。
, 百拇医药
(二)动物模型复制：雄性Wistar大鼠48只，体重200～250g，随机分为4组，参照文献[3]进行。所有大鼠均在实验舱内抽动脉血行血气分析，而后断头，迅速取出脑组织，1%DEPC PBS水冲洗血迹，冰浴中分取大脑、中脑、脑桥、小脑各100mg，液氮存放。
(三)脑组织总RNA的提取、鉴定及定量：按文献[4]方法进行，采用甲醛变性凝胶电泳及分光光度计法进行鉴定并定量，使OD260/OD280均在2.00±0.10范围内，并将各样品浓度调定为10mg/L，以备杂交时定量。
(四)AE3 cDNA探针的制备：碱变性法提取质粒DNA，HindⅢ酶切，透析袋法回收，参照试剂盒行地高辛随机引物标记，并估测标记率。
(五)点杂交：参照试剂盒说明行高严格度杂交，依次行标准品、样品稀释→点膜、烤膜→预杂交、杂交→洗膜及免疫检测显色及终止反应。
, 百拇医药
(六)结果分析：湿膜置于CSG10型双波长薄层扫描仪上，于540nm处扫描，C-RIB数据记录扫描图谱，以标准品各点面积为纵坐标，计数各样品点AE3mRNA的相对含量。结果以
±s表示，在微机上应用本校组胚教研室统计软件(BS Ver 1.0)行t检验和方差分析。
结 果
一、大鼠动脉血气分析(见表1)。
二、AE3cDNA酶切片段：如图1。
三、脑桥总RNA电泳图，如图2。上面的一条带为18s rRNA，下面的一条带为28 s rRNA。
四、各组AE3mRNA相对含量(ng/mg组织)，见表2。
, 百拇医药
讨 论
阴离子转运蛋白(anion exchanger, AE)是一类分布广泛的膜蛋白，通过介导Cl-/HCO-3跨膜转运参与细胞内pH、细胞体积及细胞内氯离子浓度的调节[5]。位于红细胞膜上的AE即Band3(又称AE1)，在CO2的转运和排出中起重要作用，AE2的分布较为广泛，主要位于肾小管基质细胞，在调节机体及基质细胞自身的酸碱及离子浓度具有一定的作用。1989年Kopito
表1 动脉血气分析结果
Tab 1 Results of arterial blood gas analysis(±s) Group
, 百拇医药
n
pH
PO2(kPa)
PCO2(kPa)
HCO-3(mmol/L)
Control
12
7.32±0.03
12.16±0.98
5.54±0.82
21.57±3.1
, http://www.100md.com
Hypoxia
8
7.31±0.08
6.63±1.70*
5.56±0.98
20.23±4.28
Hypoxia with
9
7.25±0.06△△*
6.37±0.94*
7.31±0.75△*
, 百拇医药
25.50±2.01△*
hypercapnia
Respiratory
acidosis
9
7.24±0.08△*
12.11±1.45△
8.82±2.75△*
29.15±2.34△*
△ P<0.05，△△ P<0.01，vs hypoxia; *P<0.05，**P<0.01，vs control
, http://www.100md.com
Fig 1 Restriction-map of PRG108 plasmid
A：PRG108 plasmid； B，C：PRG plasmid 108+Hind Ⅲ；
D：λ DNA/HindⅢ Marker
图1 质粒PRG108酶切后电泳图
Fig 2 1%Agaros gel electrophoresis of total RNA
图2 总RNA在1%琼脂糖凝胶上
表2 各组大鼠脑桥组织AE3 mRNA的含量
, http://www.100md.com
Tab 2 Content of AE3 mRNA in rats brain(±s) Group
n
AE3 mRNA(ng/mg)
Control
12
372.70±28.92
Hypoxia
10
342.20±26.54*
, http://www.100md.com
Hypoxia with
9
185.95±16.38**△△
hypercapnia
Respiratory
11
210.07±13.25**△△
acidosis
△ P<0.05，△△ P<0.01，vs hypoxia； *P<0.05，**P<0.01，vs control； AE: anion exchanger
, 百拇医药 首次从小鼠脑cDNA文库中筛选出AE3cDNA克隆，并通过细胞转染及细胞内外pH、离子变化的测量等证明其具有有AE1、AE2相似的功能[6]，随后Kudrycki分离出大鼠脑AE3cDNA，并证明与小鼠AE3cDNA高度同源，而与AE1、AE2的同源性较低，因此，本研究应用小鼠脑特异性AE3cDNA探针，能较准确地检测了大鼠脑AE3mRNA的存在及变化情况。还以AE3cDNA为探针对鼠脑冰冻切片进行了原位杂交，结果显示AE3mRNA主要分布于大脑皮质Ⅱ层、V层、扣带回、海马、中脑核团、脑桥灰质等，其中以呼吸调节中枢所在部位脑桥深部灰质最为丰富，与Kopito及Kudrycki的研究结果相似，说明AE3与呼吸调节中枢具有密切关系。在研究脑脊液中强离子浓度与呼吸中枢兴奋性的关系中发现，Cl-浓度的改变可引起呼吸节律和深度的变化，说明Cl-改变是呼吸中枢的有效刺激因素[7]，而向离体脑片中灌注高浓度二氧化碳气体及动物吸入高浓度二氧化碳气体，均可引起膜电位、细胞内氯离子浓度及动物行为的异常[8，9]，提示氯离子通道的状态改变可能是二氧化碳引起肺性脑病的中间环节。本研究显示慢性缺氧和二氧化碳潴留均可引起大鼠脑AE3mRNA的降低，这与细胞维持自身pHi的稳定有关。已证明，缺氧和二氧化碳潴留造成细胞内酸中毒，限制AE的活性而减少排碱，同时增加其它几种离子通道活性加速排酸，以维持其自身稳定[10]。总之，AE3作为神经元细胞膜上的一种主要氯离子转运载体，其在缺氧和二氧化碳潴留时的降低，也许其在肺性脑病的发生中具有一定作用，确切的作用及其机制有待进一步深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Valverde MA,Hardy HP,Sepulveda FV.Chloride channels:a state of flux.FASEB J,1995,9:509.
2 Kobayashi S,Morgans CW,Kopito RR.AE3 anion exchanger isoforms in the vertebrate retina developmental regulation and differential expression in neurons and glia.J Neurosci,1994,14:6266.
3 杨晓静，钱桂生，毛宝龄.慢性常压缺氧和高二氧化碳大鼠红细胞膜带3蛋白结构与功能的研究.中国病理生理杂志，1996，12：350.
, 百拇医药 4 Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1989,162:156.
5 Alper SL.The band 3-relation anion exchanger(AE) gene family.Annu Rev Physiol,1991,53:349.
6 Kopito RR,Lee BS,Simmons DM.Regulation of intracellular pH by a neuronal homolog of the erythrocyte anion exchanger.Cell,1989,59:929.
7 Davidson TL,Sullivan MP,Swanson KE.Cl- replacement alters the ventilatory response to central chemoreceptor simulation.J Appl Physiol,1993,74:280.
, 百拇医药
8 Doan JB.CO2 degreases membrane conductance and depolariced neurons in the nucleus tractus sotilarii.Exp Brain Res,1987,176:656y.
9 Sanna E.Carbon dioxide inhalation reduces the function of GABAA receptor in the rat brain.Eur J Pharmacol,1992,216:457.
10 Chesler M,Kaila K.Modulation of pH by neuronal activity.Trends Neurosci,1992,15:396.
收稿日期：1996年12月26日
修稿日期：1997年7月4日
, 百拇医药
单位：第三军医大学附属新桥医院 呼吸病研究所(重庆 400037)
关键词：缺氧症；高碳酸血；肺；脑
中国病理生理杂志990124 摘 要 目的：观测慢性缺氧和二氧化碳潴留大鼠脑桥组织中脑阴离子转运蛋白(AE3)mRNA的变化。方法：采用密闭舱内灌注混合气体的方法，分别复制慢性缺氧，慢性缺氧伴二氧化碳潴留及慢性呼吸性酸中毒大鼠模型，以地高辛标记的(AE3)cDNA探针，应用点杂交技术，对各实验组及对照组大鼠脑桥组织中AE3mRNA的相对含量进行测定。结果：(1)慢性缺氧组AE3 mRNA的相对含量明显地低于对照组(P<0.05)，慢性缺氧伴二氧化碳潴留及慢性呼吸性酸中毒组的AE3 mRNA降低更为明显；(2)慢性缺氧伴二氧化碳潴留及慢性呼吸性酸中毒二组之间无显著差异(P>0.05)，但都明显低于慢性缺氧组(P<0.01)。结论：提示AE3在呼吸衰竭及其导致的肺性脑病的发生中可能具有一定作用。
, 百拇医药
Chronic hypoxia and hypercapnia on the expression
of anion exchanger mRNA in rat brains
ZHANG Xian-Quan,QIAN Gui-Sheng,FAN Wei-Dong
Institute of Respiratory Disease, Third Military Medical University, Chongqing(400037)
Abstract AIM：To study the expression of anion exchanger (AE3) of brain in rats under chronic hypoxia and hypercapnia.METHODS:With a sensitive digoxigenin labelled AE3 cDNA probe,dot blot was used to evaluated changes of AE3 mRNA in rats models of chronic hypoxia,chronic hypoxia with hypercapnia and chronic acidosis established by pouring mixed gases into the chamber respectively as compared with control.RESULTS:It was found that the relative contents of AE3 mRNA in rat brains in experimental group were significantly lower than that in control group(P<0.05),and the relative contents of AE3 mRNA in rat brains of hypoxia with hypercapnia and chronic acidosis were also significantly lower than that of chronic hypoxia(P<0.01),but there was no significant difference between chronic hypoxia with hypercapnia group and chronic acidosis group(P>0.05).CONCLUSION:AE3 may play an important role in the respiratory failure and pulmonary encephalophathy.
, 百拇医药
MeSH Anoxia;Hypercapnia;Lung;Brain
慢性胸肺疾患导致呼吸衰竭时，常因缺氧和二氧化碳潴留引起肺性脑病，但其确切的机制尚未阐明。近年的研究发现，细胞膜氯离子通道在神经元细胞兴奋性中起重要的作用[1]。脑阴离子转运蛋白作为神经元细胞膜上三种氯离子通道中的一种主要氯离子转运载体[2]，其在呼吸衰竭时的变化如何尚不清楚。本研究旨在测定缺氧和二氧化碳潴留时大鼠脑桥组织中AE3mRNA的变化，探讨其在肺性脑病中的作用。
材料与方法
(一)主要材料：质粒PRG108(含小鼠脑AE3cDNA，美国Stanford大学Kopito教授惠赠)，地高辛标记检测试剂盒、硝酸纤维素膜(德国Boehringer产品，)蛋白酶K、聚蔗糖、聚乙烯吡铬烷酮、鲑鱼精子DNA，硫酸葡聚糖、MOPS(美国Sigma产品，)限制性内切酶HindⅢ、λDNA/HindⅢ Marker(华美生物工程公司产品，)核糖核酸酶A(Promega产品，)其它试剂均为国产优质纯或分析纯。菌种HB101为第三军医大学遗传教研室保存菌种。IL-1303血气分析仪，754紫外/可见分光光度计，CSG10型双波长薄层扫描仪，C-RIB型数据记录仪。
, 百拇医药
(二)动物模型复制：雄性Wistar大鼠48只，体重200～250g，随机分为4组，参照文献[3]进行。所有大鼠均在实验舱内抽动脉血行血气分析，而后断头，迅速取出脑组织，1%DEPC PBS水冲洗血迹，冰浴中分取大脑、中脑、脑桥、小脑各100mg，液氮存放。
(三)脑组织总RNA的提取、鉴定及定量：按文献[4]方法进行，采用甲醛变性凝胶电泳及分光光度计法进行鉴定并定量，使OD260/OD280均在2.00±0.10范围内，并将各样品浓度调定为10mg/L，以备杂交时定量。
(四)AE3 cDNA探针的制备：碱变性法提取质粒DNA，HindⅢ酶切，透析袋法回收，参照试剂盒行地高辛随机引物标记，并估测标记率。
(五)点杂交：参照试剂盒说明行高严格度杂交，依次行标准品、样品稀释→点膜、烤膜→预杂交、杂交→洗膜及免疫检测显色及终止反应。
, 百拇医药
(六)结果分析：湿膜置于CSG10型双波长薄层扫描仪上，于540nm处扫描，C-RIB数据记录扫描图谱，以标准品各点面积为纵坐标，计数各样品点AE3mRNA的相对含量。结果以
±s表示，在微机上应用本校组胚教研室统计软件(BS Ver 1.0)行t检验和方差分析。结 果
一、大鼠动脉血气分析(见表1)。
二、AE3cDNA酶切片段：如图1。
三、脑桥总RNA电泳图，如图2。上面的一条带为18s rRNA，下面的一条带为28 s rRNA。
四、各组AE3mRNA相对含量(ng/mg组织)，见表2。
, 百拇医药
讨 论
阴离子转运蛋白(anion exchanger, AE)是一类分布广泛的膜蛋白，通过介导Cl-/HCO-3跨膜转运参与细胞内pH、细胞体积及细胞内氯离子浓度的调节[5]。位于红细胞膜上的AE即Band3(又称AE1)，在CO2的转运和排出中起重要作用，AE2的分布较为广泛，主要位于肾小管基质细胞，在调节机体及基质细胞自身的酸碱及离子浓度具有一定的作用。1989年Kopito
表1 动脉血气分析结果
Tab 1 Results of arterial blood gas analysis(
±s) Group, 百拇医药
n
pH
PO2(kPa)
PCO2(kPa)
HCO-3(mmol/L)
Control
12
7.32±0.03
12.16±0.98
5.54±0.82
21.57±3.1
, http://www.100md.com
Hypoxia
8
7.31±0.08
6.63±1.70*
5.56±0.98
20.23±4.28
Hypoxia with
9
7.25±0.06△△*
6.37±0.94*
7.31±0.75△*
, 百拇医药
25.50±2.01△*
hypercapnia
Respiratory
acidosis
9
7.24±0.08△*
12.11±1.45△
8.82±2.75△*
29.15±2.34△*
△ P<0.05，△△ P<0.01，vs hypoxia; *P<0.05，**P<0.01，vs control
, http://www.100md.com
Fig 1 Restriction-map of PRG108 plasmid
A：PRG108 plasmid； B，C：PRG plasmid 108+Hind Ⅲ；
D：λ DNA/HindⅢ Marker
图1 质粒PRG108酶切后电泳图
Fig 2 1%Agaros gel electrophoresis of total RNA
图2 总RNA在1%琼脂糖凝胶上
表2 各组大鼠脑桥组织AE3 mRNA的含量
, http://www.100md.com
Tab 2 Content of AE3 mRNA in rats brain(
±s) Groupn
AE3 mRNA(ng/mg)
Control
12
372.70±28.92
Hypoxia
10
342.20±26.54*
, http://www.100md.com
Hypoxia with
9
185.95±16.38**△△
hypercapnia
Respiratory
11
210.07±13.25**△△
acidosis
△ P<0.05，△△ P<0.01，vs hypoxia； *P<0.05，**P<0.01，vs control； AE: anion exchanger
, 百拇医药 首次从小鼠脑cDNA文库中筛选出AE3cDNA克隆，并通过细胞转染及细胞内外pH、离子变化的测量等证明其具有有AE1、AE2相似的功能[6]，随后Kudrycki分离出大鼠脑AE3cDNA，并证明与小鼠AE3cDNA高度同源，而与AE1、AE2的同源性较低，因此，本研究应用小鼠脑特异性AE3cDNA探针，能较准确地检测了大鼠脑AE3mRNA的存在及变化情况。还以AE3cDNA为探针对鼠脑冰冻切片进行了原位杂交，结果显示AE3mRNA主要分布于大脑皮质Ⅱ层、V层、扣带回、海马、中脑核团、脑桥灰质等，其中以呼吸调节中枢所在部位脑桥深部灰质最为丰富，与Kopito及Kudrycki的研究结果相似，说明AE3与呼吸调节中枢具有密切关系。在研究脑脊液中强离子浓度与呼吸中枢兴奋性的关系中发现，Cl-浓度的改变可引起呼吸节律和深度的变化，说明Cl-改变是呼吸中枢的有效刺激因素[7]，而向离体脑片中灌注高浓度二氧化碳气体及动物吸入高浓度二氧化碳气体，均可引起膜电位、细胞内氯离子浓度及动物行为的异常[8，9]，提示氯离子通道的状态改变可能是二氧化碳引起肺性脑病的中间环节。本研究显示慢性缺氧和二氧化碳潴留均可引起大鼠脑AE3mRNA的降低，这与细胞维持自身pHi的稳定有关。已证明，缺氧和二氧化碳潴留造成细胞内酸中毒，限制AE的活性而减少排碱，同时增加其它几种离子通道活性加速排酸，以维持其自身稳定[10]。总之，AE3作为神经元细胞膜上的一种主要氯离子转运载体，其在缺氧和二氧化碳潴留时的降低，也许其在肺性脑病的发生中具有一定作用，确切的作用及其机制有待进一步深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Valverde MA,Hardy HP,Sepulveda FV.Chloride channels:a state of flux.FASEB J,1995,9:509.
2 Kobayashi S,Morgans CW,Kopito RR.AE3 anion exchanger isoforms in the vertebrate retina developmental regulation and differential expression in neurons and glia.J Neurosci,1994,14:6266.
3 杨晓静，钱桂生，毛宝龄.慢性常压缺氧和高二氧化碳大鼠红细胞膜带3蛋白结构与功能的研究.中国病理生理杂志，1996，12：350.
, 百拇医药 4 Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1989,162:156.
5 Alper SL.The band 3-relation anion exchanger(AE) gene family.Annu Rev Physiol,1991,53:349.
6 Kopito RR,Lee BS,Simmons DM.Regulation of intracellular pH by a neuronal homolog of the erythrocyte anion exchanger.Cell,1989,59:929.
7 Davidson TL,Sullivan MP,Swanson KE.Cl- replacement alters the ventilatory response to central chemoreceptor simulation.J Appl Physiol,1993,74:280.
, 百拇医药
8 Doan JB.CO2 degreases membrane conductance and depolariced neurons in the nucleus tractus sotilarii.Exp Brain Res,1987,176:656y.
9 Sanna E.Carbon dioxide inhalation reduces the function of GABAA receptor in the rat brain.Eur J Pharmacol,1992,216:457.
10 Chesler M,Kaila K.Modulation of pH by neuronal activity.Trends Neurosci,1992,15:396.
收稿日期：1996年12月26日
修稿日期：1997年7月4日
, 百拇医药