钙调素在豚鼠过敏性哮喘发病过程中的作用
作者：孙宝君 黄念秋 范 明 王瑞红 刘淑红甘思德
单位：孙宝君 黄念秋 解放军总医院(北京100853)；范 明 刘淑红 甘思德 军事医学科学院基础医学研究所；王瑞红 北京师范大学生物系
关键词：钙调素；哮喘；维拉帕米
中国病理生理杂志990122 摘 要 目的和方法：给致敏豚鼠吸入卵蛋白建立速发型过敏性哮喘的动物模型，观察呼吸系总阻抗(respiratory impedance, RI)及豚鼠支气管平滑肌钙调素(CaM)活性的变化。结果：哮喘组RI明显高于正常组(P<0.01),支气管平滑肌CaM活性低于正常组(P<0.05),山莨菪碱(654-2)有增加支气管平滑肌CaM活性的作用，异搏定对其无影响。结论：支气管平滑肌CaM活性下降在哮喘的发病过程中起重要作用。
The role of calmodulin in the pathogenesis of allergic asthma in guinea pig
, http://www.100md.com
SUN Bao-Jun, HUANG Nian-Qiu, FAN Ming, WANG Rui-Hong, LIU Shu-Hong, GAN Si-De
The General Hospital of PLA, Beijing(100853)
Abstract AIM and METHODS:The immediate-type allergic asthma animal model was established in sensitized guinea pigs by inhalation with ovalbumin. Respiratory impedance (RI) and the calmodulin activity in bronchial smooth muscle were observed.RESULTS:RI was increased (P<0.01), while calmodulin activity in brochial smooth muscle was decreased (P<0.05) in asthma group than that in normal group. Anisodamin(654-2) can increase calmodulin activity in bronchial smooth muscle. Verapamil has no effect on it. CONCLUSION: The decrease of calmodulin activity in bronchial smooth muscle may play an important role in the pathogenesis of the allergic asthma.
, http://www.100md.com
MeSH Calmodulin; Asthma; Verapamil
哮喘是一种常见、多发病，其发病机理复杂，目前还不完全清楚。已知哮喘的许多病理环节都与钙(Ca2+)密切相关，而钙调素(CaM)是胞内Ca2+的主要受体，参与许多细胞功能的调节，在哮喘的发病过程中可能起重要作用。本文初步观察了支气管平滑肌CaM活性的变化，从分子水平探讨哮喘的发病机理，为临床防治提供新的途径。
材料和方法
一、动物及分组：
雄性，杂色豚鼠，4月龄，体重380～450g，随机分为4组：生理盐水(NS)对照组、哮喘组、654-2+哮喘组、异搏定+哮喘组。
二、哮喘动物模型的复制：
, http://www.100md.com
先向豚鼠腹腔内注射质量分数为10%卵蛋白生理盐水1mL致敏，NS对照组腹腔注射生理盐水1 mL。两周后用25%乌拉坦1 200 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。将一充满生理盐水的塑料管插入动物食道中下1/3处，另一端接压力传感器，然后气管切开，气管插管定时接空气阻力管，用RM 6 200四导生理记录仪记录基础食道压及呼吸流速。
1.NS对照组(NS control)：用超声雾化器经气管插管持续喷雾生理盐水5 min，并于雾化后即刻、5、10、15 min时记录食道压及呼吸流速。在15 min时，当各项指标记录完毕，立即断头处死动物，取肺组织置于-30℃保存。
2.哮喘组(Asthma)：经气管插管持续雾化吸入新配制的2%卵蛋白生理盐水溶液5 min，余同NS对照组。
3.654-2+哮喘组(654-2+Asthma)：在抗原吸入前5 min腹腔注射654-2(10 mg/kg)，余同哮喘组。
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4.异搏定+哮喘组(Verapamil+Asthma)：在抗原吸入前5 min腹腔注射异搏定(500 μg/kg)，余同哮喘组。
呼吸系总阻抗(RI)=食道内压/呼吸流速(kPa/mL*s-1)。
三、支气管平滑肌CaM活性的测定：
肺组织冰冻切片用1∶1甲醇-丙酮溶液固定后，用1×10-4 mol/L三氟拉嗪着色15 min,253 nm紫光照射20min，用0.1 mol/L无钙PBS冲洗后，在荧光显微镜下观察(激发光400～450 nm),用荧光分光光度计测定支气管平滑肌的荧光强度。并以对照组为基础值计算CaM的相对活性[1]。4组动物数分别为9、8、8、7只。每个标本随机取5个视野。表2中n为视野数。
四、统计学分析：
, 百拇医药
用一元单方F检验和Q检验。
结 果
一、呼吸系统总阻抗的变化：
NS对照组各时点RI均无变化，除基础值外，各时点均极显著低于哮喘组。吸入抗原后，哮喘组RI即达到最高值，以后逐渐下降，各时点RI均极显著高于基础值。654-2+哮喘组各时点RI均增加，但仍极显著低于哮喘组。异搏定+哮喘组各时点RI均增加，0 min时高于NS对照组(P<0.01)，但均明显低于哮喘组(见表1)。
二、支气管平滑肌CaM活性的变化：
NS对照组及654-2+哮喘组CaM活性显著高于哮喘组(P<0.05和P<0.01)，异搏定+哮喘组与哮喘组差异无显著，但明显低于654-2+哮喘组(见表2)。
表1 呼吸系总阻抗的变化
, 百拇医药
Tab 1 Change in respiratory impedance(kPa·mL-1·s-1,
±s) Group
n
Base
0
5
10
15(min)
NS control
9
0.215±0.026
, 百拇医药
0.219±0.02**
0.218±0.02**
0.219±0.023**
0.221±0.025**
Asthma
8
0.215±0.016
0.410±0.030△△
0.379±0.031△△
0.351±0.025△△
, http://www.100md.com
0.324±0.020△
654-2+asthma
8
0.211±0.012
0.269±0.013**△
0.271±0.014**△△
0.252±0.016**
0.239±0.021*
Verapamil+asthma
7
, 百拇医药
0.221±0.012
0.322±0.028*△
0.276±0.031*
0.269±0.030*
0.238±0.027*
P<0.05， P<0.01, vs asthma; △ P<0.05, △△ P<0.01, vs base in the same group表2 支气管平滑肌CaM活性(荧光强度)变化
Tab 2 Activity of CaM in bronchial smooth muscle (±s) Group
, 百拇医药
n
Activity of CaM
(fluoresence intensity)
NS control
45
100.00±7.67*
Asthma
40
73.09±4.17
654-2+asthma
30
, http://www.100md.com 114.88±6.75**△
Verapamil+asthma
30
82.20±6.88
*P<0.05,**P<0.01,vs asthma;
△P<0.05,vs verapamil group； n=No of view讨 论
一、CaM活性变化在哮喘发病机制中的作用：
CaM存在于所有真核细胞中，是一个耐热、性质稳定、无组织及种属特异性多肽，它有四个Ca2+结合位点，正常情况下，其活性随胞内Ca2+浓度而改变。在Ca2+所介导的各种细胞功能中，CaM充当着一个中间媒介即作为细胞内Ca2+受体参与各种细胞功能调节。
, 百拇医药
近年来的研究表明，当细胞内Ca2+浓度升高时，Ca2+与CaM结合形成Ca2+-CaM复合物(即活性CaM)，再结合并激活肌球蛋白轻链激酶(MLCK)，后者使肌球蛋白链(MLC)磷酸化，平滑肌收缩[2]。CaM还可提高钙ATP酶(Ca2+-ATPase)活性[3]，加速Ca2+从细胞内排出，使胞内Ca2+降低，平滑肌舒张。因此CaM具有收缩和舒张平滑肌的双重作用。哮喘发作15 min时，支气管平滑肌CaM活性下降，说明此时CaM的变化可能影响了平滑肌的舒张过程，因为CaM活性下降使Ca2+-ATPase活性下降，胞内Ca2+排出减少，胞内Ca2+浓度仍高，平滑肌不能舒张。这一点在我们的实验中已得到证实[4]。
二、654-2、异搏定对CaM活性的影响：
, http://www.100md.com
近年来的研究表明，654-2具有多项药理作用，杨国栋等研究结果显示调微Ⅰ号(莨菪类药物)，不仅可直接增加红细胞膜Ca2+-ATPase活性，也可通过CaM的激活作用增加Ca2+-ATPase的活性。我们的实验结果表明，654-2+哮喘组各时点RI值均明显低于哮喘组，CaM活性则明显高于哮喘组，进一步说明CaM在哮喘发病过程中可能起一定作用。也说明654-2有增加CaM活性的作用，其对哮喘的预防作用可能与此有关。
异搏定+哮喘组各时点RI均低于哮喘组，CaM活性与哮喘组差异不显著，但仍低于NS对照组。说明异搏定对支气管平滑肌CaM活性无影响，这似乎从另一个角度说明CaM活性的变化可能在哮喘发病过程中起重要作用。
参考文献
1 You Jinsong, Li Suwen, Wang Duanshun, et al. The distribution of calmodulin and Ca2+-activated calmodulin in cell cycle of mouse erythroleukemia cells. Cell Res, 1990, 1:89.
, http://www.100md.com
2 Triggle DJ. Calcium, the control of smooth muscle function and bronchial hyperreactivity. Allergy, 1983:38.1.
3 文充镒，张志明，胡蓓主编.钙与钙调素.化学工业出版社，1989.91～92.
4 孙宝君，黄念秋，董伟，等.钙ATP酶在豚鼠过敏性哮喘发病过程中的作用.军医进修学院学报，1994，15：143.
收稿日期：1997年元月26日
修稿日期：1998年元月23日, 百拇医药
单位：孙宝君 黄念秋 解放军总医院(北京100853)；范 明 刘淑红 甘思德 军事医学科学院基础医学研究所；王瑞红 北京师范大学生物系
关键词：钙调素；哮喘；维拉帕米
中国病理生理杂志990122 摘 要 目的和方法：给致敏豚鼠吸入卵蛋白建立速发型过敏性哮喘的动物模型，观察呼吸系总阻抗(respiratory impedance, RI)及豚鼠支气管平滑肌钙调素(CaM)活性的变化。结果：哮喘组RI明显高于正常组(P<0.01),支气管平滑肌CaM活性低于正常组(P<0.05),山莨菪碱(654-2)有增加支气管平滑肌CaM活性的作用，异搏定对其无影响。结论：支气管平滑肌CaM活性下降在哮喘的发病过程中起重要作用。
The role of calmodulin in the pathogenesis of allergic asthma in guinea pig
, http://www.100md.com
SUN Bao-Jun, HUANG Nian-Qiu, FAN Ming, WANG Rui-Hong, LIU Shu-Hong, GAN Si-De
The General Hospital of PLA, Beijing(100853)
Abstract AIM and METHODS:The immediate-type allergic asthma animal model was established in sensitized guinea pigs by inhalation with ovalbumin. Respiratory impedance (RI) and the calmodulin activity in bronchial smooth muscle were observed.RESULTS:RI was increased (P<0.01), while calmodulin activity in brochial smooth muscle was decreased (P<0.05) in asthma group than that in normal group. Anisodamin(654-2) can increase calmodulin activity in bronchial smooth muscle. Verapamil has no effect on it. CONCLUSION: The decrease of calmodulin activity in bronchial smooth muscle may play an important role in the pathogenesis of the allergic asthma.
, http://www.100md.com
MeSH Calmodulin; Asthma; Verapamil
哮喘是一种常见、多发病，其发病机理复杂，目前还不完全清楚。已知哮喘的许多病理环节都与钙(Ca2+)密切相关，而钙调素(CaM)是胞内Ca2+的主要受体，参与许多细胞功能的调节，在哮喘的发病过程中可能起重要作用。本文初步观察了支气管平滑肌CaM活性的变化，从分子水平探讨哮喘的发病机理，为临床防治提供新的途径。
材料和方法
一、动物及分组：
雄性，杂色豚鼠，4月龄，体重380～450g，随机分为4组：生理盐水(NS)对照组、哮喘组、654-2+哮喘组、异搏定+哮喘组。
二、哮喘动物模型的复制：
, http://www.100md.com
先向豚鼠腹腔内注射质量分数为10%卵蛋白生理盐水1mL致敏，NS对照组腹腔注射生理盐水1 mL。两周后用25%乌拉坦1 200 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。将一充满生理盐水的塑料管插入动物食道中下1/3处，另一端接压力传感器，然后气管切开，气管插管定时接空气阻力管，用RM 6 200四导生理记录仪记录基础食道压及呼吸流速。
1.NS对照组(NS control)：用超声雾化器经气管插管持续喷雾生理盐水5 min，并于雾化后即刻、5、10、15 min时记录食道压及呼吸流速。在15 min时，当各项指标记录完毕，立即断头处死动物，取肺组织置于-30℃保存。
2.哮喘组(Asthma)：经气管插管持续雾化吸入新配制的2%卵蛋白生理盐水溶液5 min，余同NS对照组。
3.654-2+哮喘组(654-2+Asthma)：在抗原吸入前5 min腹腔注射654-2(10 mg/kg)，余同哮喘组。
, http://www.100md.com
4.异搏定+哮喘组(Verapamil+Asthma)：在抗原吸入前5 min腹腔注射异搏定(500 μg/kg)，余同哮喘组。
呼吸系总阻抗(RI)=食道内压/呼吸流速(kPa/mL*s-1)。
三、支气管平滑肌CaM活性的测定：
肺组织冰冻切片用1∶1甲醇-丙酮溶液固定后，用1×10-4 mol/L三氟拉嗪着色15 min,253 nm紫光照射20min，用0.1 mol/L无钙PBS冲洗后，在荧光显微镜下观察(激发光400～450 nm),用荧光分光光度计测定支气管平滑肌的荧光强度。并以对照组为基础值计算CaM的相对活性[1]。4组动物数分别为9、8、8、7只。每个标本随机取5个视野。表2中n为视野数。
四、统计学分析：
, 百拇医药
用一元单方F检验和Q检验。
结 果
一、呼吸系统总阻抗的变化：
NS对照组各时点RI均无变化，除基础值外，各时点均极显著低于哮喘组。吸入抗原后，哮喘组RI即达到最高值，以后逐渐下降，各时点RI均极显著高于基础值。654-2+哮喘组各时点RI均增加，但仍极显著低于哮喘组。异搏定+哮喘组各时点RI均增加，0 min时高于NS对照组(P<0.01)，但均明显低于哮喘组(见表1)。
二、支气管平滑肌CaM活性的变化：
NS对照组及654-2+哮喘组CaM活性显著高于哮喘组(P<0.05和P<0.01)，异搏定+哮喘组与哮喘组差异无显著，但明显低于654-2+哮喘组(见表2)。
表1 呼吸系总阻抗的变化
, 百拇医药
Tab 1 Change in respiratory impedance(kPa·mL-1·s-1,
±s) Groupn
Base
0
5
10
15(min)
NS control
9
0.215±0.026
, 百拇医药
0.219±0.02**
0.218±0.02**
0.219±0.023**
0.221±0.025**
Asthma
8
0.215±0.016
0.410±0.030△△
0.379±0.031△△
0.351±0.025△△
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0.324±0.020△
654-2+asthma
8
0.211±0.012
0.269±0.013**△
0.271±0.014**△△
0.252±0.016**
0.239±0.021*
Verapamil+asthma
7
, 百拇医药
0.221±0.012
0.322±0.028*△
0.276±0.031*
0.269±0.030*
0.238±0.027*
P<0.05， P<0.01, vs asthma; △ P<0.05, △△ P<0.01, vs base in the same group表2 支气管平滑肌CaM活性(荧光强度)变化
Tab 2 Activity of CaM in bronchial smooth muscle (
±s) Group, 百拇医药
n
Activity of CaM
(fluoresence intensity)
NS control
45
100.00±7.67*
Asthma
40
73.09±4.17
654-2+asthma
30
, http://www.100md.com 114.88±6.75**△
Verapamil+asthma
30
82.20±6.88
*P<0.05,**P<0.01,vs asthma;
△P<0.05,vs verapamil group； n=No of view讨 论
一、CaM活性变化在哮喘发病机制中的作用：
CaM存在于所有真核细胞中，是一个耐热、性质稳定、无组织及种属特异性多肽，它有四个Ca2+结合位点，正常情况下，其活性随胞内Ca2+浓度而改变。在Ca2+所介导的各种细胞功能中，CaM充当着一个中间媒介即作为细胞内Ca2+受体参与各种细胞功能调节。
, 百拇医药
近年来的研究表明，当细胞内Ca2+浓度升高时，Ca2+与CaM结合形成Ca2+-CaM复合物(即活性CaM)，再结合并激活肌球蛋白轻链激酶(MLCK)，后者使肌球蛋白链(MLC)磷酸化，平滑肌收缩[2]。CaM还可提高钙ATP酶(Ca2+-ATPase)活性[3]，加速Ca2+从细胞内排出，使胞内Ca2+降低，平滑肌舒张。因此CaM具有收缩和舒张平滑肌的双重作用。哮喘发作15 min时，支气管平滑肌CaM活性下降，说明此时CaM的变化可能影响了平滑肌的舒张过程，因为CaM活性下降使Ca2+-ATPase活性下降，胞内Ca2+排出减少，胞内Ca2+浓度仍高，平滑肌不能舒张。这一点在我们的实验中已得到证实[4]。
二、654-2、异搏定对CaM活性的影响：
, http://www.100md.com
近年来的研究表明，654-2具有多项药理作用，杨国栋等研究结果显示调微Ⅰ号(莨菪类药物)，不仅可直接增加红细胞膜Ca2+-ATPase活性，也可通过CaM的激活作用增加Ca2+-ATPase的活性。我们的实验结果表明，654-2+哮喘组各时点RI值均明显低于哮喘组，CaM活性则明显高于哮喘组，进一步说明CaM在哮喘发病过程中可能起一定作用。也说明654-2有增加CaM活性的作用，其对哮喘的预防作用可能与此有关。
异搏定+哮喘组各时点RI均低于哮喘组，CaM活性与哮喘组差异不显著，但仍低于NS对照组。说明异搏定对支气管平滑肌CaM活性无影响，这似乎从另一个角度说明CaM活性的变化可能在哮喘发病过程中起重要作用。
参考文献
1 You Jinsong, Li Suwen, Wang Duanshun, et al. The distribution of calmodulin and Ca2+-activated calmodulin in cell cycle of mouse erythroleukemia cells. Cell Res, 1990, 1:89.
, http://www.100md.com
2 Triggle DJ. Calcium, the control of smooth muscle function and bronchial hyperreactivity. Allergy, 1983:38.1.
3 文充镒，张志明，胡蓓主编.钙与钙调素.化学工业出版社，1989.91～92.
4 孙宝君，黄念秋，董伟，等.钙ATP酶在豚鼠过敏性哮喘发病过程中的作用.军医进修学院学报，1994，15：143.
收稿日期：1997年元月26日
修稿日期：1998年元月23日, 百拇医药