SHR血浆NPY、主动脉平滑肌细胞NPY受体的变化及药物的干预作用
作者：曾春雨 刘光耀 王旭开 王宝文
单位：第三军医大学附属大坪医院心内科 (重庆 400042)
关键词：受体；神经肽Y；平滑肌；高血压；自发性
中国病理生理杂志990120 摘 要 目的：观察自发性高血压大鼠(SHR)血浆神经肽Y(NPY)、血管平滑肌细胞(VSMC)NPY受体的变化及美托洛尔、培哚普利干预的影响。方法：用放射免疫分析法和受体放射配体结合分析法测定血浆NPY及VSMC上NPY受体密度的变化。结果：SHR血浆NPY含量明显高于WKY，血压的高低与血浆NPY的量呈明显的正相关。培哚普利降压的同时亦降低SHR血浆NPY的量，而美托洛尔对NPY量则无影响；培哚普利引起NPY受体密度上调，而美托洛尔则使NPY受体下调。结论：NPY在高血压的发生、发展中可能起到重要的作用；在培哚普利的降压作用中可能有血浆NPY含量下降这一因素参与，美托洛尔致NPY受体密度下调可能在预防主动脉管壁结构重建中发挥着一定的作用。
, 百拇医药
Studies on the plasma NPY levels,the distribution of NPY receptor
on aortic vascular smooth muscle cells in SHR
ZENG Chun-Yu,LIU Guang-Yao,WANG Xu-Kai,WANG Bao-Wen
Hypertension Center and Department of Cardiology,Daping
Hospital,the Third Military Medical University,Chongqing(400042)
Abstract AIM：To investigate the changes of plasma neuropeptide Y (NPY) levels, the NPY receptors on aortic vascular smooth muscle cells and the effects of perindopril,metoprolol upon spontaneuosly hypertensive rats(SHR).METHODS：NPY plasma levels and receptors were detected by radioimmunoassay and radioligand binding assay.RESULTS:Plasma NPY levels were significantly higher in SHR than that in Wistar-Kyoto rats(WKY);There was a close relationship between the height of blood pressure and plasma NPY levels.Perindopril could markedly inhibit release of NPY through the prejunctional facilitary angiotensin Ⅱ receptors,while the metoprolol could not.Perindopril induced upregulation of NPY receptor density;metoprolol induced downregulation of NPY receptor density.CONCLUSIONS：NPY might be involved in the pathogenesis of hypertension,the decrease of NPY levels might be involved in the antihypertensive mechanism of perindopril.Metoprolol induced downregulation of NPY receptor density,which might play an important role in the prevention of hypertrophy of vascular smooth muscle cells.
, 百拇医药
MeSH Receptor;Neuropeptide Y;Muscle,smooth;Hypertension
神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)是含有36个氨基酸的多肽，在外周常与去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)共有于交感神经末梢，密集支配心脏和血管，在心血管系统生理调节和疾病发展过程中具有重要的意义。本实验以WKY、SHR为研究对象，对比观察药物干预后血浆NPY和主动脉血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMC)上NPY受体的变化，探索NPY及其受体在高血压发病学中的作用及药物降压作用中的可能机制。
材料与方法
一、实验对象：
分别将3月龄自发性高血压大鼠(spontan-eously hypertensive rats,SHR)、Wistar-Kyoto大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)(北京阜外医院动物所提供)随机分成4组[WKY对照组、SHR对照组、培哚普利(perindopril,PER)干预组、美托洛尔(metoprolol,MET)干预组]，每组6只，雌雄各半，4组动物体重、年龄、性别无明显差异，SHR血压显著高于WKY(P<0.01)，SHR各组之间相差无显著(表1)。
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在室温为25～30 ℃的动物室内，分组的SHR、WKY单笼饲养，PER[1]、MET[2]分别以2 mg/kg、25 mg/kg的剂量加入饲料中每天给药1次，对照组饲以相同剂量的淀粉，共饲养2个月，鼠尾测压仪(中日友好医院产)监测血压的变化，为使大鼠适应测压过程的刺激，每周至少测压2～3次，取材前1天最后1次测量血压，次日上午10：00左右戊烷巴比妥钠(0.3 mg/kg,iv)麻醉后心内穿刺抽取血液2 mL，注入加有10% EDTA 20 μL、抑肽酶10 kIU的聚丙烯试管内，立即置于冰浴中，在4℃、3 000 r/min下离心15 min，取上清液贮存于-20℃冰箱中待测。剖腹取出主动脉，依照我实验室建立的复合胶原酶法[3]消化、分离、鉴定收集VSMC，加入冻存液，液氮中保存备用。
二、方法：
1.125I-NPY的制备[4]：用Iodogen法标记、Sep-pakC18柱分离NPY的标记物，本实验碘利用率70%、标记比活度3.367 mBq/μg、游离碘<5%，使用前放免缓冲液(内含0.3%BSA、EDTA 0.01mol/L、0.2%NaN3的0.05mol/L，pH7.4磷酸缓冲液)稀释成所需的用量。
, 百拇医药
2.NPY放免分析：取上清液100 μL，置离心浓缩机抽干，用放免缓冲液100 μL重建，加入兔抗猪 NPY抗血清(Penisula公司)100 μL在4℃下孵育24 h后加入125I-NPY100 μL(104 counts*min-1)，再在4℃下孵育24 h，加入羊抗兔血清(1∶50)100 μL，混匀后，室温下静置4～6 h，4℃、3 000 r/min下离心20 min，取沉淀作γ计数，再根据同时制备的标准曲线(NPY标准品由Sigma公司产)确定NPY含量，该放免分析法检测范围为1.95 pmol/L～39 pmol/L、非特异性吸附率<0.5%、批间、批内变异系数、样品回收率及稀释试验的误差均在10%以内，与ACTH、TSH、AⅡ之间无交叉反应。
3.NPY受体的放射配基结合分析：缓冲液将VSMC调整成1.5×109 cells/L的浓度，加入Doff管，取1 mL此悬液加入不同浓度的125I-NPY，混匀，37℃下保温1 h，用1 mL 0～4 ℃冷缓冲液终止反应，2 500 ×g离心5 min，弃上清液，再用0～4 ℃缓冲液1 mL冲洗2次，以除去游离状态的125I-NPY，Doff管带沉淀部分被剪掉后加入γ计数器内计数，测counts*min-1值，得总结合，细胞悬液中加入相同浓度的125I-NPY和1 μm的NPY作为非特异性结合管，用Scatchard作图求出最大结合容量(Bmax)和平衡常数(Kd)。
, 百拇医药
三、数据处理：
数据均以均数±标准差(x±s)表示，差异显著性以t检验判定。
结 果
放免分析测定WKY、SHR血浆NPY含量见表2，SHR心率、血压及NPY含量均明显高于WKY(P<0.01)；相关分析显示血压与血浆NPY含量呈正相关(r＝0.606，P<0.01)；PER、MET均可明显降低血压(P<0.01)，PER在降压的同时可降低SHR血浆NPY含量(P<0.01)，MET则不影响血浆NPY的含量(P>0.05)。
受体放射分析测定VSMC上NPY受体的情况(表3)，SHR的Bmax和Kd均明显高于WKY；MET长期饲养大鼠可使SHR Bmax、Kd下降，而对WKY则无显著影响，PER则可使SHR的Bmax、Kd上升。
表1 各组SHR、WKY血压和体重比较
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Tab 1 Comparison of blood pressure,body weight between SHR and WKY (
±s，n＝6)
WKY
SHR
PER treated
MET treated
Systolic blood pressure (kPa)
18.80±0.80
28.93±1.3**
, 百拇医药 29.07±1.07**
29.73±0.8**
Weight(g)
243.40±34.21
257.67±47.23
262.74±57.17
249.17±57.40
**P<0.01,vs WKY;PER＝perindopril;MET＝metoprolol表2 药物干预对血浆NPY含量的影响
Tab 2 The effects of drugs on plasma NPY levels (±s，n＝6)
, 百拇医药
WKY
SHR
PER treated
MET treated
Systolic blood pressure(kPa)
18.80±0.80
28.93±1.33△△
29.07±1.07**
29.73±0.80**
Heart rate(beats/min)
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376±11
423±10△△
407±14*
381±9**
Plasma NPY levels (pmol/L)
743±22
1232±62△△
873±55**
1167±51
*P<0.05，**P<0.01， vs SHR;△△P<0.01， vs WKY表3 药物干预对NPY受体的影响
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Tab 3 The effects of drugs on NPY receptors(±s，n＝6)
WKY
SHR
PER treated
MET treated
Bmax(binding sites/cell)
176059±69513
456172±36074△△
581789±47682**
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328419±54337**
Kd(pmol/L)
19.91±2.54
37.22±4.22△△
47.26±5.45*
30.68±4.52*
*P<0.05， **P<0.01, vs SHR; △△ P<0.01, vs WKY讨 论
本实验发现SHR血浆NPY含量明显高于WKY，而且相关分析显示血压与血浆NPY含量呈正相关，提示NPY在高血压的发生、发展过程中可能起重要作用。以往的研究工作表明NPY不仅可通过直接或间接的作用收缩血管，提高外周血管阻力[5]，而且它可能促进VSMC的增殖[6]，在原发性高血压发病机制中占有一定的地位。
, 百拇医药
NPY、NE互为共递质，共存于交感神经末梢并一同分泌。目前已发现NE的释放受到交感神经突触前膜受体的影响，激动突触前膜血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)受体、β受体可促进NE的释放[7]，血管紧张素转化酶抑制剂可以通过抑制AngⅡ的产生而抑制NE释放，但关于NE的共递质NPY的影响途径目前尚缺乏研究。本实验分别利用MET、PER长期饲养SHR，观察两种药物在降压的同时对血浆NPY含量的影响，结果发现PER干预后SHR血浆NPY含量明显下降，说明突触前触AngⅡ受体对NPY的分泌可能有一定的影响，同时也提示PER降压机理中可能有NPY含量减少这一因素的参与；MET对SHR血NPY含量无明显影响，这与以往观察到的MET可降低血浆NE的结论不一致，说明NPY虽然与NE共递质，但二者分泌的正负调节通路不尽相同。
受体测定显示SHR VSMC上NPY受体密度明显高于WKY，亲和力则略有下降，说明了遗传学在高血压发病学中的重要地位。PER长期饲养SHR可以使NPY受体密度明显增加，推测这可能是由于PER抑制了NPY的释放，使NPY受体密度上调所致。本实验已证实MET并不影响NPY的分泌，因此MET干预后NPY受体的下降难以用NPY的同种特异性调节来解释，提示MET可能通过β受体发挥异种特异性调节，从而对NPY受体产生某种程度的影响。
, 百拇医药
参考文献
1 Devlin AM,Gordon JF,Davidson AO,et al.The effects of perindopril on vascular smooth muscle polypoidy in stroke-prone spontaneously hypertensive rats.J Hypertens,1995,13:211.
2 Rutan GH,Feig TU,May S,et al.A comparison of once daily atenolol and and metoprolol using office and ambulatory blood pressure monitoring.J Clin Pharmacol,1993,33:418.
3 王旭开，刘光耀，杨成明，等.复合胶原酶法分离人血管平滑肌细胞的新方法.第三军医大学学报，1993，15：357.
, 百拇医药
4 Sheikh SP,O'Hare MMT,Tortora O,et al.Binding of monoiodinated neuropeptide Y to hippocampal membranes and human neuroblastoma cell lines.J Biol Chem,1989,264:6648.
5 McDermott BJ,Millar BC, Piper HM.Cardiovascular effects of neuropeptide Y:receptor interaction and cellular mechanism.Cardiovasc Res,1993,27:893.
6 Zukowska-Grojec Z,Pruszczyk P,Colton C,et al.Mitogenic effects of neuropeptide Y in rat vascular smooth muscle cell.Peptides,1993,14:263.
7 Majewski H,Hedler L,Schurr C,et al.Modulation of noradrenaline release in the pithed rabbit:a role of angiotensin.J Cardiovasc Pharmarcol,1984,6:888.
收稿日期：1997年元月9日
修稿日期：1997年9月3日, 百拇医药
单位：第三军医大学附属大坪医院心内科 (重庆 400042)
关键词：受体；神经肽Y；平滑肌；高血压；自发性
中国病理生理杂志990120 摘 要 目的：观察自发性高血压大鼠(SHR)血浆神经肽Y(NPY)、血管平滑肌细胞(VSMC)NPY受体的变化及美托洛尔、培哚普利干预的影响。方法：用放射免疫分析法和受体放射配体结合分析法测定血浆NPY及VSMC上NPY受体密度的变化。结果：SHR血浆NPY含量明显高于WKY，血压的高低与血浆NPY的量呈明显的正相关。培哚普利降压的同时亦降低SHR血浆NPY的量，而美托洛尔对NPY量则无影响；培哚普利引起NPY受体密度上调，而美托洛尔则使NPY受体下调。结论：NPY在高血压的发生、发展中可能起到重要的作用；在培哚普利的降压作用中可能有血浆NPY含量下降这一因素参与，美托洛尔致NPY受体密度下调可能在预防主动脉管壁结构重建中发挥着一定的作用。
, 百拇医药
Studies on the plasma NPY levels,the distribution of NPY receptor
on aortic vascular smooth muscle cells in SHR
ZENG Chun-Yu,LIU Guang-Yao,WANG Xu-Kai,WANG Bao-Wen
Hypertension Center and Department of Cardiology,Daping
Hospital,the Third Military Medical University,Chongqing(400042)
Abstract AIM：To investigate the changes of plasma neuropeptide Y (NPY) levels, the NPY receptors on aortic vascular smooth muscle cells and the effects of perindopril,metoprolol upon spontaneuosly hypertensive rats(SHR).METHODS：NPY plasma levels and receptors were detected by radioimmunoassay and radioligand binding assay.RESULTS:Plasma NPY levels were significantly higher in SHR than that in Wistar-Kyoto rats(WKY);There was a close relationship between the height of blood pressure and plasma NPY levels.Perindopril could markedly inhibit release of NPY through the prejunctional facilitary angiotensin Ⅱ receptors,while the metoprolol could not.Perindopril induced upregulation of NPY receptor density;metoprolol induced downregulation of NPY receptor density.CONCLUSIONS：NPY might be involved in the pathogenesis of hypertension,the decrease of NPY levels might be involved in the antihypertensive mechanism of perindopril.Metoprolol induced downregulation of NPY receptor density,which might play an important role in the prevention of hypertrophy of vascular smooth muscle cells.
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MeSH Receptor;Neuropeptide Y;Muscle,smooth;Hypertension
神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)是含有36个氨基酸的多肽，在外周常与去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)共有于交感神经末梢，密集支配心脏和血管，在心血管系统生理调节和疾病发展过程中具有重要的意义。本实验以WKY、SHR为研究对象，对比观察药物干预后血浆NPY和主动脉血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMC)上NPY受体的变化，探索NPY及其受体在高血压发病学中的作用及药物降压作用中的可能机制。
材料与方法
一、实验对象：
分别将3月龄自发性高血压大鼠(spontan-eously hypertensive rats,SHR)、Wistar-Kyoto大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)(北京阜外医院动物所提供)随机分成4组[WKY对照组、SHR对照组、培哚普利(perindopril,PER)干预组、美托洛尔(metoprolol,MET)干预组]，每组6只，雌雄各半，4组动物体重、年龄、性别无明显差异，SHR血压显著高于WKY(P<0.01)，SHR各组之间相差无显著(表1)。
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在室温为25～30 ℃的动物室内，分组的SHR、WKY单笼饲养，PER[1]、MET[2]分别以2 mg/kg、25 mg/kg的剂量加入饲料中每天给药1次，对照组饲以相同剂量的淀粉，共饲养2个月，鼠尾测压仪(中日友好医院产)监测血压的变化，为使大鼠适应测压过程的刺激，每周至少测压2～3次，取材前1天最后1次测量血压，次日上午10：00左右戊烷巴比妥钠(0.3 mg/kg,iv)麻醉后心内穿刺抽取血液2 mL，注入加有10% EDTA 20 μL、抑肽酶10 kIU的聚丙烯试管内，立即置于冰浴中，在4℃、3 000 r/min下离心15 min，取上清液贮存于-20℃冰箱中待测。剖腹取出主动脉，依照我实验室建立的复合胶原酶法[3]消化、分离、鉴定收集VSMC，加入冻存液，液氮中保存备用。
二、方法：
1.125I-NPY的制备[4]：用Iodogen法标记、Sep-pakC18柱分离NPY的标记物，本实验碘利用率70%、标记比活度3.367 mBq/μg、游离碘<5%，使用前放免缓冲液(内含0.3%BSA、EDTA 0.01mol/L、0.2%NaN3的0.05mol/L，pH7.4磷酸缓冲液)稀释成所需的用量。
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2.NPY放免分析：取上清液100 μL，置离心浓缩机抽干，用放免缓冲液100 μL重建，加入兔抗猪 NPY抗血清(Penisula公司)100 μL在4℃下孵育24 h后加入125I-NPY100 μL(104 counts*min-1)，再在4℃下孵育24 h，加入羊抗兔血清(1∶50)100 μL，混匀后，室温下静置4～6 h，4℃、3 000 r/min下离心20 min，取沉淀作γ计数，再根据同时制备的标准曲线(NPY标准品由Sigma公司产)确定NPY含量，该放免分析法检测范围为1.95 pmol/L～39 pmol/L、非特异性吸附率<0.5%、批间、批内变异系数、样品回收率及稀释试验的误差均在10%以内，与ACTH、TSH、AⅡ之间无交叉反应。
3.NPY受体的放射配基结合分析：缓冲液将VSMC调整成1.5×109 cells/L的浓度，加入Doff管，取1 mL此悬液加入不同浓度的125I-NPY，混匀，37℃下保温1 h，用1 mL 0～4 ℃冷缓冲液终止反应，2 500 ×g离心5 min，弃上清液，再用0～4 ℃缓冲液1 mL冲洗2次，以除去游离状态的125I-NPY，Doff管带沉淀部分被剪掉后加入γ计数器内计数，测counts*min-1值，得总结合，细胞悬液中加入相同浓度的125I-NPY和1 μm的NPY作为非特异性结合管，用Scatchard作图求出最大结合容量(Bmax)和平衡常数(Kd)。
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三、数据处理：
数据均以均数±标准差(x±s)表示，差异显著性以t检验判定。
结 果
放免分析测定WKY、SHR血浆NPY含量见表2，SHR心率、血压及NPY含量均明显高于WKY(P<0.01)；相关分析显示血压与血浆NPY含量呈正相关(r＝0.606，P<0.01)；PER、MET均可明显降低血压(P<0.01)，PER在降压的同时可降低SHR血浆NPY含量(P<0.01)，MET则不影响血浆NPY的含量(P>0.05)。
受体放射分析测定VSMC上NPY受体的情况(表3)，SHR的Bmax和Kd均明显高于WKY；MET长期饲养大鼠可使SHR Bmax、Kd下降，而对WKY则无显著影响，PER则可使SHR的Bmax、Kd上升。
表1 各组SHR、WKY血压和体重比较
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Tab 1 Comparison of blood pressure,body weight between SHR and WKY (
±s，n＝6)WKY
SHR
PER treated
MET treated
Systolic blood pressure (kPa)
18.80±0.80
28.93±1.3**
, 百拇医药 29.07±1.07**
29.73±0.8**
Weight(g)
243.40±34.21
257.67±47.23
262.74±57.17
249.17±57.40
**P<0.01,vs WKY;PER＝perindopril;MET＝metoprolol表2 药物干预对血浆NPY含量的影响
Tab 2 The effects of drugs on plasma NPY levels (
±s，n＝6), 百拇医药
WKY
SHR
PER treated
MET treated
Systolic blood pressure(kPa)
18.80±0.80
28.93±1.33△△
29.07±1.07**
29.73±0.80**
Heart rate(beats/min)
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376±11
423±10△△
407±14*
381±9**
Plasma NPY levels (pmol/L)
743±22
1232±62△△
873±55**
1167±51
*P<0.05，**P<0.01， vs SHR;△△P<0.01， vs WKY表3 药物干预对NPY受体的影响
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Tab 3 The effects of drugs on NPY receptors(
±s，n＝6)WKY
SHR
PER treated
MET treated
Bmax(binding sites/cell)
176059±69513
456172±36074△△
581789±47682**
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328419±54337**
Kd(pmol/L)
19.91±2.54
37.22±4.22△△
47.26±5.45*
30.68±4.52*
*P<0.05， **P<0.01, vs SHR; △△ P<0.01, vs WKY讨 论
本实验发现SHR血浆NPY含量明显高于WKY，而且相关分析显示血压与血浆NPY含量呈正相关，提示NPY在高血压的发生、发展过程中可能起重要作用。以往的研究工作表明NPY不仅可通过直接或间接的作用收缩血管，提高外周血管阻力[5]，而且它可能促进VSMC的增殖[6]，在原发性高血压发病机制中占有一定的地位。
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NPY、NE互为共递质，共存于交感神经末梢并一同分泌。目前已发现NE的释放受到交感神经突触前膜受体的影响，激动突触前膜血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)受体、β受体可促进NE的释放[7]，血管紧张素转化酶抑制剂可以通过抑制AngⅡ的产生而抑制NE释放，但关于NE的共递质NPY的影响途径目前尚缺乏研究。本实验分别利用MET、PER长期饲养SHR，观察两种药物在降压的同时对血浆NPY含量的影响，结果发现PER干预后SHR血浆NPY含量明显下降，说明突触前触AngⅡ受体对NPY的分泌可能有一定的影响，同时也提示PER降压机理中可能有NPY含量减少这一因素的参与；MET对SHR血NPY含量无明显影响，这与以往观察到的MET可降低血浆NE的结论不一致，说明NPY虽然与NE共递质，但二者分泌的正负调节通路不尽相同。
受体测定显示SHR VSMC上NPY受体密度明显高于WKY，亲和力则略有下降，说明了遗传学在高血压发病学中的重要地位。PER长期饲养SHR可以使NPY受体密度明显增加，推测这可能是由于PER抑制了NPY的释放，使NPY受体密度上调所致。本实验已证实MET并不影响NPY的分泌，因此MET干预后NPY受体的下降难以用NPY的同种特异性调节来解释，提示MET可能通过β受体发挥异种特异性调节，从而对NPY受体产生某种程度的影响。
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参考文献
1 Devlin AM,Gordon JF,Davidson AO,et al.The effects of perindopril on vascular smooth muscle polypoidy in stroke-prone spontaneously hypertensive rats.J Hypertens,1995,13:211.
2 Rutan GH,Feig TU,May S,et al.A comparison of once daily atenolol and and metoprolol using office and ambulatory blood pressure monitoring.J Clin Pharmacol,1993,33:418.
3 王旭开，刘光耀，杨成明，等.复合胶原酶法分离人血管平滑肌细胞的新方法.第三军医大学学报，1993，15：357.
, 百拇医药
4 Sheikh SP,O'Hare MMT,Tortora O,et al.Binding of monoiodinated neuropeptide Y to hippocampal membranes and human neuroblastoma cell lines.J Biol Chem,1989,264:6648.
5 McDermott BJ,Millar BC, Piper HM.Cardiovascular effects of neuropeptide Y:receptor interaction and cellular mechanism.Cardiovasc Res,1993,27:893.
6 Zukowska-Grojec Z,Pruszczyk P,Colton C,et al.Mitogenic effects of neuropeptide Y in rat vascular smooth muscle cell.Peptides,1993,14:263.
7 Majewski H,Hedler L,Schurr C,et al.Modulation of noradrenaline release in the pithed rabbit:a role of angiotensin.J Cardiovasc Pharmarcol,1984,6:888.
收稿日期：1997年元月9日
修稿日期：1997年9月3日, 百拇医药