杂色曲霉素诱导体外培养人外周血淋巴细胞凋亡的研究*
作者：曹文军 孙旭明 张祥宏 严 霞 王俊灵 王凤荣
单位：孙旭明 张祥宏 严 霞 王俊灵 王凤荣 河北医科大学基础医学研究所病理室(石家庄 050017)；曹文军 首都医科大学病理解剖学教研室(北京 100054)
关键词：流式细胞术；人类；淋巴细胞
中国病理生理杂志990110 摘 要 目的：研究我国肿瘤高发区饮食污染霉菌毒素-杂色曲霉素(ST)对人免疫机能的可能影响。方法：流式细胞术(flow cytometry, FCM)、形态学观察及DNA电泳。结果：ST可诱导体外培养的人外周血淋巴细胞发生凋亡，并且在一定时间(2～48 h)及剂量(0.125～2.0 mg/L)范围内呈正相关关系。光镜及透射电镜观察均发现了凋亡细胞典型的形态学变化，如核染色质凝集边集，凋亡小体形成等；DNA琼脂糖凝胶电泳也出现特征性的DNA Ladder条带。结论：ST可诱导人外周血淋巴细胞发生凋亡，从而可能在一定程度上影响机体的免疫机能。
, 百拇医药
Effects of sterigmatocystin on apoptosis of human
peripheral blood lymphocytes in vitro
CAO Wen-Jun, SUN Xu-Ming, ZHANG Xiang-Hong, YAN Xia,WANG Jun-Ling, WANG Feng-Rong
Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang (050017)
Abstract AIM:To explore the possible impacts of sterigmatocystin (ST) on human immunological system. METHODS:Flow cytometric (FCM) analysis, morphological observation and DNA electrophoresis. RESULTS:FCM analysis revealed that the apoptotic rates of all the lymphocytes in ST treated groups were significantly higher than those in their corresponding control groups. Significant dose-effect and time-effect correations could be found between apoptotic rates and ST concentrations in the range from 0.125 mg/L to 2 mg/L as well as ST treating time from 2 h to 48 h in the same concentrations (2 mg/L). Further works showed that under light and electron microscope, chromatin condensation and margination alongside nuclear membrane, nuclear membrane disintegration, nuclear fragmentation as well as apoptotic bodies were found in ST treated cells in semi-ultrathin and ultrathin sections. While in agarosegel electrophoresis, a characteristic “ladder” pattern caused by products of DNA degradation was also found in ST treated cells. CONCLUSION:ST could induce apoptosis in human peripheral blood lymphocytes in vitro. Thus it might have some negetive impacts on human immunity.
, 百拇医药
MeSH Flow cytometry; Human; Lymphocytes
杂色曲霉素(sterigmatocystin, ST)是我国恶性肿瘤高发区居民饮食中污染率较高的一种致癌性霉菌毒素[1～4]。为探讨ST对恶性肿瘤高发区人群免疫机能的影响，本研究以流式细胞术(flow cytometry, FCM)、形态学观察及分子生物学分析相结合的方法，研究了ST对体外培养的人外周血淋巴细胞凋亡的影响。
材料与方法
(一)淋巴细胞的分离与培养：以人淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)分离健康献血员外周血淋巴细胞，在以生理盐水洗去分离液后，加入含15%小牛灭活血清、青霉素1×105 U/L、链霉素100 mg/L和PHA 25 mg/L的RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)，调整培养淋巴细胞浓度至4×108细胞/L，接种于25 mL螺口培养瓶中，置37℃、含体积分数为5%CO2恒温箱中培养。
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(二)实验分组及处理：淋巴细胞体外培养48 h后，以不含PHA的新培养液更换含PHA的培养液，将培养瓶随机分组。分别进行下列实验：实验Ⅰ 实验组加入终浓度2 mg/L的ST(SIGMA)溶液，相应对照组加入等量生理盐水；分别在毒素处理第2、4、6、12、24、36、48及72 h各收集2瓶细胞，PBS离心洗涤，体质分数为70%乙醇固定。实验Ⅱ 实验组加入不同剂量的ST溶液，使其终浓度分别为0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L，每一浓度4瓶；相应对照组分别加入与上述各浓度组ST溶解液等量的生理盐水；分别在ST处理后第6及24 h，每一浓度组和对照组各收集细胞2瓶，PBS离心洗涤，体质分数为70%乙醇固定，置于4℃冰箱保存，待制样进行FCM检测。另取ST 2.0mg/L处理6及24 h的实验及对照组细胞，制备电镜及DNA样品。实验Ⅰ重复3次，实验Ⅱ重复2次。
(三)细胞DNA含量的定量检测及分析：按张祥宏等[5] 的方法制备单细胞悬液及细胞DNA染色，FACS-420型流式细胞仪(美国B.D公司)检测细胞DNA含量，应用DNA单组方图统计软件进行资料处理，以出现DNA亚二倍体峰作为细胞凋亡标志，计算凋亡细胞百分率。以POMS统计软件进行统计学处理。
, 百拇医药
(四)形态学观察：取ST 2.0mg/L处理6及24h的实验及对照细胞，常规方法制备电镜样品。分别切取1μm半薄切片和50nm超薄切片，0.15%甲苯胺蓝染色和铀-铅染色，光镜及H-500透射电镜(日本日立公司)观察细胞的形态变化。
(五)细胞DNA琼脂糖凝胶电泳：取ST 2.) mg/L处理6及24h的实验及对照细胞，常规方法提取细胞DNA，溶于10 μL TE缓冲液中；1×TAE电泳缓冲液，1%琼脂糖凝胶，恒压30～40 V电泳2 h，EB 5 mg/L染色后，观察DNA泳动带型，紫外透射摄影。
结 果
一、FCM检测结果：
(一)ST处理不同时间对淋巴细胞凋亡的影响：
由表1可见，经ST处理后，淋巴细胞凋亡率比对照组明显升高；随处理时间的延长，细胞凋亡率呈逐渐增高趋势，细胞凋亡率和处理时间的延长，细胞凋亡率呈逐渐增高趋势，细胞凋亡率和处理时间在2～48h呈明显正相关关系(r=0.9629,P<0.01)。
, 百拇医药
(二)不同浓度的ST对淋巴细胞凋亡率的影响：
在ST 0.125～1.0 mg/L浓度范围内作用6h及24h，淋巴细胞凋亡率随ST浓度增加有不同程度的增高，呈明显量效关系(6 h:r=0.7788,P<0.01;24h：r=0.9827,P<0.01)(图1)
Fig 1 Apoptosis of lymphocytes after 6 h of ST treatment (
+s,n=6)
图1 不同浓度的ST处理6 h后细胞凋亡情况
表1 ST(2 mg/L)处理不同时间后淋巴细胞凋亡率变化
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Tab 1 Changes of apoptotic rates of lymphocytes
in different times after ST treatment (%,±s,n=8) Treating time (h)
Control
ST
2
0
10.90±0.99*
4
0.28±0.34
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15.05±1.97**
6
1.70±0.44
18.20±5.01**
12
5.05±3.61
20.35±11.03**
24
4.12±2.51
22.41±10.73**
36
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1.60±0.57
26.30±2.40*
48
4.60±3.17
34.10±10.61**
72
36.85±2.05
38.55±7.71
*P<0.05，**P<0.01,vs control
二、形态学观察结果：
半薄切片甲苯胺蓝染色可见ST处理组部分淋巴细胞形态不规则，胞膜呈泡状突起，核染色质浓集成团块状，沿核膜周边分布，提示细胞出现凋亡。此外，尚可见个别细胞出现核固缩、核碎裂等坏死性变化。透射电镜观察可见ST处理组部分淋巴细胞表现出具有凋亡特征的变化：核染色质凝集边集，核膜模糊甚至破坏，严重者核碎裂、染色质呈团块状，分散于细胞内，并可见扩张的线粒体及肿胀的内质网；细胞外形极不规则，可见凋亡小体。
, 百拇医药
三、DNA琼脂糖凝胶电泳结果：
ST 2 mg/L处理组淋巴细胞出现了典型的DNA梯形图谱(Ladder条带)，相应时间的对照组细胞DNA无改变，进一步证实了ST处理可诱导淋巴细胞发生凋亡。
讨 论
本研究应用FCM方法定量分析了ST对体外培养人外周血淋巴细胞凋亡的影响。结果表明，杂色曲霉素可诱发和加速人外周血淋巴细胞凋亡的发生，并且在一定的时间(2～48 h)范围内，随ST处理时间的增加，淋巴细胞凋亡百分率亦相应增加。同时，在ST 0.125～1.0 mg/L浓度范围内，淋巴细胞凋亡率随ST浓度增加有不同程度的增高，呈明显量效关系。在FCM检测的基础上，应用形态学及较特异的生物化学方法，观察到凋亡细胞典型的形态及生化改变。本研究结果证明ST可诱导体外培养人外周血淋巴细胞发生凋亡，其机理尚待进一步探讨。
杂色曲霉素是一种致癌性的霉菌毒素，在体外培养条件下，ST对培养细胞有细胞毒性和致突变性，并可诱导人胚胃粘膜细胞及人胚肺细胞发生恶性转化[6～9]。近年来国外研究工作发现某些霉菌毒素，特别是单端孢菌类毒素对动物机体免疫系统有明显影响。本研究结果表明，我国恶性肿瘤高发区居民饮食中污染严重且具明显致突/致癌作用的ST可诱发和加速人外周血淋巴细胞发生凋亡，从而可能影响高发区居民机体的免疫功能，因此应引起高发区肿瘤防治工作者的高度重视。
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*河北省自然科学基金资助
参考文献
1 Zhang Xianghong, Xie Tongxin, Li Shaosen, et al. Preventive detection of fungi and mycotoxins in corn from high risk area of esophageal cancer in Cixian county. Chin J Cancer Res, 1995, 7:172.
2 楼建龙，田禾菁，孟昭赫，等.胃癌肝癌高发区和低发区粮食中杂色曲霉素污染量调查.卫生研究，1995，24：28.
3 孙鹤龄，吴铁铃，苏成玉，等.慢性胃病患者胃液内真菌菌谱.中华肿瘤杂志，1983，5：19.
4 谢同欣，张祥宏，严 霞，等.杂色曲霉素对人胃粘膜的致癌作用.肿瘤防治研究，1996，23：341.
, 百拇医药
5 张祥宏，谢同欣，张中朝，等.杂色曲霉素对体外培养人胚肺成纤维细胞ras p21和超微结构的影响.卫生研究，1997，26：110.
6 高泽立，谢同欣，王凤荣等.胃癌高发区玉米面的致突变研究.肿瘤，1989，9(4)：157.
7 谢同欣，王凤荣，谭少波，等.杂色曲霉素诱发小鼠肺腺癌和腺胃不典型增生.中华肿瘤杂志，1990，12：21.
8 谢同欣，张祥宏，王凤荣，等.胃癌高发区胃癌患者胃液内杂色曲霉提取液的遗传毒性研究.肿瘤，1990，10：4.
9 谢同欣，王凤荣，严 霞，等.杂色曲霉提取液体外对人胚胃细胞的作用.中华医学杂志，1993，73：78.
10 Xie Tongxin, Zhang Xianghong,Yan Xia, et al. Effects of sterigmatocystin on expression of p53 protein and DNA content in human gatric cells in vitro. Chinese Science Bulletin, 1995,40:1568.
收稿日期：1997年12月24日
修稿日期：1998年8月27日, 百拇医药
单位：孙旭明 张祥宏 严 霞 王俊灵 王凤荣 河北医科大学基础医学研究所病理室(石家庄 050017)；曹文军 首都医科大学病理解剖学教研室(北京 100054)
关键词：流式细胞术；人类；淋巴细胞
中国病理生理杂志990110 摘 要 目的：研究我国肿瘤高发区饮食污染霉菌毒素-杂色曲霉素(ST)对人免疫机能的可能影响。方法：流式细胞术(flow cytometry, FCM)、形态学观察及DNA电泳。结果：ST可诱导体外培养的人外周血淋巴细胞发生凋亡，并且在一定时间(2～48 h)及剂量(0.125～2.0 mg/L)范围内呈正相关关系。光镜及透射电镜观察均发现了凋亡细胞典型的形态学变化，如核染色质凝集边集，凋亡小体形成等；DNA琼脂糖凝胶电泳也出现特征性的DNA Ladder条带。结论：ST可诱导人外周血淋巴细胞发生凋亡，从而可能在一定程度上影响机体的免疫机能。
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Effects of sterigmatocystin on apoptosis of human
peripheral blood lymphocytes in vitro
CAO Wen-Jun, SUN Xu-Ming, ZHANG Xiang-Hong, YAN Xia,WANG Jun-Ling, WANG Feng-Rong
Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang (050017)
Abstract AIM:To explore the possible impacts of sterigmatocystin (ST) on human immunological system. METHODS:Flow cytometric (FCM) analysis, morphological observation and DNA electrophoresis. RESULTS:FCM analysis revealed that the apoptotic rates of all the lymphocytes in ST treated groups were significantly higher than those in their corresponding control groups. Significant dose-effect and time-effect correations could be found between apoptotic rates and ST concentrations in the range from 0.125 mg/L to 2 mg/L as well as ST treating time from 2 h to 48 h in the same concentrations (2 mg/L). Further works showed that under light and electron microscope, chromatin condensation and margination alongside nuclear membrane, nuclear membrane disintegration, nuclear fragmentation as well as apoptotic bodies were found in ST treated cells in semi-ultrathin and ultrathin sections. While in agarosegel electrophoresis, a characteristic “ladder” pattern caused by products of DNA degradation was also found in ST treated cells. CONCLUSION:ST could induce apoptosis in human peripheral blood lymphocytes in vitro. Thus it might have some negetive impacts on human immunity.
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MeSH Flow cytometry; Human; Lymphocytes
杂色曲霉素(sterigmatocystin, ST)是我国恶性肿瘤高发区居民饮食中污染率较高的一种致癌性霉菌毒素[1～4]。为探讨ST对恶性肿瘤高发区人群免疫机能的影响，本研究以流式细胞术(flow cytometry, FCM)、形态学观察及分子生物学分析相结合的方法，研究了ST对体外培养的人外周血淋巴细胞凋亡的影响。
材料与方法
(一)淋巴细胞的分离与培养：以人淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)分离健康献血员外周血淋巴细胞，在以生理盐水洗去分离液后，加入含15%小牛灭活血清、青霉素1×105 U/L、链霉素100 mg/L和PHA 25 mg/L的RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)，调整培养淋巴细胞浓度至4×108细胞/L，接种于25 mL螺口培养瓶中，置37℃、含体积分数为5%CO2恒温箱中培养。
, http://www.100md.com
(二)实验分组及处理：淋巴细胞体外培养48 h后，以不含PHA的新培养液更换含PHA的培养液，将培养瓶随机分组。分别进行下列实验：实验Ⅰ 实验组加入终浓度2 mg/L的ST(SIGMA)溶液，相应对照组加入等量生理盐水；分别在毒素处理第2、4、6、12、24、36、48及72 h各收集2瓶细胞，PBS离心洗涤，体质分数为70%乙醇固定。实验Ⅱ 实验组加入不同剂量的ST溶液，使其终浓度分别为0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L，每一浓度4瓶；相应对照组分别加入与上述各浓度组ST溶解液等量的生理盐水；分别在ST处理后第6及24 h，每一浓度组和对照组各收集细胞2瓶，PBS离心洗涤，体质分数为70%乙醇固定，置于4℃冰箱保存，待制样进行FCM检测。另取ST 2.0mg/L处理6及24 h的实验及对照组细胞，制备电镜及DNA样品。实验Ⅰ重复3次，实验Ⅱ重复2次。
(三)细胞DNA含量的定量检测及分析：按张祥宏等[5] 的方法制备单细胞悬液及细胞DNA染色，FACS-420型流式细胞仪(美国B.D公司)检测细胞DNA含量，应用DNA单组方图统计软件进行资料处理，以出现DNA亚二倍体峰作为细胞凋亡标志，计算凋亡细胞百分率。以POMS统计软件进行统计学处理。
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(四)形态学观察：取ST 2.0mg/L处理6及24h的实验及对照细胞，常规方法制备电镜样品。分别切取1μm半薄切片和50nm超薄切片，0.15%甲苯胺蓝染色和铀-铅染色，光镜及H-500透射电镜(日本日立公司)观察细胞的形态变化。
(五)细胞DNA琼脂糖凝胶电泳：取ST 2.) mg/L处理6及24h的实验及对照细胞，常规方法提取细胞DNA，溶于10 μL TE缓冲液中；1×TAE电泳缓冲液，1%琼脂糖凝胶，恒压30～40 V电泳2 h，EB 5 mg/L染色后，观察DNA泳动带型，紫外透射摄影。
结 果
一、FCM检测结果：
(一)ST处理不同时间对淋巴细胞凋亡的影响：
由表1可见，经ST处理后，淋巴细胞凋亡率比对照组明显升高；随处理时间的延长，细胞凋亡率呈逐渐增高趋势，细胞凋亡率和处理时间的延长，细胞凋亡率呈逐渐增高趋势，细胞凋亡率和处理时间在2～48h呈明显正相关关系(r=0.9629,P<0.01)。
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(二)不同浓度的ST对淋巴细胞凋亡率的影响：
在ST 0.125～1.0 mg/L浓度范围内作用6h及24h，淋巴细胞凋亡率随ST浓度增加有不同程度的增高，呈明显量效关系(6 h:r=0.7788,P<0.01;24h：r=0.9827,P<0.01)(图1)
Fig 1 Apoptosis of lymphocytes after 6 h of ST treatment (
+s,n=6)图1 不同浓度的ST处理6 h后细胞凋亡情况
表1 ST(2 mg/L)处理不同时间后淋巴细胞凋亡率变化
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Tab 1 Changes of apoptotic rates of lymphocytes
in different times after ST treatment (%,
±s,n=8) Treating time (h)Control
ST
2
0
10.90±0.99*
4
0.28±0.34
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15.05±1.97**
6
1.70±0.44
18.20±5.01**
12
5.05±3.61
20.35±11.03**
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4.12±2.51
22.41±10.73**
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1.60±0.57
26.30±2.40*
48
4.60±3.17
34.10±10.61**
72
36.85±2.05
38.55±7.71
*P<0.05，**P<0.01,vs control
二、形态学观察结果：
半薄切片甲苯胺蓝染色可见ST处理组部分淋巴细胞形态不规则，胞膜呈泡状突起，核染色质浓集成团块状，沿核膜周边分布，提示细胞出现凋亡。此外，尚可见个别细胞出现核固缩、核碎裂等坏死性变化。透射电镜观察可见ST处理组部分淋巴细胞表现出具有凋亡特征的变化：核染色质凝集边集，核膜模糊甚至破坏，严重者核碎裂、染色质呈团块状，分散于细胞内，并可见扩张的线粒体及肿胀的内质网；细胞外形极不规则，可见凋亡小体。
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三、DNA琼脂糖凝胶电泳结果：
ST 2 mg/L处理组淋巴细胞出现了典型的DNA梯形图谱(Ladder条带)，相应时间的对照组细胞DNA无改变，进一步证实了ST处理可诱导淋巴细胞发生凋亡。
讨 论
本研究应用FCM方法定量分析了ST对体外培养人外周血淋巴细胞凋亡的影响。结果表明，杂色曲霉素可诱发和加速人外周血淋巴细胞凋亡的发生，并且在一定的时间(2～48 h)范围内，随ST处理时间的增加，淋巴细胞凋亡百分率亦相应增加。同时，在ST 0.125～1.0 mg/L浓度范围内，淋巴细胞凋亡率随ST浓度增加有不同程度的增高，呈明显量效关系。在FCM检测的基础上，应用形态学及较特异的生物化学方法，观察到凋亡细胞典型的形态及生化改变。本研究结果证明ST可诱导体外培养人外周血淋巴细胞发生凋亡，其机理尚待进一步探讨。
杂色曲霉素是一种致癌性的霉菌毒素，在体外培养条件下，ST对培养细胞有细胞毒性和致突变性，并可诱导人胚胃粘膜细胞及人胚肺细胞发生恶性转化[6～9]。近年来国外研究工作发现某些霉菌毒素，特别是单端孢菌类毒素对动物机体免疫系统有明显影响。本研究结果表明，我国恶性肿瘤高发区居民饮食中污染严重且具明显致突/致癌作用的ST可诱发和加速人外周血淋巴细胞发生凋亡，从而可能影响高发区居民机体的免疫功能，因此应引起高发区肿瘤防治工作者的高度重视。
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*河北省自然科学基金资助
参考文献
1 Zhang Xianghong, Xie Tongxin, Li Shaosen, et al. Preventive detection of fungi and mycotoxins in corn from high risk area of esophageal cancer in Cixian county. Chin J Cancer Res, 1995, 7:172.
2 楼建龙，田禾菁，孟昭赫，等.胃癌肝癌高发区和低发区粮食中杂色曲霉素污染量调查.卫生研究，1995，24：28.
3 孙鹤龄，吴铁铃，苏成玉，等.慢性胃病患者胃液内真菌菌谱.中华肿瘤杂志，1983，5：19.
4 谢同欣，张祥宏，严 霞，等.杂色曲霉素对人胃粘膜的致癌作用.肿瘤防治研究，1996，23：341.
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5 张祥宏，谢同欣，张中朝，等.杂色曲霉素对体外培养人胚肺成纤维细胞ras p21和超微结构的影响.卫生研究，1997，26：110.
6 高泽立，谢同欣，王凤荣等.胃癌高发区玉米面的致突变研究.肿瘤，1989，9(4)：157.
7 谢同欣，王凤荣，谭少波，等.杂色曲霉素诱发小鼠肺腺癌和腺胃不典型增生.中华肿瘤杂志，1990，12：21.
8 谢同欣，张祥宏，王凤荣，等.胃癌高发区胃癌患者胃液内杂色曲霉提取液的遗传毒性研究.肿瘤，1990，10：4.
9 谢同欣，王凤荣，严 霞，等.杂色曲霉提取液体外对人胚胃细胞的作用.中华医学杂志，1993，73：78.
10 Xie Tongxin, Zhang Xianghong,Yan Xia, et al. Effects of sterigmatocystin on expression of p53 protein and DNA content in human gatric cells in vitro. Chinese Science Bulletin, 1995,40:1568.
收稿日期：1997年12月24日
修稿日期：1998年8月27日, 百拇医药