低浓度H2O2对肺微血管内皮细胞的迟发效应——凋亡
作者：张 明 金惠铭 曹 翔 刘清行 钱睿哲 张国平
单位：上海医科大学病理生理学教研室(上海 200032)
关键词：内皮；过氧化氢类；肺
中国病理生理杂志990109 摘 要 目的和方法：对大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)培养、鉴定。观察了低浓度H2O2(0～100 μM)对体外培养的PMVEC的迟发性损伤效应。结果：MTT法发现H2O2对PMVEC的增殖代谢活性具有剂量依赖性抑制作用，而且当H2O2去除后，此作用仍可进一步发展。形态观察、流式细胞仪DNA测定、3’末端标记DNA降解片断原位检测(TUNEL)均表明，细胞凋亡是H2O2对PMVEC迟发性损伤效应的一种重要形式。
, 百拇医药
Delayed effect of low concentration of H2O2 on PMVEC∶apoptosis
ZHANG Ming， JIN Hui-Ming, CAO Xiang,LIU Qing-Hang,QIAN Rui-Zhe,ZHANG Guo-Ping,Dept.of Pathophysiology,Shanghai Medical University,Shanghai(200032)
Abstract AIM and METHOD:Pulmonary microvascular endothelial cells (PMVEC) were cultured and characterized.Delayed injury effects of low concentration of H2O2(0～100 μmol/L)on the PMVECs were observed.RESULTS：It was found with MTT method that H2O2 inhibited the proliferative and metabolic activity of PMVEC in vitro in a dose-dependent way,and after the removal of H2O2，this effect could develop further.Morphological observation,flow cytometry and DNA fragment in situ detection (TUNEL) revealed that apoptosis is an important form of delayed injury effect of H2O2 on the endothelial cells.CONCLUSION：Low concentration of H2O2 could induce a delayed effect on PMVEC: apoptosis.
, 百拇医药
MeSH Endothelium;Hydrogen peroxide; Lung
肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelail cell,PMVEC)在肺的病理生理反应中起着重要作用，许多因子首先通过损伤PMVEC而引起肺的一系列病理生理变化，其中活性氧(ROS)、TNFα等在组织损伤中起的作用日益为人们所重视。活性氧包括以自由基形式存在的超氧化物自由基O(-)/(*)2，羟自由基OH·，以及不以自由基形式存在的H2O2、脂质过氧化物ROOH等。活性氧的来源众多，如吸烟、多形核白细胞或单核细胞的激活，内毒素、TNFα的损伤作用很可能也是通过ROS来实现的[1]。ROS是许多病理生理过程中的重要发病介质，如ARDS、缺血再灌注损伤等。
过氧化氢(H2O2)对内皮细胞的毒性效应早为人们所重视，但是以往的研究多着重H2O2的急性毒性效应，而对其急性作用去除后内皮细胞的迟发性改变研究较少。我们以Chen等[2]报道的方法，经改良后培养了PMVEC，观察低浓度H2O2对PMVEC增殖代谢及调亡的影响。
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材料与方法
一、肺微血管内皮细胞培养及鉴定：
200 g左右的SD大鼠戊巴比妥麻醉后，无菌条件下打开胸腔，用Hanks液进行肺原位灌洗后取出肺，切取周边不含大中血管的肺组织，切成1 mm×1 mm×1.5 mm小块，种于25 cm2的塑料培养瓶(Nunc)，15～20 块/瓶。加培养液(DMEM+20%小牛血清)少许，于体积分数为5%CO2培养箱中静置48 h，可小心添加或置换培养液少许。至60 h，弃组织块，继续培养。见铺路石状细胞长出，直至融合。经鉴定后用于研究。
鉴定：倒置显微镜观察活细胞并摄影。细胞经戊二醛固定后扫描电镜观察。刮下细胞，离心、收集细胞，经包埋、切片、染色后，透射电镜观察。
长至融合状态的细胞，经多聚甲醛固定后，用vWF相关抗原抗体及内皮细胞特异性抗体CD31(DAKO公司)经常规ABC免疫组化法染色。
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二、H2O2对PMVEC的作用：
1.不同浓度的H2O2对PMVEC生长代谢的影响：长至融合状态的PMVEC，经消化后，计数，以8×104/mL细胞种于96孔板中。细胞贴壁后，DMEM洗一次，8孔一组，分别加入如下H2O2DMEM溶液：0，5，10，20，50，100 μmol/L，培养1 h后，再以DMEM洗细胞一次，加入含血清完全培养液继续培养24 h，用MTT法测定细胞生长代谢特性。
同一96孔板中另6组，加入上述不同浓度H2O2培养1 h后，立即行MTT法测定。
MTT法：四氮甲基唑蓝(MTT，Sigma)用pH7.2的PBS配成5 g/L。待测细胞每孔100 μL培养液中加MTT液10 μL，37 ℃孵育4 h，镜下可见紫蓝色针状结晶。弃上清液，每孔加100 μL二甲基亚砜(DMSO)。用ELISA读数仪(Biorad 450)于波长540 nm处读取OD值。
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2.H2O2对PMVEC作用的形态学观察：不同浓度H2O2作用于PMVEC不同阶段及去除作用后72 h，于倒置显微镜下观察，并作Giemsa染色、光镜观察。
PMVEC于25 cm2培养瓶长至融合状态，加入100 μmol/L H2O2，培养1 h，换含血清完全培养液继续培养3 h，经固定后，常规电镜观察。
3.H2O2对PMVEC作用去除后，细胞凋亡的观察：
(1)流式细胞仪DNA测定：PMVEC于25 cm2塑料培养瓶长至融合后，加入100 μmol/L H2O2培养1 h。去液、经DMEM洗后换入含血清完全培养液3 h。消化、固定、PI染色后，用FACSplus流式细胞仪测定。
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对照组以DMEM及完全培养液代替H2O2，其余同实验组。
(2)3’末端标记，DNA降解片断检测(TUNEL法)：将小盖玻片置于直径3.5 cm的玻璃培养皿中，PMVEC于盖玻片上长至融合状态，加入0，50，100 μmol/L H2O2培养1 h，去液，经DMEM洗后，换入含血清完全培养液培养3 h，固定，用程序性细胞死亡试剂检测盒(华美公司)染色。具体步骤见说明书。然后计数6个视野中每100个细胞中染色阳性的细胞数(%)。
结 果
一、PMVEC培养及鉴定：
接种的肺组织块周围，48 h已可见少量铺路石状细胞长出，并有形状圆而小的血细胞生长，60 h弃组织块时，各组织块周围的血细胞基本消失，铺路石状细胞大量生长，极少见长梭形细胞。
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扫描电镜下，主要的细胞呈多角形，少量突起，符合内皮细胞的形态学特征。透射电镜下可见各种常见细胞器，但细胞浆中维氏小体未见，这与大鼠肺微血管内皮细胞vWF染色阴性相符。内皮细胞特异抗原(CD31)染色，细胞浆阳性着色。
二、H2O2对PMVEC的作用：
1.MTT法结果：MTT为一种四氮唑蓝盐(tetrazolium salt)，它可在细胞线粒体中分解成formazan，后者溶解后很容易用ELISA读数仪定量。细胞活性越强，产生的Formazan越多，因此它是一种较好的反映细胞增殖代谢活力的指标。PMVEC经H2O2作用1h后，立即测定(0 h)或继续用完全培养液培养24 h后测定(24 h)，结果见图1：
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Fig 1 OD value of EC treated with H2O2 for 1 h
(n＝6， P<0.05)
图1 H2O2作用1 h后内皮细胞的OD值
2.形态学观察：0～50 μmol/L H2O2作用后，PMVEC形态改变不甚明显，经100 μmol/L H2O2作用1 h，可见部分细胞有收缩(图2)，甚至呈树枝状。去除H2O2继续培养，这种改变有所恢复，但细胞中分裂相极少见，大多数细胞处于静止状态。随着培养的继续，可见部分细胞脱落。
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Fig 2 PMVEC under phase contrast microscope(×100)
(left:control group,right:100 μmo/L H2O2)
图2 相差显微镜下PMVEC
经100 μmol/L H2O2作用1 h后，完全培养液继续培养3 h的PMVEC，透射电镜观察，可见部分细胞中有早期的核固缩现象(图3)。偶见不典型的凋亡小体。
3.H2O2对PMVEC作用去除后凋亡情况的观察：
(1)流式细胞仪DNA测定：含100μm H2O2的DMEM作用1 h，继续培养3 h后DNA测定可见一明显的亚2倍体峰(即所谓的凋亡峰)。而DMEM组，完全培养液组均未见此峰。(图4)
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3’末端标记—DNA降解片断的检测结果(TUNEL)：50，100 μmol/L H2O2作用后的PMVEC均可见细胞核阳性染色。100 μmol/L组阳性率(50.00±8.16)%，较50 μmol/L组(28.33±6.87)% 明显增高(P<0.01)。对照组仅见极个别细胞核阳性染色，阳性率为(0.82±0.01)%，与前两组比，P<0.01。见图5。
Fig 3 Nucleole of PMVEC treated with H2O2 for 1h,then cultrured with 20% FBS cultrue medium for 3 h(Transmission electron micrograph)
图3 H2O2作用后PMVEC细胞核透射电镜
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讨 论
PMVEC的体外培养在技术上一直比较困难。95年Chen[2]等运用肺周边组织块培养法，根据细胞从组织块长出的时间差，(早期为血细胞，以后为内皮细胞，60 h～70 h后主要是成纤维细胞)，大大地简化了PMVEC的培养。我们对此加以改进，增加了组织块接种数，由报道的每45 cm2接种10块增加到每25 cm2接种15块。为防止营养不足，在48 h组织已良好贴壁时，小心换液，这样便很好地解决了原来细胞数少的问题。只要掌握好组织块去除时间(60 ～70 h)，所获得的细胞纯度就可能较高(>98%)。我们运用内皮细胞特异抗体CD31进一步作免疫组化鉴定，证明其确定是内皮细胞。
活性氧H2O2对细胞的损伤作用一直是人们关心的一个热点。体内许多病理情况下都可伴有H2O2一过性增高，多形核白细胞在体外激活就能产生200 μmol/L的H2O2[3]，吸烟也可产生50～100 μmol/L的
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H2O2 group DMEM group 20% FBS cultrue mediumFig 4 DNA detection with flow cytometry
图4 流式细胞仪DNA测定
A 50 μmol/L H2O2； B 100 μmol/L H2O2； C Control goup
Fig 5 TUNEL of PMVEC treated with H2O2 for 1 h,then cultrued with 20% FBS culture medium for 3h
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图5 PMVEC 原位 TUNEL 染色
H2O2[4]，体内产生的H2O2很快被过氧化氢酶(catalase)等灭活。以往人们对H2O2对内皮细胞损伤效应多重视高浓度H2O2引起的急性细胞毒性效应，而对H2O2作用去除后，内皮细胞的改变了解较少。因此长期以来，对于H2O2引起的这种迟发效应未能重视。
从H2O2对PMVEC增殖代谢活性影响结果(MTT法)来看，DMEM(无血清，无H2O2)培养1 h立即行MTT测定，同再用正常培养液(有血清，无H2O2)培养24 h相比，后者增殖代谢活性较高。说明未经H2O2作用的内皮细胞经无血清培养后，即使代谢活性有所下降，但经24 h含血清培养液培养后，又能有所恢复。而经5，10，20 μmol/L H2O2作用后，虽经含血清培养液继续培养24 h，但其增殖代谢活性反较立即测定者要低，生长条件恢复正常，不但不能使细胞活力及数量恢复，其活性反较未继续用正常培养液培养者低，我们认为这是由于低浓度H2O2可通过一系列细胞信息传导启动内皮细胞的基因，进一步诱发部分细胞发生调亡。
, 百拇医药
凋亡或程序性细胞死亡涉及到一系列基因表达、核酸降解等过程。我们的观察与此相符。DNA核酸片断的原位染色阳性、流式细胞仪检测凋亡峰的出现、透射电镜细胞核固缩都说明H2O2对内皮细胞的作用中有程序性细胞死亡的参与。关于内皮细胞凋亡中基因及信号系统的参与目前了解较少。有人曾报道TGFβ可通过bcl-2的下调来诱导内皮细胞的凋亡[5]。转录因子NFκB被认为是内皮细胞激活与损伤时的重要因子，内皮细胞激活损伤时改变的许多分子启动子中都存在着其结合部位[6]，而且它是对活性氧的损伤作用十分敏感靶因子。有人用抗氧化剂成功地抑制了内皮细胞的凋亡[7]。因此它很可能参与了细胞凋亡的发生。关于这些基因及转录因子的作用值得作进一步研究。
高浓度H2O2往往引起内皮细胞的迅速死亡(坏死)，而低浓度H2O2对内皮细胞作用后，一方面引起内皮细胞的表面粘附分子[9]、血管调节物质(PGI2，NO)等合成的改变，另一方面，在部分细胞中启动了凋亡的发生，并可伴有形态的改变。另一部分细胞虽未发生凋亡，但其增殖代谢活性受到明显抑制。这些细胞继续培养，不同程度地表现出细胞衰弱，其形态似长期培养的内皮细胞。
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*美国中华医学基金(CMB)NO.96635资助。曾在第3届亚洲微循环学术会议上(泰国，曼谷)宣读
参考文献
1 Gerritsen ME,Bloor CM.Endothelial cell gene expression in response to injury.FASEB J,1993,7:523.
2 Chen SF,Fei X,Li SH.A new simple method for isolation of microvascular endothelial cell avoiding both chemical and mechanical injuries.Microvasc Res,1995，50：119.
3 Martin WJ. Neutrophils kill pulmonary endothelial cells by a hydrogen peroxide dependent pathway.An in vitro model of neutrophil mediated lung injury.Annu Rev Respir Dis,1984,130：209.
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4 Sinclair AJ,Barnett AH,Lunec J.Free radicals and anti-oxidant systems in health and disease.Br J Hosp Med,1990,43:334.
5 Tsukada T,Eguchi K,Migita K,et al.Transforming growth factor β1 induces apoptotic cell death in cultured human umbilical vein endothelial cells with down-regulated expression of bcl-2.Biochemi Biophysi Res Commun,1995,210(3):1076.
6 Collins T,Read MA,Neish A,et al.Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules:NF-κB and cytokine-induceble enhancers.FASEB J,1995,9:899.
, 百拇医药
7 Cooper JT,Stroka DM,Brostjan C,et al:A20 blocks endothelial cell activation through a NF-kappaB-dependent mechanism.J Biol Chem,1996,271:18068.
8 Abello PA,Fidler SA,Bulkley GB,et al.Antioxidants modulate induction of programmed endothelial cell death(apoptosis) by endotoxin.Arch Surg,1994,129:134.
9 Fraticelli A,Serrano CV Jr,Bochner BS,et al.Hydrogen peroxide and superoxide modulate leukocyte adhesion molecule expression and leukocyte endothelial adhesion.Biochim Biophys Acta,1996,1310:251.
收稿日期：1997年4月23日
修稿日期：1997年12月29日, 百拇医药
单位：上海医科大学病理生理学教研室(上海 200032)
关键词：内皮；过氧化氢类；肺
中国病理生理杂志990109 摘 要 目的和方法：对大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)培养、鉴定。观察了低浓度H2O2(0～100 μM)对体外培养的PMVEC的迟发性损伤效应。结果：MTT法发现H2O2对PMVEC的增殖代谢活性具有剂量依赖性抑制作用，而且当H2O2去除后，此作用仍可进一步发展。形态观察、流式细胞仪DNA测定、3’末端标记DNA降解片断原位检测(TUNEL)均表明，细胞凋亡是H2O2对PMVEC迟发性损伤效应的一种重要形式。
, 百拇医药
Delayed effect of low concentration of H2O2 on PMVEC∶apoptosis
ZHANG Ming， JIN Hui-Ming, CAO Xiang,LIU Qing-Hang,QIAN Rui-Zhe,ZHANG Guo-Ping,Dept.of Pathophysiology,Shanghai Medical University,Shanghai(200032)
Abstract AIM and METHOD:Pulmonary microvascular endothelial cells (PMVEC) were cultured and characterized.Delayed injury effects of low concentration of H2O2(0～100 μmol/L)on the PMVECs were observed.RESULTS：It was found with MTT method that H2O2 inhibited the proliferative and metabolic activity of PMVEC in vitro in a dose-dependent way,and after the removal of H2O2，this effect could develop further.Morphological observation,flow cytometry and DNA fragment in situ detection (TUNEL) revealed that apoptosis is an important form of delayed injury effect of H2O2 on the endothelial cells.CONCLUSION：Low concentration of H2O2 could induce a delayed effect on PMVEC: apoptosis.
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MeSH Endothelium;Hydrogen peroxide; Lung
肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelail cell,PMVEC)在肺的病理生理反应中起着重要作用，许多因子首先通过损伤PMVEC而引起肺的一系列病理生理变化，其中活性氧(ROS)、TNFα等在组织损伤中起的作用日益为人们所重视。活性氧包括以自由基形式存在的超氧化物自由基O(-)/(*)2，羟自由基OH·，以及不以自由基形式存在的H2O2、脂质过氧化物ROOH等。活性氧的来源众多，如吸烟、多形核白细胞或单核细胞的激活，内毒素、TNFα的损伤作用很可能也是通过ROS来实现的[1]。ROS是许多病理生理过程中的重要发病介质，如ARDS、缺血再灌注损伤等。
过氧化氢(H2O2)对内皮细胞的毒性效应早为人们所重视，但是以往的研究多着重H2O2的急性毒性效应，而对其急性作用去除后内皮细胞的迟发性改变研究较少。我们以Chen等[2]报道的方法，经改良后培养了PMVEC，观察低浓度H2O2对PMVEC增殖代谢及调亡的影响。
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材料与方法
一、肺微血管内皮细胞培养及鉴定：
200 g左右的SD大鼠戊巴比妥麻醉后，无菌条件下打开胸腔，用Hanks液进行肺原位灌洗后取出肺，切取周边不含大中血管的肺组织，切成1 mm×1 mm×1.5 mm小块，种于25 cm2的塑料培养瓶(Nunc)，15～20 块/瓶。加培养液(DMEM+20%小牛血清)少许，于体积分数为5%CO2培养箱中静置48 h，可小心添加或置换培养液少许。至60 h，弃组织块，继续培养。见铺路石状细胞长出，直至融合。经鉴定后用于研究。
鉴定：倒置显微镜观察活细胞并摄影。细胞经戊二醛固定后扫描电镜观察。刮下细胞，离心、收集细胞，经包埋、切片、染色后，透射电镜观察。
长至融合状态的细胞，经多聚甲醛固定后，用vWF相关抗原抗体及内皮细胞特异性抗体CD31(DAKO公司)经常规ABC免疫组化法染色。
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二、H2O2对PMVEC的作用：
1.不同浓度的H2O2对PMVEC生长代谢的影响：长至融合状态的PMVEC，经消化后，计数，以8×104/mL细胞种于96孔板中。细胞贴壁后，DMEM洗一次，8孔一组，分别加入如下H2O2DMEM溶液：0，5，10，20，50，100 μmol/L，培养1 h后，再以DMEM洗细胞一次，加入含血清完全培养液继续培养24 h，用MTT法测定细胞生长代谢特性。
同一96孔板中另6组，加入上述不同浓度H2O2培养1 h后，立即行MTT法测定。
MTT法：四氮甲基唑蓝(MTT，Sigma)用pH7.2的PBS配成5 g/L。待测细胞每孔100 μL培养液中加MTT液10 μL，37 ℃孵育4 h，镜下可见紫蓝色针状结晶。弃上清液，每孔加100 μL二甲基亚砜(DMSO)。用ELISA读数仪(Biorad 450)于波长540 nm处读取OD值。
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2.H2O2对PMVEC作用的形态学观察：不同浓度H2O2作用于PMVEC不同阶段及去除作用后72 h，于倒置显微镜下观察，并作Giemsa染色、光镜观察。
PMVEC于25 cm2培养瓶长至融合状态，加入100 μmol/L H2O2，培养1 h，换含血清完全培养液继续培养3 h，经固定后，常规电镜观察。
3.H2O2对PMVEC作用去除后，细胞凋亡的观察：
(1)流式细胞仪DNA测定：PMVEC于25 cm2塑料培养瓶长至融合后，加入100 μmol/L H2O2培养1 h。去液、经DMEM洗后换入含血清完全培养液3 h。消化、固定、PI染色后，用FACSplus流式细胞仪测定。
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对照组以DMEM及完全培养液代替H2O2，其余同实验组。
(2)3’末端标记，DNA降解片断检测(TUNEL法)：将小盖玻片置于直径3.5 cm的玻璃培养皿中，PMVEC于盖玻片上长至融合状态，加入0，50，100 μmol/L H2O2培养1 h，去液，经DMEM洗后，换入含血清完全培养液培养3 h，固定，用程序性细胞死亡试剂检测盒(华美公司)染色。具体步骤见说明书。然后计数6个视野中每100个细胞中染色阳性的细胞数(%)。
结 果
一、PMVEC培养及鉴定：
接种的肺组织块周围，48 h已可见少量铺路石状细胞长出，并有形状圆而小的血细胞生长，60 h弃组织块时，各组织块周围的血细胞基本消失，铺路石状细胞大量生长，极少见长梭形细胞。
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扫描电镜下，主要的细胞呈多角形，少量突起，符合内皮细胞的形态学特征。透射电镜下可见各种常见细胞器，但细胞浆中维氏小体未见，这与大鼠肺微血管内皮细胞vWF染色阴性相符。内皮细胞特异抗原(CD31)染色，细胞浆阳性着色。
二、H2O2对PMVEC的作用：
1.MTT法结果：MTT为一种四氮唑蓝盐(tetrazolium salt)，它可在细胞线粒体中分解成formazan，后者溶解后很容易用ELISA读数仪定量。细胞活性越强，产生的Formazan越多，因此它是一种较好的反映细胞增殖代谢活力的指标。PMVEC经H2O2作用1h后，立即测定(0 h)或继续用完全培养液培养24 h后测定(24 h)，结果见图1：
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Fig 1 OD value of EC treated with H2O2 for 1 h
(n＝6， P<0.05)
图1 H2O2作用1 h后内皮细胞的OD值
2.形态学观察：0～50 μmol/L H2O2作用后，PMVEC形态改变不甚明显，经100 μmol/L H2O2作用1 h，可见部分细胞有收缩(图2)，甚至呈树枝状。去除H2O2继续培养，这种改变有所恢复，但细胞中分裂相极少见，大多数细胞处于静止状态。随着培养的继续，可见部分细胞脱落。
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Fig 2 PMVEC under phase contrast microscope(×100)
(left:control group,right:100 μmo/L H2O2)
图2 相差显微镜下PMVEC
经100 μmol/L H2O2作用1 h后，完全培养液继续培养3 h的PMVEC，透射电镜观察，可见部分细胞中有早期的核固缩现象(图3)。偶见不典型的凋亡小体。
3.H2O2对PMVEC作用去除后凋亡情况的观察：
(1)流式细胞仪DNA测定：含100μm H2O2的DMEM作用1 h，继续培养3 h后DNA测定可见一明显的亚2倍体峰(即所谓的凋亡峰)。而DMEM组，完全培养液组均未见此峰。(图4)
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3’末端标记—DNA降解片断的检测结果(TUNEL)：50，100 μmol/L H2O2作用后的PMVEC均可见细胞核阳性染色。100 μmol/L组阳性率(50.00±8.16)%，较50 μmol/L组(28.33±6.87)% 明显增高(P<0.01)。对照组仅见极个别细胞核阳性染色，阳性率为(0.82±0.01)%，与前两组比，P<0.01。见图5。
Fig 3 Nucleole of PMVEC treated with H2O2 for 1h,then cultrured with 20% FBS cultrue medium for 3 h(Transmission electron micrograph)
图3 H2O2作用后PMVEC细胞核透射电镜
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讨 论
PMVEC的体外培养在技术上一直比较困难。95年Chen[2]等运用肺周边组织块培养法，根据细胞从组织块长出的时间差，(早期为血细胞，以后为内皮细胞，60 h～70 h后主要是成纤维细胞)，大大地简化了PMVEC的培养。我们对此加以改进，增加了组织块接种数，由报道的每45 cm2接种10块增加到每25 cm2接种15块。为防止营养不足，在48 h组织已良好贴壁时，小心换液，这样便很好地解决了原来细胞数少的问题。只要掌握好组织块去除时间(60 ～70 h)，所获得的细胞纯度就可能较高(>98%)。我们运用内皮细胞特异抗体CD31进一步作免疫组化鉴定，证明其确定是内皮细胞。
活性氧H2O2对细胞的损伤作用一直是人们关心的一个热点。体内许多病理情况下都可伴有H2O2一过性增高，多形核白细胞在体外激活就能产生200 μmol/L的H2O2[3]，吸烟也可产生50～100 μmol/L的
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H2O2 group DMEM group 20% FBS cultrue mediumFig 4 DNA detection with flow cytometry
图4 流式细胞仪DNA测定
A 50 μmol/L H2O2； B 100 μmol/L H2O2； C Control goup
Fig 5 TUNEL of PMVEC treated with H2O2 for 1 h,then cultrued with 20% FBS culture medium for 3h
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图5 PMVEC 原位 TUNEL 染色
H2O2[4]，体内产生的H2O2很快被过氧化氢酶(catalase)等灭活。以往人们对H2O2对内皮细胞损伤效应多重视高浓度H2O2引起的急性细胞毒性效应，而对H2O2作用去除后，内皮细胞的改变了解较少。因此长期以来，对于H2O2引起的这种迟发效应未能重视。
从H2O2对PMVEC增殖代谢活性影响结果(MTT法)来看，DMEM(无血清，无H2O2)培养1 h立即行MTT测定，同再用正常培养液(有血清，无H2O2)培养24 h相比，后者增殖代谢活性较高。说明未经H2O2作用的内皮细胞经无血清培养后，即使代谢活性有所下降，但经24 h含血清培养液培养后，又能有所恢复。而经5，10，20 μmol/L H2O2作用后，虽经含血清培养液继续培养24 h，但其增殖代谢活性反较立即测定者要低，生长条件恢复正常，不但不能使细胞活力及数量恢复，其活性反较未继续用正常培养液培养者低，我们认为这是由于低浓度H2O2可通过一系列细胞信息传导启动内皮细胞的基因，进一步诱发部分细胞发生调亡。
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凋亡或程序性细胞死亡涉及到一系列基因表达、核酸降解等过程。我们的观察与此相符。DNA核酸片断的原位染色阳性、流式细胞仪检测凋亡峰的出现、透射电镜细胞核固缩都说明H2O2对内皮细胞的作用中有程序性细胞死亡的参与。关于内皮细胞凋亡中基因及信号系统的参与目前了解较少。有人曾报道TGFβ可通过bcl-2的下调来诱导内皮细胞的凋亡[5]。转录因子NFκB被认为是内皮细胞激活与损伤时的重要因子，内皮细胞激活损伤时改变的许多分子启动子中都存在着其结合部位[6]，而且它是对活性氧的损伤作用十分敏感靶因子。有人用抗氧化剂成功地抑制了内皮细胞的凋亡[7]。因此它很可能参与了细胞凋亡的发生。关于这些基因及转录因子的作用值得作进一步研究。
高浓度H2O2往往引起内皮细胞的迅速死亡(坏死)，而低浓度H2O2对内皮细胞作用后，一方面引起内皮细胞的表面粘附分子[9]、血管调节物质(PGI2，NO)等合成的改变，另一方面，在部分细胞中启动了凋亡的发生，并可伴有形态的改变。另一部分细胞虽未发生凋亡，但其增殖代谢活性受到明显抑制。这些细胞继续培养，不同程度地表现出细胞衰弱，其形态似长期培养的内皮细胞。
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*美国中华医学基金(CMB)NO.96635资助。曾在第3届亚洲微循环学术会议上(泰国，曼谷)宣读
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收稿日期：1997年4月23日
修稿日期：1997年12月29日, 百拇医药