大脑局部急性缺血后热休克蛋白70的免疫组织化学研究
作者：谢 安 臧益民 张继武 郑崇勋 郝 雷 N.V.Thakor
单位：
谢 安 臧益民 第四军医大学生理学教研室(西安710032)；张继武 郑崇勋 西安交通大学医电所；郝 雷 N.V.Thakor Johns Hopkins 大学医电系(美国，马里兰州)
关键词：
中国病理生理杂志990128 热休克蛋白70(HSP 70)是一种极敏感和可靠的脑缺血的标志。在正常脑内几乎检测不到HSP 70mRNA或HSP 70蛋白，随着脑缺血时程的增长，HSP 70蛋白的表达与细胞受缺血损伤的程度相关，但随着缺血程度加重，HSP 70基因转录和/或翻译被阻断。一过性脑缺血后海马CA 1区神经元的HSP 70表达最早。HSP 70在脑内的分布取决于使用的缺血模型。本文旨在使用一种新的大脑局部急性缺血及再灌注模型来研究HSP 70蛋白的表达部位，以期阐明脑细胞缺血性损伤与HSP 70表达之间的关系。
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方 法
24只SD大鼠体重200～350g，雌雄不拘，戊巴比妥钠行腹腔麻醉(35mg/kg)，气管插管，分离左侧颈总动脉约1cm，颈总动脉近心端结扎，沿血流方面插管用于灌注生理盐水，调节灌注压及流量可控制大脑缺血的程度及范围。本文采用灌注压14 kPa，流量0.2mL/min，环境温度维持在27℃左右，选其中12只大鼠(缺血组)灌注生理盐水30min后处死。另外12只大鼠灌注生理盐水30min后停止灌注30min，靠侧枝循环恢复大脑供血，然后处死。大鼠处死后再经主动脉灌注4%的多聚甲醛缓冲液固定1.5h，然后用1%蔗糖缓冲液脱水30min，取出大脑放入4℃20%蔗糖缓冲液中过夜。沿矢状方向每隔0.4mm做40μm冰冻切片一张，用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法做漂染(一抗：Sigma，大鼠单克隆抗体H 5147， No，BMR-22，ABC试剂盒(Sigma，Extra-2)。同时做阴性对照，除不加一抗外，其余相同。另用5只SD大鼠直接从颈总动脉灌注美兰以观察缺血范围。组织固定过夜后，沿矢状方向每1mm做一张切片。
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以上大鼠麻醉后都用立体定向仪固定，沿正中线切开头皮，在离冠状缝与矢状缝2mm处打两个直径约1mm的小孔(P3，P4)，将银球电极放入小孔内记录体感诱发电位(SEP)和脑电图(EEG)，参考电极接鼻子，地线接舌。SEP叠加100次，采样频率为3 200Hz，EEG采样频率为200Hz。刺激电极放在对侧后肢，刺激强度为4.0mA、波宽50μs、频率为2.1Hz。
结 果
缺血30min后，EEG的波幅稍有增加，再灌注30min后波幅无规律性变化，但在缺血30min后，SEP波幅的增加都超过20%，这表明大脑处于兴奋性损伤状态，再灌注30min，SEP幅度变化不明显(见图1A)。
在正常脑组织没有发现有HSP 70蛋白。缺血30min后，HSP 70首先在顶叶皮质外层的神经元上有表达(图1 B与C)，此时海马及豆尾核上神经元无染色。HSP 70蛋白主要在神经元的细胞膜、轴突和树突上表达。再灌注30min后，HSP 70蛋白的表达又恢复至正常状态。
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灌注美兰后，大鼠大脑冠状切片的左侧大部分区域被染兰，右侧几乎无着色(见图1C)；左则皮质部分着色稍浅，其余部位深着色，说明采用的实验模型会造成半侧皮质轻度缺血。
Fig 1 A：The changes of SEP after rat's brain ischemia 30 min and reperfusion 30 min
a. Normal SEP; b. After ischemia 30 min; c. After ischemia 30 min and reperfusion 30 min
B. The HSP 70 expression in parietal cortex during brain ischemia 30 min (under microscope with 30 times)
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C. The area stained by methylene blue infused from left common carotid artery (amplified with 2 times)
图1 A 大鼠大脑缺血及再灌注30 min后体感诱发电位的改变； B大脑顶叶皮质缺血30 min后HSP 70的表达； C：从左侧颈总动脉灌注美兰后的着色部位
本文使用的局部脑缺血模型可通过改变灌注压及灌注量来调节缺血程度和范围，从而使脑局部轻度缺血，此模型还可避免代谢产物及缺血诱发的一些因子对HSP 70表达的影响。使用本模型造成脑局部轻度缺血30min后，SEP幅值增加至少20%，这表明大脑处于缺血所致的兴奋性损伤期。此时由于大脑顶叶皮质外侧缺血较轻，所以HSP 70首先在此表达。海马及豆尾核的神经元无HSP 70表达原因可能有二：一是该区域血供丰富，这里的神经元都具有较高的缺血耐受性；二是可能缺血时间太短，如缺血延至8h甚至1d，HSP 70也可能有表达。恢复血供30min后，EEG及SEP无明显改变，但HSP 70表达恢复。脑局部轻度缺血时，SEP虽能敏感地反映脑兴奋性损伤，但再灌后SEP变化不大，SEP这些变化是由于神经元兴奋状态造成的，不能直接反映血液的供应；而HSP 70可因缺血而产生，血供恢复后可较快地减少蛋白的表达，这说明HSP 70蛋白可较敏感地反映皮质神经元的血液供应。因此我们认为HSP 70与缺血性损伤有密切关系，但必须结合考虑缺血的范围、程度、时间和侧枝循环及代谢产物的影响等因素。
收稿日期：1997年4月22日
修稿日期：1997年12月24日, 百拇医药
单位：
谢 安 臧益民 第四军医大学生理学教研室(西安710032)；张继武 郑崇勋 西安交通大学医电所；郝 雷 N.V.Thakor Johns Hopkins 大学医电系(美国，马里兰州)
关键词：
中国病理生理杂志990128 热休克蛋白70(HSP 70)是一种极敏感和可靠的脑缺血的标志。在正常脑内几乎检测不到HSP 70mRNA或HSP 70蛋白，随着脑缺血时程的增长，HSP 70蛋白的表达与细胞受缺血损伤的程度相关，但随着缺血程度加重，HSP 70基因转录和/或翻译被阻断。一过性脑缺血后海马CA 1区神经元的HSP 70表达最早。HSP 70在脑内的分布取决于使用的缺血模型。本文旨在使用一种新的大脑局部急性缺血及再灌注模型来研究HSP 70蛋白的表达部位，以期阐明脑细胞缺血性损伤与HSP 70表达之间的关系。
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方 法
24只SD大鼠体重200～350g，雌雄不拘，戊巴比妥钠行腹腔麻醉(35mg/kg)，气管插管，分离左侧颈总动脉约1cm，颈总动脉近心端结扎，沿血流方面插管用于灌注生理盐水，调节灌注压及流量可控制大脑缺血的程度及范围。本文采用灌注压14 kPa，流量0.2mL/min，环境温度维持在27℃左右，选其中12只大鼠(缺血组)灌注生理盐水30min后处死。另外12只大鼠灌注生理盐水30min后停止灌注30min，靠侧枝循环恢复大脑供血，然后处死。大鼠处死后再经主动脉灌注4%的多聚甲醛缓冲液固定1.5h，然后用1%蔗糖缓冲液脱水30min，取出大脑放入4℃20%蔗糖缓冲液中过夜。沿矢状方向每隔0.4mm做40μm冰冻切片一张，用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法做漂染(一抗：Sigma，大鼠单克隆抗体H 5147， No，BMR-22，ABC试剂盒(Sigma，Extra-2)。同时做阴性对照，除不加一抗外，其余相同。另用5只SD大鼠直接从颈总动脉灌注美兰以观察缺血范围。组织固定过夜后，沿矢状方向每1mm做一张切片。
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以上大鼠麻醉后都用立体定向仪固定，沿正中线切开头皮，在离冠状缝与矢状缝2mm处打两个直径约1mm的小孔(P3，P4)，将银球电极放入小孔内记录体感诱发电位(SEP)和脑电图(EEG)，参考电极接鼻子，地线接舌。SEP叠加100次，采样频率为3 200Hz，EEG采样频率为200Hz。刺激电极放在对侧后肢，刺激强度为4.0mA、波宽50μs、频率为2.1Hz。
结 果
缺血30min后，EEG的波幅稍有增加，再灌注30min后波幅无规律性变化，但在缺血30min后，SEP波幅的增加都超过20%，这表明大脑处于兴奋性损伤状态，再灌注30min，SEP幅度变化不明显(见图1A)。
在正常脑组织没有发现有HSP 70蛋白。缺血30min后，HSP 70首先在顶叶皮质外层的神经元上有表达(图1 B与C)，此时海马及豆尾核上神经元无染色。HSP 70蛋白主要在神经元的细胞膜、轴突和树突上表达。再灌注30min后，HSP 70蛋白的表达又恢复至正常状态。
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灌注美兰后，大鼠大脑冠状切片的左侧大部分区域被染兰，右侧几乎无着色(见图1C)；左则皮质部分着色稍浅，其余部位深着色，说明采用的实验模型会造成半侧皮质轻度缺血。
Fig 1 A：The changes of SEP after rat's brain ischemia 30 min and reperfusion 30 min
a. Normal SEP; b. After ischemia 30 min; c. After ischemia 30 min and reperfusion 30 min
B. The HSP 70 expression in parietal cortex during brain ischemia 30 min (under microscope with 30 times)
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C. The area stained by methylene blue infused from left common carotid artery (amplified with 2 times)
图1 A 大鼠大脑缺血及再灌注30 min后体感诱发电位的改变； B大脑顶叶皮质缺血30 min后HSP 70的表达； C：从左侧颈总动脉灌注美兰后的着色部位
本文使用的局部脑缺血模型可通过改变灌注压及灌注量来调节缺血程度和范围，从而使脑局部轻度缺血，此模型还可避免代谢产物及缺血诱发的一些因子对HSP 70表达的影响。使用本模型造成脑局部轻度缺血30min后，SEP幅值增加至少20%，这表明大脑处于缺血所致的兴奋性损伤期。此时由于大脑顶叶皮质外侧缺血较轻，所以HSP 70首先在此表达。海马及豆尾核的神经元无HSP 70表达原因可能有二：一是该区域血供丰富，这里的神经元都具有较高的缺血耐受性；二是可能缺血时间太短，如缺血延至8h甚至1d，HSP 70也可能有表达。恢复血供30min后，EEG及SEP无明显改变，但HSP 70表达恢复。脑局部轻度缺血时，SEP虽能敏感地反映脑兴奋性损伤，但再灌后SEP变化不大，SEP这些变化是由于神经元兴奋状态造成的，不能直接反映血液的供应；而HSP 70可因缺血而产生，血供恢复后可较快地减少蛋白的表达，这说明HSP 70蛋白可较敏感地反映皮质神经元的血液供应。因此我们认为HSP 70与缺血性损伤有密切关系，但必须结合考虑缺血的范围、程度、时间和侧枝循环及代谢产物的影响等因素。
收稿日期：1997年4月22日
修稿日期：1997年12月24日, 百拇医药