冷温血停搏液对犬PMN活性氧及NO自由基代谢的影响*
作者：祁克宗 疏元善 王林安
单位：祁克宗 安徽农业大学动物医学系(合肥230036)；疏元善 安徽省心血管病研究所；王林安 东北农业大学动物医学系
关键词：
中国病理生理杂志990127 近年研究表明中性粒细胞(polymorphonuclear, PMN)是心肌缺血再灌注时氧自由基产生的重要来源，心肌缺血再灌注期外周血中性粒细胞氧化代谢加强，心肌细胞发生PMN的侵润或聚集。随着自由基在生物医学中的深入研究，发现一氧化氮自由基(NO*)与再灌注损伤有密切关系，研究证实，再灌注过程中大量NO*释放可迅速氧化生成过氧硝酸阴离子(ONOO-)，是羟自由基(OH*)的来源之一。
本研究应用20℃冷血与37℃温血停搏液联合灌注，从心肌缺血再灌注期自由基损伤机制入手，检测实验犬PMN活性氧以及一氧化氮代谢产物亚硝酸盐(NO-2)含量的变化，旨在观察冷温血停搏液联合灌注对犬心肌的保护效应。
, http://www.100md.com
方 法
一、实验动物分组与处理：
将14只实验犬随机分为对照组和实验组，实施中低温体外循环，灌注流量80～100 mL(kg*min-1)；对照组(A组)：用4℃改良的St.Thomas停搏液诱导，在升主动脉阻断25 min后复灌1次，首次剂量15 mL/kg体重，二次灌注为10 mL/kg,1～2min内灌完。实验组(B组)：先用20℃高钾冷血停搏液诱导停跳(剂量10 mL/kg,2～3 min灌完)，间隔15 min灌注低钾20℃冷血停搏液，剂量减半，复灌2次，于2 min内完成；主动脉开放前5 min灌注37℃温血停搏液。
表1 犬心肌缺血再灌注期PMN-CL和血清NO-2的变化
Tab 1 Changes of PMN-CL and serum NO-2 contents in A and B groups during ischemia and reperfusion in dogs (x±s,n=7)
, http://www.100md.com
PMN-CL
serum NO-2(μmol/L)
Back ground(mV)
Peak value(mV)
Peak time(S)
A
B
A
B
A
B
A
, http://www.100md.com
B
T1
44.00±8.52
42.86±7.45
149.71±15.80
141.43±13.65
337.00±27.63
368.00±34.50
26.03±8.28
28.55±7.97
T2
, http://www.100md.com
146.86±17.46
116.00±13.10*
467.00±43.05
427.00±31.88**
371.00±42.46
351.00±31.43
44.98±9.47
35.94±10.12
T3
121.43±15.20
, 百拇医药 105.14±11.33
286.70±33.65
233.20±24.12*
372.00±26.85
381.00±27.97
66.13±11.17
50.91±9.19
T4
138.71±17.32
117.14±14.21*
302.61±26.50
, 百拇医药
251.78±16.83*
383.00±61.80
387.00±48.73
82.35±17.14
59.12±15.67**
T5
162.00±20.06
131.43±15.62*
320.14±19.28
275.62±19.20
, 百拇医药
376.00±39.81
346.00±48.73*
71.11±14.19
53.79±13.46**
T6
195.57±24.68
162.86±18.03*
397.96±27.76
314.00±21.77**
329.00±50.41
, http://www.100md.com
375.00±42.67*
59.62±15.36
42.22±11.27**
*P<0.05,**P<0.01, vs A group in the same time二、采样及检测方法：
实验犬于主动脉阻断前(T1)、主动脉阻断60 min(T2)、主动脉开放15 min(T3)、30 min(T4)、45 min(T5)\,60 min(T6)，经冠状静脉置管后取血样。PMN活性氧测定采用微量全血化学发光法(chemiluminescence, CL)，应用SHG-2型化学发光仪(上海检测技术所检测仪器厂产品)，测定PMN的发光强度(mV)和峰时(s)。血清一氧化氮(NO)产物测定采用亚硝酸盐法，测定血清亚硝酸盐(NO-2)含量，单位以μmol/L表示。
, 百拇医药
结 果
结果表明，主动脉阻断60 min，两组PMN的本底、峰值均突然上升，与主动脉阻断前比较差异极显著(P<0.01),但主动脉开放15 min，其本底、峰值较主动脉开放即刻明显下降(P<0.01)，但峰时延长。主动脉开放30 min后各时点的本底、峰值呈逐渐增加趋势，两组间比较实验组明显低于对照组(P<0.05或0.01)。两组血清NO-2的含量呈升高趋势，在主动脉开放30 min时升高达峰值，与组内主动脉阻断前、阻断60 min和开放60 min比较，T4与T1、T2差异极显著(P<0.01)，T4与T6差异显著(P<0.05);但组间比较，主动脉开放30 min后各时点NO-2的含量显著低于对照组(P<0.05或0.01)。
讨 论
, http://www.100md.com
William等研究发现开胸犬缺血再灌注心肌中PMN的聚集是心肌损伤的主要表现。PMN的发光本底反映了PMN的吞噬能力，是PMN发挥氧化代谢功能的基础，体外刺激诱发全血化学发光的峰值，反映了PMN在心肌缺血再灌注状态下吞噬细胞呼吸爆发的强度，即活性氧自由基的产生能力。本研究表明，应用冷晶停搏液于再灌注期PMN活性氧指标均显著高于冷温血停搏液；但主动脉开放即刻两组PMN-CL本底及峰值突然增加，主要原因可能由于缺血心肌PMN的趋化激活与再灌注大量的氧涌入，引起心肌组织内PMN“呼吸爆发”而产生大量氧自由基。在开放15 min至60 min各时间点PMN的氧化代谢逐渐加强，表明缺血再灌注后白细胞粘附广，心肌血管内表面的趋化性增强，并进一步加强了氧自由基再灌注损伤的程度。
NO是一种生物信息传递分子和细胞毒性因子。再灌注过程中大量的NO释放可迅速与氧及超氧阴离子反应生成ONOO-更强的氧化剂，加剧再灌注的损伤。Georg等人应用NOS合成酶抑制剂可减少缺血再灌注心肌过氧化物形成并改善心肌收缩功能。本研究再次证实了PMN产生的活性氧自由基参与了心肌缺血再灌注损伤。并且证明，冷温血停搏液联合灌注比传统冷晶停搏液具有更明显的心肌保护作用。
*安徽省科委重点课题
收稿日期：1997年9月9日
修稿日期：1998年8月28日, 百拇医药
单位：祁克宗 安徽农业大学动物医学系(合肥230036)；疏元善 安徽省心血管病研究所；王林安 东北农业大学动物医学系
关键词：
中国病理生理杂志990127 近年研究表明中性粒细胞(polymorphonuclear, PMN)是心肌缺血再灌注时氧自由基产生的重要来源，心肌缺血再灌注期外周血中性粒细胞氧化代谢加强，心肌细胞发生PMN的侵润或聚集。随着自由基在生物医学中的深入研究，发现一氧化氮自由基(NO*)与再灌注损伤有密切关系，研究证实，再灌注过程中大量NO*释放可迅速氧化生成过氧硝酸阴离子(ONOO-)，是羟自由基(OH*)的来源之一。
本研究应用20℃冷血与37℃温血停搏液联合灌注，从心肌缺血再灌注期自由基损伤机制入手，检测实验犬PMN活性氧以及一氧化氮代谢产物亚硝酸盐(NO-2)含量的变化，旨在观察冷温血停搏液联合灌注对犬心肌的保护效应。
, http://www.100md.com
方 法
一、实验动物分组与处理：
将14只实验犬随机分为对照组和实验组，实施中低温体外循环，灌注流量80～100 mL(kg*min-1)；对照组(A组)：用4℃改良的St.Thomas停搏液诱导，在升主动脉阻断25 min后复灌1次，首次剂量15 mL/kg体重，二次灌注为10 mL/kg,1～2min内灌完。实验组(B组)：先用20℃高钾冷血停搏液诱导停跳(剂量10 mL/kg,2～3 min灌完)，间隔15 min灌注低钾20℃冷血停搏液，剂量减半，复灌2次，于2 min内完成；主动脉开放前5 min灌注37℃温血停搏液。
表1 犬心肌缺血再灌注期PMN-CL和血清NO-2的变化
Tab 1 Changes of PMN-CL and serum NO-2 contents in A and B groups during ischemia and reperfusion in dogs (x±s,n=7)
, http://www.100md.com
PMN-CL
serum NO-2(μmol/L)
Back ground(mV)
Peak value(mV)
Peak time(S)
A
B
A
B
A
B
A
, http://www.100md.com
B
T1
44.00±8.52
42.86±7.45
149.71±15.80
141.43±13.65
337.00±27.63
368.00±34.50
26.03±8.28
28.55±7.97
T2
, http://www.100md.com
146.86±17.46
116.00±13.10*
467.00±43.05
427.00±31.88**
371.00±42.46
351.00±31.43
44.98±9.47
35.94±10.12
T3
121.43±15.20
, 百拇医药 105.14±11.33
286.70±33.65
233.20±24.12*
372.00±26.85
381.00±27.97
66.13±11.17
50.91±9.19
T4
138.71±17.32
117.14±14.21*
302.61±26.50
, 百拇医药
251.78±16.83*
383.00±61.80
387.00±48.73
82.35±17.14
59.12±15.67**
T5
162.00±20.06
131.43±15.62*
320.14±19.28
275.62±19.20
, 百拇医药
376.00±39.81
346.00±48.73*
71.11±14.19
53.79±13.46**
T6
195.57±24.68
162.86±18.03*
397.96±27.76
314.00±21.77**
329.00±50.41
, http://www.100md.com
375.00±42.67*
59.62±15.36
42.22±11.27**
*P<0.05,**P<0.01, vs A group in the same time二、采样及检测方法：
实验犬于主动脉阻断前(T1)、主动脉阻断60 min(T2)、主动脉开放15 min(T3)、30 min(T4)、45 min(T5)\,60 min(T6)，经冠状静脉置管后取血样。PMN活性氧测定采用微量全血化学发光法(chemiluminescence, CL)，应用SHG-2型化学发光仪(上海检测技术所检测仪器厂产品)，测定PMN的发光强度(mV)和峰时(s)。血清一氧化氮(NO)产物测定采用亚硝酸盐法，测定血清亚硝酸盐(NO-2)含量，单位以μmol/L表示。
, 百拇医药
结 果
结果表明，主动脉阻断60 min，两组PMN的本底、峰值均突然上升，与主动脉阻断前比较差异极显著(P<0.01),但主动脉开放15 min，其本底、峰值较主动脉开放即刻明显下降(P<0.01)，但峰时延长。主动脉开放30 min后各时点的本底、峰值呈逐渐增加趋势，两组间比较实验组明显低于对照组(P<0.05或0.01)。两组血清NO-2的含量呈升高趋势，在主动脉开放30 min时升高达峰值，与组内主动脉阻断前、阻断60 min和开放60 min比较，T4与T1、T2差异极显著(P<0.01)，T4与T6差异显著(P<0.05);但组间比较，主动脉开放30 min后各时点NO-2的含量显著低于对照组(P<0.05或0.01)。
讨 论
, http://www.100md.com
William等研究发现开胸犬缺血再灌注心肌中PMN的聚集是心肌损伤的主要表现。PMN的发光本底反映了PMN的吞噬能力，是PMN发挥氧化代谢功能的基础，体外刺激诱发全血化学发光的峰值，反映了PMN在心肌缺血再灌注状态下吞噬细胞呼吸爆发的强度，即活性氧自由基的产生能力。本研究表明，应用冷晶停搏液于再灌注期PMN活性氧指标均显著高于冷温血停搏液；但主动脉开放即刻两组PMN-CL本底及峰值突然增加，主要原因可能由于缺血心肌PMN的趋化激活与再灌注大量的氧涌入，引起心肌组织内PMN“呼吸爆发”而产生大量氧自由基。在开放15 min至60 min各时间点PMN的氧化代谢逐渐加强，表明缺血再灌注后白细胞粘附广，心肌血管内表面的趋化性增强，并进一步加强了氧自由基再灌注损伤的程度。
NO是一种生物信息传递分子和细胞毒性因子。再灌注过程中大量的NO释放可迅速与氧及超氧阴离子反应生成ONOO-更强的氧化剂，加剧再灌注的损伤。Georg等人应用NOS合成酶抑制剂可减少缺血再灌注心肌过氧化物形成并改善心肌收缩功能。本研究再次证实了PMN产生的活性氧自由基参与了心肌缺血再灌注损伤。并且证明，冷温血停搏液联合灌注比传统冷晶停搏液具有更明显的心肌保护作用。
*安徽省科委重点课题
收稿日期：1997年9月9日
修稿日期：1998年8月28日, 百拇医药