毁损大鼠纹状体帕金森病模型的建立
作者：伦学庆 章 翔 张剑宁 陈良为 张延庆
单位：伦学庆 张延庆山东济宁医学院附属医院神经外科 (济宁 272129)；章 翔 张剑宁 陈良为 第四军医大学西京医院神经外科
关键词：
中国病理生理杂志990240 近来研究发现，经典黑质损伤帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)大鼠模型有以下不足：①毁损为急性(24 h内)过程，不符合人类PD进行性变性特征；②对黑质损伤较完全彻底，即建立的仅是晚期PD动物模型；③黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)相对较小、定位困难，模型成功率较低，一般为30%～40%左右[1]。最近，Ichitani[2]和Espino等[3]将6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)注入纹状体，发现黑质也可出现不同程度变性。借此，我们将6-OHDA注入纹状体，通过行为及免疫组化证实，成功地建立了纹状体损伤PD大鼠模型，为早、中期PD研究奠定了实验基础。
, 百拇医药
材料与方法
(一)实验动物分组及处理：成年雌性SD大鼠30只，体重(220±30)g，随机分为2组：实验组25只，对照组5只。所有动物术前均经多次测试，确认其无旋转行为后进行实验。①实验组：大鼠以戊巴比妥钠(40 mg/kg ip)麻醉，颅平位固定于大鼠脑立体定向仪上，按Paxinos等[4]图谱确定右侧纹状体二坐标(①前囟前0.7mm,中线右侧3.0mm，硬膜下4.5mm；②前囟后0.2mm，中线右侧2.6mm，硬膜下6.0mm)。按此二坐标开颅并用微量注射器向每一点注射6-OHDA 10μg(溶于5μL含质量分数为0.2%抗坏血酸的生理盐水中)，注射速度0.5μL/min，注毕留针5min，并以1mm/min速度缓慢退出。②对照组用上述同样方法和坐标，仅注射含质量分数为0.2%抗坏血酸的生理盐水5μL。
(二)行为检测：分别于术后第2、4、6、8、12、16周行旋转行为测试。阿扑吗啡(apomorphine, APO)，0.5mg/kg背部皮下注射。注射10min后开始观察并记录大鼠旋转次数，观察30min，平均转速>6r/min视为成功模型，否则为不成功模型。
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(三)免疫组织化学：为了验证模型稳定性，另取16只大鼠，分别取6-OHDA注入后1周、2周、3周、4周和模型成功鼠及对照组动物各2只，麻醉后，经升主动脉灌注固定，取脑作冰冻切片，片厚40μm,用兔抗酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)血清进行免疫组织化学ABC法染色。(TH抗血清，第四军医大学解剖教研室提供；ABC试剂盒，Sigma产品)。光镜下观察结果。
结 果
(一)一般观察：所有动物注药后均能正常存活，无死亡。4周以后部分动物开始出现头偏斜，行走缓慢，尾僵直，自发旋转等。
(二)APO诱发旋转行为：术后6周，APO注射后92%以上动物于5min内开始出现旋转，旋转时以健侧后肢为支点原地转动，身体环曲，首尾相接。同时还出现明显的觅食及弓背样动作。大鼠旋转行为检测结果见表1，表2。
, http://www.100md.com 表1 注射6-OHDA后6周APO诱发大鼠旋转行为变化
Tab 1 The changes of APO induced rotation behaviour of rats
6 weeks after intrastriatal injections of 6-OHDA (
±s) Group
n
Rotation (r/min)
Experimental
25
6.3±0.5
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Continued rotation to left
21
6.8±0.4
Continued rotation to right
1
5.9±0.9
Rotation to right or left
1
5.5±0.3
No rotation
2
, http://www.100md.com
0
Control
5
0
表2 注射6-OHDA后不同时间大鼠旋转行为变化
Tab 2 The changes of rotation behaviour at different
time after intrastriatal injections of 6-OHDA (±s) Week after injection
n
Rotation(r/min)
, http://www.100md.com
2
0
0
4
16
4.8±0.8
6
23
6.5±0.5
6
23
6.4±0.2
12
, 百拇医药 23
6.2±0.4
16
23
6.6±0.4
从表1中可看出，实验组25只大鼠有23只(92%)出现旋转，其中21只为恒定左转鼠且转速超过6 r/min，占实验组动物总数的84.0%，显著多于右转鼠(1只，占 4%)(P<0.01)。对照组5只均无旋转行为，与实验组也有显著差异。
由表2可见，第2周时无旋转，从第4周开始出现旋转行为，至第6周旋转行为稳定，8、12、16周与第6周时平均转速无显著差异，结果稳定。此21只恒定左转鼠被认为是PD旋转鼠成功模型。
(三)免疫组化：模型成功鼠右侧尾壳核区与对侧比较，TH-immunoreactivity(TH-IR)纤维数目明显降低，且第6、8、12、16周与第3周时无明显差异。右侧黑质术后2周内TH-IR神经元数目无改变，3周时开始降低，4周明显降低，6周时稳定，一直持续到实验结束无明显变化。左侧无论哪个时期黑质及尾壳核区TH-IR神经原及纤维数目均无明显改变。图1。
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Fig 1 TH-immunocytochemistry of the SN 6 weeks after unilateral 6-OHDA injection into the striatum. The number of the cell bodies and dendrites of the right were markedly lower, and that of the left were nomal(×40.A, left;B,right)
图1 纹状体内注射6-OHDA后6周，黑质区酪氨酸羟化酶免疫组化染色，右侧TH-IR神经元数目明显降低，左侧正常
讨 论
一、黑质-纹状体多巴胺能神经元损害特征与机理：
我们将6-OHDA注入纹状体后，TH免疫组化证实，注射侧SNc及尾壳核区TH-IR神经元及纤维数目较对侧显著降低，对照组双侧无变化。说明6-OHDA注入纹状体后，能引起同侧黑质-纹状体多巴胺能神经元逆行损害。目前对这种损害机理尚不清楚，但有两种可能的解释[5，6]：①6-OHDA注入纹状体后，纹状体末稍首先被选择性毁损，此后黑质神经元胞体通过逆行变性出现继发性损害，曾有文献报道，纹状体大部切除后3～4周，黑质神经元儿茶酚胺能荧光密度明显下降，说明这种逆行性损害的发生是逐渐出现的；②纹状体末稍摄取6-OHDA后，轴突将其逆行输送至黑质神经元胞体，然后引起细胞变性。支持该观点证据是，纹状体注入6-OHDA后2周内，黑质未见明显TH-IR神经元数目改变。
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二、药物诱发旋转行为：
药物诱发试验通常以动物是否出现旋转行为及旋转次数作为判断模型成功的标准，常用药物有APO和苯丙胺(AMPH)。APO诱发旋转行为发生不仅与纹状体多巴胺含量下降有关，还与其多巴胺D2受体代偿性增加及敏感性提高等有关。当APO注射时，便与该侧纹体内大量增加的D2受体结合。并使受体出现致敏现象，引起动物向健侧旋转。而AMPH诱发动物向损伤侧旋转，其产生机理一般认为与D2受体无关，可能与健侧多巴胺的释放有关。但有作者[7]发现此药在正常大鼠也可诱发出旋转行为，即可出现假阳性，因而不如APO准确。
三、PD模型稳定性：
动物模型保持长期稳定性是非常重要和必需的。我们观察了纹状体毁损成功模型稳定性，发现动物6周时行为与8周、12周、16周时无明显改变，TH免疫组化也证实，3周与6周、8周、12周、16周时SNc及尾壳核区TH-IR数目无变化。Ichitani等[8]进一步观察了6-OHDA注入纹状体后更长期变化，发现SNc及纹状体形成一定程度损伤后，在6月及10月内无显著改变，同时也未发现纹状体有再生现象。这说明，纹状体损伤PD鼠模型是稳定可靠的。
, 百拇医药
此法建立PD大鼠模型是可行的，且较黑质毁损模型方法简单，成功率高，并能部分模拟人类PD进行性变性特征。从而为PD早、中期研究奠定了实验基础。
参考文献
1 邵宴平，焦守恕，王元身，等.脑细胞悬液移植治疗黑质损伤-1.黑质损伤动物模型的建立.北京第二医学院学报，1986，7：107.
2 Ichitani Y, Okamura H, Matsumoto Y, et al. Degeneration of the nigral dopamine neurons after 6-OHDA injection into the rat striatum. Brain Res, 1991, 549:350.
3 Espino A, Cutillas B, Tortosa A, et al. Chronic effects of single intrastriatal injections of 6-OHDA or MPTP studied by microdialysis in freely moving rats. Brain Res, 1995, 695:151.
, 百拇医药
4 Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Acadenic Press. Sydney. 1985.
5 Sauer H, Oertel WH. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine:A combined retrograde tracing and immunocyto-chemical study in the rat. Neuroscience, 1994, 54:401.
6 Przedborski S, Levivier M, Jiang H, et al. Dost-dependent lesions of the dopaminergic nigrostriatal pathway induced by intrastriatal injection of 6-OHDA. Neuroscience, 1995, 67:631.
, 百拇医药
7 Hudson JL, Van Horne CG, Stromberg I, et al. Correlation of apomorphine and amphetamine induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res, 1993, 626:167.
8 Ichitani Y, Okamura H, Nakahara D, et al. Biochemical and immunocytochemical changes induced by intrastriatal 6-OHDA injection in the rat nigrostriatal dopamine neuron system:Evidence for cell death in the substantia nigra. Exp Neurol, 1994, 130:269.
收稿日期：1996年12月18日
修稿日期：1997年7月25日, http://www.100md.com
单位：伦学庆 张延庆山东济宁医学院附属医院神经外科 (济宁 272129)；章 翔 张剑宁 陈良为 第四军医大学西京医院神经外科
关键词：
中国病理生理杂志990240 近来研究发现，经典黑质损伤帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)大鼠模型有以下不足：①毁损为急性(24 h内)过程，不符合人类PD进行性变性特征；②对黑质损伤较完全彻底，即建立的仅是晚期PD动物模型；③黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)相对较小、定位困难，模型成功率较低，一般为30%～40%左右[1]。最近，Ichitani[2]和Espino等[3]将6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)注入纹状体，发现黑质也可出现不同程度变性。借此，我们将6-OHDA注入纹状体，通过行为及免疫组化证实，成功地建立了纹状体损伤PD大鼠模型，为早、中期PD研究奠定了实验基础。
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材料与方法
(一)实验动物分组及处理：成年雌性SD大鼠30只，体重(220±30)g，随机分为2组：实验组25只，对照组5只。所有动物术前均经多次测试，确认其无旋转行为后进行实验。①实验组：大鼠以戊巴比妥钠(40 mg/kg ip)麻醉，颅平位固定于大鼠脑立体定向仪上，按Paxinos等[4]图谱确定右侧纹状体二坐标(①前囟前0.7mm,中线右侧3.0mm，硬膜下4.5mm；②前囟后0.2mm，中线右侧2.6mm，硬膜下6.0mm)。按此二坐标开颅并用微量注射器向每一点注射6-OHDA 10μg(溶于5μL含质量分数为0.2%抗坏血酸的生理盐水中)，注射速度0.5μL/min，注毕留针5min，并以1mm/min速度缓慢退出。②对照组用上述同样方法和坐标，仅注射含质量分数为0.2%抗坏血酸的生理盐水5μL。
(二)行为检测：分别于术后第2、4、6、8、12、16周行旋转行为测试。阿扑吗啡(apomorphine, APO)，0.5mg/kg背部皮下注射。注射10min后开始观察并记录大鼠旋转次数，观察30min，平均转速>6r/min视为成功模型，否则为不成功模型。
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(三)免疫组织化学：为了验证模型稳定性，另取16只大鼠，分别取6-OHDA注入后1周、2周、3周、4周和模型成功鼠及对照组动物各2只，麻醉后，经升主动脉灌注固定，取脑作冰冻切片，片厚40μm,用兔抗酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)血清进行免疫组织化学ABC法染色。(TH抗血清，第四军医大学解剖教研室提供；ABC试剂盒，Sigma产品)。光镜下观察结果。
结 果
(一)一般观察：所有动物注药后均能正常存活，无死亡。4周以后部分动物开始出现头偏斜，行走缓慢，尾僵直，自发旋转等。
(二)APO诱发旋转行为：术后6周，APO注射后92%以上动物于5min内开始出现旋转，旋转时以健侧后肢为支点原地转动，身体环曲，首尾相接。同时还出现明显的觅食及弓背样动作。大鼠旋转行为检测结果见表1，表2。
, http://www.100md.com 表1 注射6-OHDA后6周APO诱发大鼠旋转行为变化
Tab 1 The changes of APO induced rotation behaviour of rats
6 weeks after intrastriatal injections of 6-OHDA (
±s) Groupn
Rotation (r/min)
Experimental
25
6.3±0.5
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Continued rotation to left
21
6.8±0.4
Continued rotation to right
1
5.9±0.9
Rotation to right or left
1
5.5±0.3
No rotation
2
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Control
5
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表2 注射6-OHDA后不同时间大鼠旋转行为变化
Tab 2 The changes of rotation behaviour at different
time after intrastriatal injections of 6-OHDA (
±s) Week after injectionn
Rotation(r/min)
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4.8±0.8
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从表1中可看出，实验组25只大鼠有23只(92%)出现旋转，其中21只为恒定左转鼠且转速超过6 r/min，占实验组动物总数的84.0%，显著多于右转鼠(1只，占 4%)(P<0.01)。对照组5只均无旋转行为，与实验组也有显著差异。
由表2可见，第2周时无旋转，从第4周开始出现旋转行为，至第6周旋转行为稳定，8、12、16周与第6周时平均转速无显著差异，结果稳定。此21只恒定左转鼠被认为是PD旋转鼠成功模型。
(三)免疫组化：模型成功鼠右侧尾壳核区与对侧比较，TH-immunoreactivity(TH-IR)纤维数目明显降低，且第6、8、12、16周与第3周时无明显差异。右侧黑质术后2周内TH-IR神经元数目无改变，3周时开始降低，4周明显降低，6周时稳定，一直持续到实验结束无明显变化。左侧无论哪个时期黑质及尾壳核区TH-IR神经原及纤维数目均无明显改变。图1。
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Fig 1 TH-immunocytochemistry of the SN 6 weeks after unilateral 6-OHDA injection into the striatum. The number of the cell bodies and dendrites of the right were markedly lower, and that of the left were nomal(×40.A, left;B,right)
图1 纹状体内注射6-OHDA后6周，黑质区酪氨酸羟化酶免疫组化染色，右侧TH-IR神经元数目明显降低，左侧正常
讨 论
一、黑质-纹状体多巴胺能神经元损害特征与机理：
我们将6-OHDA注入纹状体后，TH免疫组化证实，注射侧SNc及尾壳核区TH-IR神经元及纤维数目较对侧显著降低，对照组双侧无变化。说明6-OHDA注入纹状体后，能引起同侧黑质-纹状体多巴胺能神经元逆行损害。目前对这种损害机理尚不清楚，但有两种可能的解释[5，6]：①6-OHDA注入纹状体后，纹状体末稍首先被选择性毁损，此后黑质神经元胞体通过逆行变性出现继发性损害，曾有文献报道，纹状体大部切除后3～4周，黑质神经元儿茶酚胺能荧光密度明显下降，说明这种逆行性损害的发生是逐渐出现的；②纹状体末稍摄取6-OHDA后，轴突将其逆行输送至黑质神经元胞体，然后引起细胞变性。支持该观点证据是，纹状体注入6-OHDA后2周内，黑质未见明显TH-IR神经元数目改变。
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二、药物诱发旋转行为：
药物诱发试验通常以动物是否出现旋转行为及旋转次数作为判断模型成功的标准，常用药物有APO和苯丙胺(AMPH)。APO诱发旋转行为发生不仅与纹状体多巴胺含量下降有关，还与其多巴胺D2受体代偿性增加及敏感性提高等有关。当APO注射时，便与该侧纹体内大量增加的D2受体结合。并使受体出现致敏现象，引起动物向健侧旋转。而AMPH诱发动物向损伤侧旋转，其产生机理一般认为与D2受体无关，可能与健侧多巴胺的释放有关。但有作者[7]发现此药在正常大鼠也可诱发出旋转行为，即可出现假阳性，因而不如APO准确。
三、PD模型稳定性：
动物模型保持长期稳定性是非常重要和必需的。我们观察了纹状体毁损成功模型稳定性，发现动物6周时行为与8周、12周、16周时无明显改变，TH免疫组化也证实，3周与6周、8周、12周、16周时SNc及尾壳核区TH-IR数目无变化。Ichitani等[8]进一步观察了6-OHDA注入纹状体后更长期变化，发现SNc及纹状体形成一定程度损伤后，在6月及10月内无显著改变，同时也未发现纹状体有再生现象。这说明，纹状体损伤PD鼠模型是稳定可靠的。
, 百拇医药
此法建立PD大鼠模型是可行的，且较黑质毁损模型方法简单，成功率高，并能部分模拟人类PD进行性变性特征。从而为PD早、中期研究奠定了实验基础。
参考文献
1 邵宴平，焦守恕，王元身，等.脑细胞悬液移植治疗黑质损伤-1.黑质损伤动物模型的建立.北京第二医学院学报，1986，7：107.
2 Ichitani Y, Okamura H, Matsumoto Y, et al. Degeneration of the nigral dopamine neurons after 6-OHDA injection into the rat striatum. Brain Res, 1991, 549:350.
3 Espino A, Cutillas B, Tortosa A, et al. Chronic effects of single intrastriatal injections of 6-OHDA or MPTP studied by microdialysis in freely moving rats. Brain Res, 1995, 695:151.
, 百拇医药
4 Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Acadenic Press. Sydney. 1985.
5 Sauer H, Oertel WH. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine:A combined retrograde tracing and immunocyto-chemical study in the rat. Neuroscience, 1994, 54:401.
6 Przedborski S, Levivier M, Jiang H, et al. Dost-dependent lesions of the dopaminergic nigrostriatal pathway induced by intrastriatal injection of 6-OHDA. Neuroscience, 1995, 67:631.
, 百拇医药
7 Hudson JL, Van Horne CG, Stromberg I, et al. Correlation of apomorphine and amphetamine induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res, 1993, 626:167.
8 Ichitani Y, Okamura H, Nakahara D, et al. Biochemical and immunocytochemical changes induced by intrastriatal 6-OHDA injection in the rat nigrostriatal dopamine neuron system:Evidence for cell death in the substantia nigra. Exp Neurol, 1994, 130:269.
收稿日期：1996年12月18日
修稿日期：1997年7月25日, http://www.100md.com