嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞迁移的影响
作者：王家宁 胡大一 马雅銮 刘 勃 高天祥
单位：胡大一 刘 勃 北京红十字朝阳医院心脏中心(北京100020)；高天祥 首都医科大学分子生物学室；王家宁 湖北省十堰市郧阳医学院附属医院心内科(442000)
关键词：肌；平滑；血管；基因；寡核苷酸类；反义
嵌合性硫代磷酸修饰的反义c 摘 要 目的：血管平滑肌细胞(SMC)迁移在血管成形术后再狭窄的发生中起着关键作用。c-myc是对多种刺激SMC迁移的生长因子作出迅速早期反应的基因。推测采用与c-myc mRNA互补的寡脱氧核苷酸(ODN)的反义战略可达到抑制SMC迁移的目的。方法：将嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc ODN通过lipofectin导入SMC后，采用改良的Boyden chamber方法检测SMC的迁移率。结果：反义c-myc ODN作用的SMC对10% FBS的化学趋化活性明显减弱，反义c-myc ODN显著抑制了SMC迁移。而正义c-myc ODN和错配c-myc ODN处理的SMC，与对照组相比，迁移率无差别。结论：(1)反义c-myc ODN对体外SMC迁移的抑制具有序列特异性；(2)c-myc基因表达在SMC迁移的信号通路中起关键作用；(3)本研究为采用c-myc ODN的战略抑制SMC迁移进而防止血管成形术后再狭窄的发生奠定了基础。
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The effect of chimeric antisense phosphorothioated c-myc
oligodeoxynucleotide on cultured rat smooth muscle cell migration
WANG Jia-Ning, HU Da-Yi, MA Ya-Luan, LIU Bo, GAO Tian-Xiang
The Heart Center, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing(100020)
Abstract AIM: Vascular smooth muscle cell (SMC) migration plays a pivotal role in restenosis following angioplasty. c-myc is an immediate early response gene induced by various growth factors, many of which have been found to stimulate SMC migration. It is reasoned that antisense oligodeoxynucleotide (ODN) complementary to c-myc mRNA might be potent inhibitors of SMC migration. METHOD: To confirm the hypothesis, chimeric antisense c-myc phosphorothioated ODN was introduced into cultured rat SMC by lipofectin. Migration activity was assayed by modified micro Boyden chamber method. RESULTS: The chemotactic activity of SMC treated with antisense c-myc ODN was inhibited significantly compared with that of other groups, whereas there was not a significant difference between control and mismatch or sense group. CONCLUSIONS: These results suggested:(1)Antisense c-myc ODN inhibits SMC migration in a sequence-specific manner; (2)c-myc product is involved in signalling transduction pathways mediating SMC migration in vitro;(3) The c-myc antisense approach might find its application in preventing restenosis after angioplasty.
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MeSH Muscle, smooth, vascular; Genes; Oligonucleotides, antisens
经皮腔内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)自从1977年成功以来，因其近期成功率高，迅速得到推广应用，目前PTCA已成为冠心病的主要治疗措施之一。但是术后3～6个月有30%～50%的患者发生再狭窄，再狭窄成为影响PTCA后远期疗效的主要限制因素[1]。
再狭窄的发生涉及到多个过程、多种因素的参与。其中动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)的迁移是再狭窄发生的机制之一[2～4]。SMC从中膜迁移至内膜是动脉损伤后SMC增殖和随后细胞外基质合成与分泌的必要前提。多种因素可刺激SMC迁移，包括血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、5-羟色胺、去甲肾上腺素、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)等，这些因子均能诱导c-myc基因的表达[5～7]。
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为了研究c-myc基因在SMC迁移的信号传导通路中的作用以及将c-myc基因作为抑制SMC迁移的可针对的分子靶点的可行性，本文采用嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN),通过阳离子脂质体lipofectin导入培养的SMC后，观察其对SMC迁移的影响。
材料与方法
1.材料：DMEM培养基，HEPES，lipofectin和胰蛋白酶均购自GIBCO/BRL公司，胎牛血清(FBS)购自中国医科院天津血研所，Sprague-Dawley大鼠购自首都医科大学动物室；改良的Boyden chamber购自江苏海门麒麟医用仪器厂；硝酸纤维素滤膜(孔径8μm,13mm)，孵箱(TABA，日本)，超净工作台，倒置相差显微镜，普通光学显微镜(Olympus)。
2.Sprague-Dawley大鼠动脉SMC的培养：所用Sprague-Dawley大鼠均为雄性，体重150～180 g，方法参照文献[8]。
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3.ODN的合成及其序列：ODN由美国Research公司合成，所合成的ODN经HPLC纯化，冻干保存。正义ODN、反义ODN和错配ODN的序列如下：正义(sense)序列5’ATG CCC CTC AAC GTG 3’，反义(antisense)序列5’CAC GTT GAG GGG CAT 3’，错配(mismatch)序列5’CAC GTG GAG TGG CAT 3’。ODN的5’端和3’端各三个磷酸二酯键经过硫代修饰。反义c-myc ODN针对的序列与大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区前5个密码子相互补，错配c-myc ODN的碱基组成与反义c-myc ODN的一样，但和靶序列不完全互补，正义c-myc ODN是与靶序列相一致的序列。
4.c-myc ODN的转染及SMC悬液的制备：将处于指数生长期的SMC接种于培养瓶孵育24 h后换无血清DMEM培养液静止SMC 24 h，然后换入含8μmol/L lipofectin的100 nmol/L的正义或反义或错配c-myc ODN的DMEM培养液，作用于SMC 4h后，换含20% FBS的DMEM培养液，继续培养24 h后，用胰蛋白酶消化下来，用适量DMEM培养液将细胞浓度调整为109/mL，并同时制备正常增殖SMC和静止SMC悬液，以作对照。
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5.SMC迁移试验：方法参照文献[9]。
6.试验分组：分为正常SMC增殖组、血清静止组、正义ODN组、错配ODN组和反义ODN组。
7.统计学处理：实验数据采用均值±标准差(
±s)表示。多组之间的两两比较采用q检验。
结 果
采用改良的Boyden chamber装置，观察了10%FBS对正义、反义和错配c-myc ODN处理的SMC的化学趋化性(chemotaxis)(见表1)。结果发现反义c-myc ODN处理的SMC对10%FBS的化学趋化性明显减弱，迁移率明显降低，与对照组、正义c-myc ODN组和错配c-myc ODN组间差异有显著，P<0.05，而正义c-myc ODN组、错配c-myc ODN组和对照组间差异无显著，P>0.05,反义c-myc ODN组与静止组间差异亦无显著。
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表1 嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc ODN对培养的
血管平滑肌细胞迁移的抑制作用
Tab 1 The inhibitory effect of chimeric antisense
c-myc phosphorothioated oligodeoxynucleotide on SMC
migratory activity(±s, n=20)
Group
, 百拇医药
Migration distance(μm)
Control
87.50±4.98
Quiescent
42.60±4.98
Antisense
42.60±2.70*
Sense
88.90±4.28
Mismatch
84.90±3.28
, 百拇医药
P<0.05, vs control 讨 论
1.反义c-myc ODN的设计：本文采用了反义c-myc ODN抑制SMC的迁移。c-myc ODN的反义序列与大鼠c-myc ODN包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子相互补，因为翻译起始区较少含有二级结构，便于反义ODN与靶序列结合。ODN是带大量负电荷的大分子物质，难以进入细胞内，本研究采用阳离子脂质体lipofectin作为ODN的携带系统，目的在于增加细胞对ODN的摄取。未经修饰的ODN易受细胞内外核酸酶的降解，为延长ODN的半衰期，对其进行了硫代磷酸修饰。考虑到ODN经硫代修饰后有可能降低其与靶序列的亲合性，本文对其5’端、3’端各3个磷酸二酯键进行了硫代修饰，其它磷酸二酯键未行修饰，因而是一种嵌合性修饰，两端的修饰是保护ODN免受核酸酶降解所必须的。
2.c-myc基因是SMC迁移信号传导通路的重要环节：多种引起SMC迁移的因素包括PDGF、EGF、FGF等都能诱导c-myc基因的表达。本研究采用了嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc ODN，通过lipofectin导入SMC后，显著抑制了SMC对10%FBS的化学趋化性，而正义c-myc ODN，错配c-myc ODN作用的SMC对10%FBS的迁移活性无明显改变，说明c-myc基因的表达参与了SMC迁移的信号传导通路。反义c-myc ODN导入SMC后可能抑制了SMC c-myc基因的表达，中断了多种因素引起的SMC迁移的信号传导通路，从而导致SMC迁移率的下降。
, 百拇医药
3.c-myc基因作为抑制SMC迁移的分子靶点的潜在应用价值：SMC的迁移在再狭窄发生中起着重要作用，是SMC增殖和合成与分泌细胞外基质的必要前提。Clowes等[4]采用3H-TdR标记增殖细胞，发现SMC在内膜剥脱后第4天开始迁移至内膜，迁移至内膜的SMC 50%从不进行分裂，这一部分细胞大约占内膜细胞的10%。尽管有多种生长因子和体液因素均能刺激SMC迁移，但它们大多都能引起c-myc基因的表达增高。采用反义c-myc ODN导入SMC后，通过其负调控靶基因的作用导致c-myc基因表达降低，就可以中断多种因素引起的SMC迁移，从而防止再狭窄的发生。
参考文献
1 Franklin SM, Faxon DP. Pharmacological prevention of restenosis after coronary angioplasty:reviews of randomized clinical trials. Coronary Artery Dis, 1993, 4:232.
, http://www.100md.com
2 Davies MG, Hagen PO. Pathology of intimal hyperplasia. Br J Surg, 1994, 81:1254.
3 IP JH, Fuster V, Bakimon L, et al. Syndromes of accelerated atherosclerosis: role of vascular injury and smooth muscle cell proliferation. J Am Coll Cardiol, 1990, 15:1667.
4 Clowes AW, Schwartz SM. Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res, 1985, 56:139.
5 Linder V, Lappi DA, Baird A, et al. Role of basic fibroblast growth factor in vascular lesion formation. Circ Res, 1991, 8:106.
, 百拇医药
6 Bell L, Madri MA. Effect of platelet factors on migration of cultured bovine aortic endothelial and smooth muscle cells. Circ Res, 1989, 65:1057.
7 Ferns GA, Raines EW, Sprugel KH, et al. Inhibition of neointimal smooth muscle accumulation after angioplasty by an antibody to PDGF. Science, 1991, 252:1129.
8 汪浩川，刘秉文，傅明德.人动脉平滑肌细胞贴块培养法.华西医科大学学报，1995， 26：105.
9 瞿智玲，邓仲端.培养的动脉平滑肌细胞迁移的微孔滤膜检测法.中国病理生理杂志，1995，11：334.
收稿日期：1997年3月26日
修稿日期：1997年12月9日, http://www.100md.com
单位：胡大一 刘 勃 北京红十字朝阳医院心脏中心(北京100020)；高天祥 首都医科大学分子生物学室；王家宁 湖北省十堰市郧阳医学院附属医院心内科(442000)
关键词：肌；平滑；血管；基因；寡核苷酸类；反义
嵌合性硫代磷酸修饰的反义c 摘 要 目的：血管平滑肌细胞(SMC)迁移在血管成形术后再狭窄的发生中起着关键作用。c-myc是对多种刺激SMC迁移的生长因子作出迅速早期反应的基因。推测采用与c-myc mRNA互补的寡脱氧核苷酸(ODN)的反义战略可达到抑制SMC迁移的目的。方法：将嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc ODN通过lipofectin导入SMC后，采用改良的Boyden chamber方法检测SMC的迁移率。结果：反义c-myc ODN作用的SMC对10% FBS的化学趋化活性明显减弱，反义c-myc ODN显著抑制了SMC迁移。而正义c-myc ODN和错配c-myc ODN处理的SMC，与对照组相比，迁移率无差别。结论：(1)反义c-myc ODN对体外SMC迁移的抑制具有序列特异性；(2)c-myc基因表达在SMC迁移的信号通路中起关键作用；(3)本研究为采用c-myc ODN的战略抑制SMC迁移进而防止血管成形术后再狭窄的发生奠定了基础。
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The effect of chimeric antisense phosphorothioated c-myc
oligodeoxynucleotide on cultured rat smooth muscle cell migration
WANG Jia-Ning, HU Da-Yi, MA Ya-Luan, LIU Bo, GAO Tian-Xiang
The Heart Center, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing(100020)
Abstract AIM: Vascular smooth muscle cell (SMC) migration plays a pivotal role in restenosis following angioplasty. c-myc is an immediate early response gene induced by various growth factors, many of which have been found to stimulate SMC migration. It is reasoned that antisense oligodeoxynucleotide (ODN) complementary to c-myc mRNA might be potent inhibitors of SMC migration. METHOD: To confirm the hypothesis, chimeric antisense c-myc phosphorothioated ODN was introduced into cultured rat SMC by lipofectin. Migration activity was assayed by modified micro Boyden chamber method. RESULTS: The chemotactic activity of SMC treated with antisense c-myc ODN was inhibited significantly compared with that of other groups, whereas there was not a significant difference between control and mismatch or sense group. CONCLUSIONS: These results suggested:(1)Antisense c-myc ODN inhibits SMC migration in a sequence-specific manner; (2)c-myc product is involved in signalling transduction pathways mediating SMC migration in vitro;(3) The c-myc antisense approach might find its application in preventing restenosis after angioplasty.
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MeSH Muscle, smooth, vascular; Genes; Oligonucleotides, antisens
经皮腔内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)自从1977年成功以来，因其近期成功率高，迅速得到推广应用，目前PTCA已成为冠心病的主要治疗措施之一。但是术后3～6个月有30%～50%的患者发生再狭窄，再狭窄成为影响PTCA后远期疗效的主要限制因素[1]。
再狭窄的发生涉及到多个过程、多种因素的参与。其中动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)的迁移是再狭窄发生的机制之一[2～4]。SMC从中膜迁移至内膜是动脉损伤后SMC增殖和随后细胞外基质合成与分泌的必要前提。多种因素可刺激SMC迁移，包括血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、5-羟色胺、去甲肾上腺素、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)等，这些因子均能诱导c-myc基因的表达[5～7]。
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为了研究c-myc基因在SMC迁移的信号传导通路中的作用以及将c-myc基因作为抑制SMC迁移的可针对的分子靶点的可行性，本文采用嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN),通过阳离子脂质体lipofectin导入培养的SMC后，观察其对SMC迁移的影响。
材料与方法
1.材料：DMEM培养基，HEPES，lipofectin和胰蛋白酶均购自GIBCO/BRL公司，胎牛血清(FBS)购自中国医科院天津血研所，Sprague-Dawley大鼠购自首都医科大学动物室；改良的Boyden chamber购自江苏海门麒麟医用仪器厂；硝酸纤维素滤膜(孔径8μm,13mm)，孵箱(TABA，日本)，超净工作台，倒置相差显微镜，普通光学显微镜(Olympus)。
2.Sprague-Dawley大鼠动脉SMC的培养：所用Sprague-Dawley大鼠均为雄性，体重150～180 g，方法参照文献[8]。
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3.ODN的合成及其序列：ODN由美国Research公司合成，所合成的ODN经HPLC纯化，冻干保存。正义ODN、反义ODN和错配ODN的序列如下：正义(sense)序列5’ATG CCC CTC AAC GTG 3’，反义(antisense)序列5’CAC GTT GAG GGG CAT 3’，错配(mismatch)序列5’CAC GTG GAG TGG CAT 3’。ODN的5’端和3’端各三个磷酸二酯键经过硫代修饰。反义c-myc ODN针对的序列与大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区前5个密码子相互补，错配c-myc ODN的碱基组成与反义c-myc ODN的一样，但和靶序列不完全互补，正义c-myc ODN是与靶序列相一致的序列。
4.c-myc ODN的转染及SMC悬液的制备：将处于指数生长期的SMC接种于培养瓶孵育24 h后换无血清DMEM培养液静止SMC 24 h，然后换入含8μmol/L lipofectin的100 nmol/L的正义或反义或错配c-myc ODN的DMEM培养液，作用于SMC 4h后，换含20% FBS的DMEM培养液，继续培养24 h后，用胰蛋白酶消化下来，用适量DMEM培养液将细胞浓度调整为109/mL，并同时制备正常增殖SMC和静止SMC悬液，以作对照。
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5.SMC迁移试验：方法参照文献[9]。
6.试验分组：分为正常SMC增殖组、血清静止组、正义ODN组、错配ODN组和反义ODN组。
7.统计学处理：实验数据采用均值±标准差(
±s)表示。多组之间的两两比较采用q检验。结 果
采用改良的Boyden chamber装置，观察了10%FBS对正义、反义和错配c-myc ODN处理的SMC的化学趋化性(chemotaxis)(见表1)。结果发现反义c-myc ODN处理的SMC对10%FBS的化学趋化性明显减弱，迁移率明显降低，与对照组、正义c-myc ODN组和错配c-myc ODN组间差异有显著，P<0.05，而正义c-myc ODN组、错配c-myc ODN组和对照组间差异无显著，P>0.05,反义c-myc ODN组与静止组间差异亦无显著。
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表1 嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc ODN对培养的
血管平滑肌细胞迁移的抑制作用
Tab 1 The inhibitory effect of chimeric antisense
c-myc phosphorothioated oligodeoxynucleotide on SMC
migratory activity(
±s, n=20)Group
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Migration distance(μm)
Control
87.50±4.98
Quiescent
42.60±4.98
Antisense
42.60±2.70*
Sense
88.90±4.28
Mismatch
84.90±3.28
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P<0.05, vs control 讨 论
1.反义c-myc ODN的设计：本文采用了反义c-myc ODN抑制SMC的迁移。c-myc ODN的反义序列与大鼠c-myc ODN包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子相互补，因为翻译起始区较少含有二级结构，便于反义ODN与靶序列结合。ODN是带大量负电荷的大分子物质，难以进入细胞内，本研究采用阳离子脂质体lipofectin作为ODN的携带系统，目的在于增加细胞对ODN的摄取。未经修饰的ODN易受细胞内外核酸酶的降解，为延长ODN的半衰期，对其进行了硫代磷酸修饰。考虑到ODN经硫代修饰后有可能降低其与靶序列的亲合性，本文对其5’端、3’端各3个磷酸二酯键进行了硫代修饰，其它磷酸二酯键未行修饰，因而是一种嵌合性修饰，两端的修饰是保护ODN免受核酸酶降解所必须的。
2.c-myc基因是SMC迁移信号传导通路的重要环节：多种引起SMC迁移的因素包括PDGF、EGF、FGF等都能诱导c-myc基因的表达。本研究采用了嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc ODN，通过lipofectin导入SMC后，显著抑制了SMC对10%FBS的化学趋化性，而正义c-myc ODN，错配c-myc ODN作用的SMC对10%FBS的迁移活性无明显改变，说明c-myc基因的表达参与了SMC迁移的信号传导通路。反义c-myc ODN导入SMC后可能抑制了SMC c-myc基因的表达，中断了多种因素引起的SMC迁移的信号传导通路，从而导致SMC迁移率的下降。
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3.c-myc基因作为抑制SMC迁移的分子靶点的潜在应用价值：SMC的迁移在再狭窄发生中起着重要作用，是SMC增殖和合成与分泌细胞外基质的必要前提。Clowes等[4]采用3H-TdR标记增殖细胞，发现SMC在内膜剥脱后第4天开始迁移至内膜，迁移至内膜的SMC 50%从不进行分裂，这一部分细胞大约占内膜细胞的10%。尽管有多种生长因子和体液因素均能刺激SMC迁移，但它们大多都能引起c-myc基因的表达增高。采用反义c-myc ODN导入SMC后，通过其负调控靶基因的作用导致c-myc基因表达降低，就可以中断多种因素引起的SMC迁移，从而防止再狭窄的发生。
参考文献
1 Franklin SM, Faxon DP. Pharmacological prevention of restenosis after coronary angioplasty:reviews of randomized clinical trials. Coronary Artery Dis, 1993, 4:232.
, http://www.100md.com
2 Davies MG, Hagen PO. Pathology of intimal hyperplasia. Br J Surg, 1994, 81:1254.
3 IP JH, Fuster V, Bakimon L, et al. Syndromes of accelerated atherosclerosis: role of vascular injury and smooth muscle cell proliferation. J Am Coll Cardiol, 1990, 15:1667.
4 Clowes AW, Schwartz SM. Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res, 1985, 56:139.
5 Linder V, Lappi DA, Baird A, et al. Role of basic fibroblast growth factor in vascular lesion formation. Circ Res, 1991, 8:106.
, 百拇医药
6 Bell L, Madri MA. Effect of platelet factors on migration of cultured bovine aortic endothelial and smooth muscle cells. Circ Res, 1989, 65:1057.
7 Ferns GA, Raines EW, Sprugel KH, et al. Inhibition of neointimal smooth muscle accumulation after angioplasty by an antibody to PDGF. Science, 1991, 252:1129.
8 汪浩川，刘秉文，傅明德.人动脉平滑肌细胞贴块培养法.华西医科大学学报，1995， 26：105.
9 瞿智玲，邓仲端.培养的动脉平滑肌细胞迁移的微孔滤膜检测法.中国病理生理杂志，1995，11：334.
收稿日期：1997年3月26日
修稿日期：1997年12月9日, http://www.100md.com