甲硫－脑啡肽对脾交感神经活动的双向调节作用
作者：舒翠莉 林树新 贾 斌 张莉莉
单位：第四军医大学病理生理学教研室(西安 710033)
关键词：注射；脑室内；甲硫-脑啡肽；甲硫氨酸；脾；交感神经系统；纳络酮
甲硫 摘 要 目的：观察第三脑室微量注射甲硫-脑啡肽(met-enkephalin,Met-Enk)对脾交感神经放电活动的影响。方法：用urethane和α-chloralose麻醉的雄性Sprague-Dawley大鼠，于第三脑室分别微量注射Met-Enk 1μg和100μg。结果：脾交感神经放电活动的双向调节作用，即微量注射1μg Met-Enk时脾交感神经冲动数会减少，而注射100μg Met-Enk时脾交感神经冲动数会增多。事先静脉注射阿片受体阻断剂纳络酮(naloxone,Nal)均可以阻断这两种效应，但单独使用Nal对脾交感神经兴奋性没有影响。随脾交感神经冲动数的增多和减少，血压亦有一定程度的升高和降低，但体温无明显变化。结论：Met-Enk可以在中枢神经系统内通过阿片受体介导的通路调节脾交感神经的兴奋性。
, 百拇医药
Bidirectional modulation of splenic sympathetic nerve activity by methionine-enkephalin
SHU Cui-Li, LIN Shu-Xin, JIA Bin, ZHANG LI-LI
Department of Pathophysiology,Fourth Military Medical University,Xian(710033)
Abstract AIM：To investigate the action of met-enkephalin(Met-Enk)injected into the third cerebral ventricle on splenic sympathetic nerve activity in this study.METHODS:Male Sprague-Dawley rats with urethane and α-chloralose anaesthesia were used.RESULTS:After microinjection of Met-Enk(1μg and 100μg respectively)into the third cerebral ventricle,we found that microinjection with 1μg Met-Enk into the third cerebral ventricle produced a depress on the splenic sympathetic nerve filaments,while 100μg Met-Enk produced an increase of the splenic sympathetic nerve filaments.This effect could be blocked by intravenous injection of opioid receptor antagonist naloxone(Nal),while Nal alone injected intravenously had no effect on the splenic nerve activity.The blood pressure changes with discharges of splenic nerve activity,while body temperature had no change.CONCLUSION:Met-Enk can modulate splenic sympathetic nerve activity through opioid receptors in the central nervous system.
, 百拇医药
MeSH Injections,intraventricular;Enkephalin，methionine;Spleen;Sympathetic nervous system;Naloxone
自从在中枢神经系统内发现脑啡肽以来，研究者们对其中枢作用做了多方面的研究，如甲硫-脑啡肽(met-enkephalin,Met-Enk)对催乳素、生长激素、血管加压素等分泌的调节，Met-Enk的中枢镇痛效应，以及Met-Enk通过中枢对呼吸、循环系统机能的调节。我们以前的工作表明[1，2]，在第三脑室内注射白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-α(IFN-α)可分别对脾交感神经电活动产生抑制和增强效应，且这两种效应均可被阿片受体阻断剂纳络酮所阻断。这些现象提示在中枢神经系统内，阿片肽有可能参与了对脾交感神经兴奋性的调节。为此，本研究拟观察第三脑室内微量注射Met-Enk对脾交感神经放电活动的影响。
材料与方法
, 百拇医药
(一)动物：雄性SD大鼠，体重(270±30)g，由本校实验动物中心提供。
(二)试剂：甲硫-脑啡肽，纳络酮(美国Sigma公司出品)
(三)动物手术：大鼠用15% urethane+1.3% chloralose(0.5mL/100g,ip)麻醉。气管插管以维持气道通畅。行右侧股动脉、股静脉插管，分别用于记录血压和静脉注射药物。按Paxinos图谱[3]定位第三脑室，坐标为：Bregma后1.8mm、左右0mm、向下7.5～8.5mm，实验时用微量进样器以1μL/min的速度注射药物，每次注射液体量不超过3 μL。屏蔽室内将大鼠固定于恒温加热垫上，温度控制在37～38℃之间，大鼠取右侧卧位，行左腋后线侧切口，在肋缘下打开腹腔，在解剖显微镜下用玻璃神经剥离器从脾脏血管的伴行神经中分离出一束神经纤维备用。
(四)脾交感神经冲动的鉴定与记录：将分离出的神经纤维束于靠近脾脏处切断，将近中端搭在双极铂电极上，并与电极一起浸泡在石蜡油中。脾神经电信号经前置放大器放大后，送入IBM PC/XT微机，由自行开发的“神经元放电检测系统”进行处理。该系统接收到神经电信号并进行数据分析。可以通过调节系统的阈值，使其固定在噪音之上，以排除噪音的干扰，记录每10s内脾交感神经发放的超过设定阈值的神经冲动数。由于认为脾神经只由传出的去甲肾上腺素能神经纤维组成，不存在胆碱能神经纤维，所以记录的冲动数反映的是脾交感神经的活动。在脑室注射药物之前，以0.01%的苯肾上腺素静脉注射，引起血压的升高而反射性引起脾神经冲动数减少，检验所分离的纤维是脾交感神经纤维，也可以用窒息引起神经放电的增强进一步验证。脾神经冲动记录稳定30 min后再向脑室内注射药物，每只动物只记录一束神经纤维。
, 百拇医药
(五)血压和体温记录：实验中同步记录动脉血压，每隔10min记录一次直肠温度。
(六)实验后鉴定：实验结束后，向脑室内注入1%的龙胆紫5μL，立即静脉注入空气处死动物，开颅取脑，用10%的甲醛溶液固定24h，切片鉴定药物注射部位，凡药物未注入第三脑室的动物实验结果均弃去。
(七)数据统计：所有数据以均数±标准差(
±s)表示，实验组与对照组之间用t检验判断差异显著性。
结 果
一、Met-Enk对脾交感神经活动的影响：
, http://www.100md.com 在第三脑室内注射Met-Enk(1μg/rat，n＝6)后，脾交感神经冲动数在注射药物后的15～20 min后开始减少，在第20min时即与脑室内注射生理盐水组(n＝6)有显著差异(P<0.01)，这种减少作用持续至注药后的第40～45min，约持续30min，然后脾交感神经冲动又恢复至注药前水平，(图1b、图2a)。
第三脑室内注射高剂量的Met-Enk时(100μg/rat,n＝6)，脾神经冲动放电数在注射药物后5～8min即明显增高，在注药后第10min与脑室内注射生理盐水组有明显差异(P<0.01)，这种升高现象一直持续至实验终止(90min)，(图1c、图2b)。
生理盐水对照组(normal saline,NS control,n＝6)脾交感神经冲动数在注药前后无明显变化，(图1a)。
二、Nal阻断Met-Enk对脾交感神经放电活动的影响：
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为了验证阿片受体在Met-Enk影响脾交感神经冲动放电活动中的作用，用阿片受体阻断剂Nal(1 mg/kg)作静脉注射，10min后再经第三脑室注射Met-Enk(1μg,100μg/rat n＝6)。Nal单独静脉注射对脾交感神经冲动数无明显影响。但事先经静脉注射Nal后再给第三脑室内注射Met-Enk(1μg,100μg/rat)，便分别完全阻断了Met-Enk对脾交感神经冲动发放的抑制和增强作用，(图3a,b)。
三、脑室内注射Met-Enk对直肠温度和血压的影响：
第三脑室内注射Met-Enk(1μg,100μg/rat)，连续观察直肠温度和血压的变化直至实验结束(注射药物后90min)。体温未见有明显的变化。第三脑室内注射1μg Met-Enk后的第25～35min血压开始降低，即在脾交感神经冲动数减少后的第10min开始降低，降低幅度约为1.0kPa，持续约20 min后恢复正常。第三脑室内注射100μg Met-Enk后，在脾交感神经冲动数增加后的20～25min血压升高可达2kPa，并一直持续至实验结束。
, 百拇医药
Fig 1 Effect of icv injection of Met-Enk on the splenic sympathetic nerve discharges
a:icv injection of NS has no effect on the splenic sympathetic nerve discharges.b:icv injection of Met-Enk(1μg)depresses the splenic sympathetic nerve discharges.c:icv injection of Met-Enk(100μg)enhances the splenic sympathetic nerve discharges 图1 脑室内注射Met-Enk对脾交感神经放电活动的影响
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Fig 2 Effect of icv injection of Met-Enk(1μg,100μg)on the splenic sympathetic nerve discharges
a:icv injection of Met-Enk(1μg)depresses the splenic sympathetic nerve discharges. b:icv injection of Met-Enk(100μg)enhances the splenic sympathetic nerve discharges.P<0.05 P<0.01，vs NS group n＝6 图2 脑室内注射Met-Enk(1μg,100μg)对脾交感神经放电活动的影响
, 百拇医药 Fig 3 The effect of Met-Enk(1μg,100μg) on the splenic sympathetic nerve discharges can be blocked by naloxone.
a:The depressing effect of small dose Met-Enk(1μg) on the splenic sympathetic nerve discharges can be blocked by naloxone. b:The enhancing effect of large dose Met-Enk(100μg)on the splenic sympathetic nerve discharges can be blocked by naloxone.(a):P<0.01，vs Nal-Enk group；(b):P<0.01，vs Nal-Enk group，n＝6 图3 Nal阻断Met-Enk(1μg,100μg)对脾交感神经放电活动的影响
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讨 论
Met-Enk作为中枢神经递质，其血脑屏障的通透率很低，并且在血液中有大量的高降解能力的氨基肽酶[4]，可以在很短的时间内将血液中的Met-Enk降解。因此第三脑室内注射Met-Enk后引起的脾交感神经冲动数的变化，是Met-Enk与第三脑室周围组织作用的结果。低剂量的Met-Enk注入第三脑室后与第三脑室侧壁及附近组织的阿片受体相互作用，以某种途径抑制了脾交感神经冲动电活动，而高剂量Met-Enk引起的脾交感神经冲动电活动增强，这也许是由于高浓度的阿片肽可与多种不同的阿片受体亚型交叉结合[5]，而产生与低浓度阿片肽不同的效应。但这种配体、受体结合的低特异性可能并非是脑室内注射高剂量Met-Enk后产生脾交感神经兴奋性增强的唯一原因。因为当将阿片肽注入脑的不同区域后，往往会产生部位特异性的相反的生物学效应[6]，因此高剂量的Met-Enk可能会影响较大脑区域内的具有不同功能的神经核团。这样看来，脑室内注射Met-Enk所产生的最终效应取决于其所影响脑区域范围内的神经核团和其所结合的阿片受体亚型的净效应。
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本实验中未观察到体温有明显的变化，却观察到血压的变化，但是血压是在脾交感神经冲动数发生变化后的一段时间后才继发变化的，这说明Met-Enk对脾交感神经兴奋性的调节作用不是由于体温或血压的变化而产生的机体反射性调节，实验中出现的血压变化可能是由于第三脑室内注射Met-Enk后，交感神经系统兴奋性改变而致。
参考文献
1 李德敏，林树新.脑室注射白细胞介素-2抑制脾交感神经活动.生理学报，1996，48：482.
2 李德敏，林树新.大鼠脑室注射α干扰素增强脾交感神经活动.第四军医大学学报，1997，18：238.
3 Paxinos G,Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates.New York:Academic Press,1986.40～60，109～120.
, 百拇医药
4 Roda LG,Marco D,Possenti R.Stability of peripheral enkephalin.In:Ehrenpreis,Sicuteri F.eds.Degradation of endogenous opioid.New York:Raven Press,1983.25～42.
5 Paterson Sl,Robson LE,Kosterlit,HW.Opioid receptors.In:Udenfriend JM.ed.The reptides:analysis,synthesis and biology.Orlando:Academic Press,1984.147～189.
6 Jankovic BD,Radulovic J.Enkephalins,brain and immunity:Modulation of immune responses by methionine-enkephalin injected into the cerebral cavity.Int J Neurosci，1992,67:241.
收稿日期：1997年4月29日
修稿日期：1998年6月26日, http://www.100md.com
单位：第四军医大学病理生理学教研室(西安 710033)
关键词：注射；脑室内；甲硫-脑啡肽；甲硫氨酸；脾；交感神经系统；纳络酮
甲硫 摘 要 目的：观察第三脑室微量注射甲硫-脑啡肽(met-enkephalin,Met-Enk)对脾交感神经放电活动的影响。方法：用urethane和α-chloralose麻醉的雄性Sprague-Dawley大鼠，于第三脑室分别微量注射Met-Enk 1μg和100μg。结果：脾交感神经放电活动的双向调节作用，即微量注射1μg Met-Enk时脾交感神经冲动数会减少，而注射100μg Met-Enk时脾交感神经冲动数会增多。事先静脉注射阿片受体阻断剂纳络酮(naloxone,Nal)均可以阻断这两种效应，但单独使用Nal对脾交感神经兴奋性没有影响。随脾交感神经冲动数的增多和减少，血压亦有一定程度的升高和降低，但体温无明显变化。结论：Met-Enk可以在中枢神经系统内通过阿片受体介导的通路调节脾交感神经的兴奋性。
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Bidirectional modulation of splenic sympathetic nerve activity by methionine-enkephalin
SHU Cui-Li, LIN Shu-Xin, JIA Bin, ZHANG LI-LI
Department of Pathophysiology,Fourth Military Medical University,Xian(710033)
Abstract AIM：To investigate the action of met-enkephalin(Met-Enk)injected into the third cerebral ventricle on splenic sympathetic nerve activity in this study.METHODS:Male Sprague-Dawley rats with urethane and α-chloralose anaesthesia were used.RESULTS:After microinjection of Met-Enk(1μg and 100μg respectively)into the third cerebral ventricle,we found that microinjection with 1μg Met-Enk into the third cerebral ventricle produced a depress on the splenic sympathetic nerve filaments,while 100μg Met-Enk produced an increase of the splenic sympathetic nerve filaments.This effect could be blocked by intravenous injection of opioid receptor antagonist naloxone(Nal),while Nal alone injected intravenously had no effect on the splenic nerve activity.The blood pressure changes with discharges of splenic nerve activity,while body temperature had no change.CONCLUSION:Met-Enk can modulate splenic sympathetic nerve activity through opioid receptors in the central nervous system.
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MeSH Injections,intraventricular;Enkephalin，methionine;Spleen;Sympathetic nervous system;Naloxone
自从在中枢神经系统内发现脑啡肽以来，研究者们对其中枢作用做了多方面的研究，如甲硫-脑啡肽(met-enkephalin,Met-Enk)对催乳素、生长激素、血管加压素等分泌的调节，Met-Enk的中枢镇痛效应，以及Met-Enk通过中枢对呼吸、循环系统机能的调节。我们以前的工作表明[1，2]，在第三脑室内注射白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-α(IFN-α)可分别对脾交感神经电活动产生抑制和增强效应，且这两种效应均可被阿片受体阻断剂纳络酮所阻断。这些现象提示在中枢神经系统内，阿片肽有可能参与了对脾交感神经兴奋性的调节。为此，本研究拟观察第三脑室内微量注射Met-Enk对脾交感神经放电活动的影响。
材料与方法
, 百拇医药
(一)动物：雄性SD大鼠，体重(270±30)g，由本校实验动物中心提供。
(二)试剂：甲硫-脑啡肽，纳络酮(美国Sigma公司出品)
(三)动物手术：大鼠用15% urethane+1.3% chloralose(0.5mL/100g,ip)麻醉。气管插管以维持气道通畅。行右侧股动脉、股静脉插管，分别用于记录血压和静脉注射药物。按Paxinos图谱[3]定位第三脑室，坐标为：Bregma后1.8mm、左右0mm、向下7.5～8.5mm，实验时用微量进样器以1μL/min的速度注射药物，每次注射液体量不超过3 μL。屏蔽室内将大鼠固定于恒温加热垫上，温度控制在37～38℃之间，大鼠取右侧卧位，行左腋后线侧切口，在肋缘下打开腹腔，在解剖显微镜下用玻璃神经剥离器从脾脏血管的伴行神经中分离出一束神经纤维备用。
(四)脾交感神经冲动的鉴定与记录：将分离出的神经纤维束于靠近脾脏处切断，将近中端搭在双极铂电极上，并与电极一起浸泡在石蜡油中。脾神经电信号经前置放大器放大后，送入IBM PC/XT微机，由自行开发的“神经元放电检测系统”进行处理。该系统接收到神经电信号并进行数据分析。可以通过调节系统的阈值，使其固定在噪音之上，以排除噪音的干扰，记录每10s内脾交感神经发放的超过设定阈值的神经冲动数。由于认为脾神经只由传出的去甲肾上腺素能神经纤维组成，不存在胆碱能神经纤维，所以记录的冲动数反映的是脾交感神经的活动。在脑室注射药物之前，以0.01%的苯肾上腺素静脉注射，引起血压的升高而反射性引起脾神经冲动数减少，检验所分离的纤维是脾交感神经纤维，也可以用窒息引起神经放电的增强进一步验证。脾神经冲动记录稳定30 min后再向脑室内注射药物，每只动物只记录一束神经纤维。
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(五)血压和体温记录：实验中同步记录动脉血压，每隔10min记录一次直肠温度。
(六)实验后鉴定：实验结束后，向脑室内注入1%的龙胆紫5μL，立即静脉注入空气处死动物，开颅取脑，用10%的甲醛溶液固定24h，切片鉴定药物注射部位，凡药物未注入第三脑室的动物实验结果均弃去。
(七)数据统计：所有数据以均数±标准差(
±s)表示，实验组与对照组之间用t检验判断差异显著性。结 果
一、Met-Enk对脾交感神经活动的影响：
, http://www.100md.com 在第三脑室内注射Met-Enk(1μg/rat，n＝6)后，脾交感神经冲动数在注射药物后的15～20 min后开始减少，在第20min时即与脑室内注射生理盐水组(n＝6)有显著差异(P<0.01)，这种减少作用持续至注药后的第40～45min，约持续30min，然后脾交感神经冲动又恢复至注药前水平，(图1b、图2a)。
第三脑室内注射高剂量的Met-Enk时(100μg/rat,n＝6)，脾神经冲动放电数在注射药物后5～8min即明显增高，在注药后第10min与脑室内注射生理盐水组有明显差异(P<0.01)，这种升高现象一直持续至实验终止(90min)，(图1c、图2b)。
生理盐水对照组(normal saline,NS control,n＝6)脾交感神经冲动数在注药前后无明显变化，(图1a)。
二、Nal阻断Met-Enk对脾交感神经放电活动的影响：
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为了验证阿片受体在Met-Enk影响脾交感神经冲动放电活动中的作用，用阿片受体阻断剂Nal(1 mg/kg)作静脉注射，10min后再经第三脑室注射Met-Enk(1μg,100μg/rat n＝6)。Nal单独静脉注射对脾交感神经冲动数无明显影响。但事先经静脉注射Nal后再给第三脑室内注射Met-Enk(1μg,100μg/rat)，便分别完全阻断了Met-Enk对脾交感神经冲动发放的抑制和增强作用，(图3a,b)。
三、脑室内注射Met-Enk对直肠温度和血压的影响：
第三脑室内注射Met-Enk(1μg,100μg/rat)，连续观察直肠温度和血压的变化直至实验结束(注射药物后90min)。体温未见有明显的变化。第三脑室内注射1μg Met-Enk后的第25～35min血压开始降低，即在脾交感神经冲动数减少后的第10min开始降低，降低幅度约为1.0kPa，持续约20 min后恢复正常。第三脑室内注射100μg Met-Enk后，在脾交感神经冲动数增加后的20～25min血压升高可达2kPa，并一直持续至实验结束。
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Fig 1 Effect of icv injection of Met-Enk on the splenic sympathetic nerve discharges
a:icv injection of NS has no effect on the splenic sympathetic nerve discharges.b:icv injection of Met-Enk(1μg)depresses the splenic sympathetic nerve discharges.c:icv injection of Met-Enk(100μg)enhances the splenic sympathetic nerve discharges 图1 脑室内注射Met-Enk对脾交感神经放电活动的影响
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Fig 2 Effect of icv injection of Met-Enk(1μg,100μg)on the splenic sympathetic nerve discharges
a:icv injection of Met-Enk(1μg)depresses the splenic sympathetic nerve discharges. b:icv injection of Met-Enk(100μg)enhances the splenic sympathetic nerve discharges.P<0.05 P<0.01，vs NS group n＝6 图2 脑室内注射Met-Enk(1μg,100μg)对脾交感神经放电活动的影响
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a:The depressing effect of small dose Met-Enk(1μg) on the splenic sympathetic nerve discharges can be blocked by naloxone. b:The enhancing effect of large dose Met-Enk(100μg)on the splenic sympathetic nerve discharges can be blocked by naloxone.(a):P<0.01，vs Nal-Enk group；(b):P<0.01，vs Nal-Enk group，n＝6 图3 Nal阻断Met-Enk(1μg,100μg)对脾交感神经放电活动的影响
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Met-Enk作为中枢神经递质，其血脑屏障的通透率很低，并且在血液中有大量的高降解能力的氨基肽酶[4]，可以在很短的时间内将血液中的Met-Enk降解。因此第三脑室内注射Met-Enk后引起的脾交感神经冲动数的变化，是Met-Enk与第三脑室周围组织作用的结果。低剂量的Met-Enk注入第三脑室后与第三脑室侧壁及附近组织的阿片受体相互作用，以某种途径抑制了脾交感神经冲动电活动，而高剂量Met-Enk引起的脾交感神经冲动电活动增强，这也许是由于高浓度的阿片肽可与多种不同的阿片受体亚型交叉结合[5]，而产生与低浓度阿片肽不同的效应。但这种配体、受体结合的低特异性可能并非是脑室内注射高剂量Met-Enk后产生脾交感神经兴奋性增强的唯一原因。因为当将阿片肽注入脑的不同区域后，往往会产生部位特异性的相反的生物学效应[6]，因此高剂量的Met-Enk可能会影响较大脑区域内的具有不同功能的神经核团。这样看来，脑室内注射Met-Enk所产生的最终效应取决于其所影响脑区域范围内的神经核团和其所结合的阿片受体亚型的净效应。
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本实验中未观察到体温有明显的变化，却观察到血压的变化，但是血压是在脾交感神经冲动数发生变化后的一段时间后才继发变化的，这说明Met-Enk对脾交感神经兴奋性的调节作用不是由于体温或血压的变化而产生的机体反射性调节，实验中出现的血压变化可能是由于第三脑室内注射Met-Enk后，交感神经系统兴奋性改变而致。
参考文献
1 李德敏，林树新.脑室注射白细胞介素-2抑制脾交感神经活动.生理学报，1996，48：482.
2 李德敏，林树新.大鼠脑室注射α干扰素增强脾交感神经活动.第四军医大学学报，1997，18：238.
3 Paxinos G,Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates.New York:Academic Press,1986.40～60，109～120.
, 百拇医药
4 Roda LG,Marco D,Possenti R.Stability of peripheral enkephalin.In:Ehrenpreis,Sicuteri F.eds.Degradation of endogenous opioid.New York:Raven Press,1983.25～42.
5 Paterson Sl,Robson LE,Kosterlit,HW.Opioid receptors.In:Udenfriend JM.ed.The reptides:analysis,synthesis and biology.Orlando:Academic Press,1984.147～189.
6 Jankovic BD,Radulovic J.Enkephalins,brain and immunity:Modulation of immune responses by methionine-enkephalin injected into the cerebral cavity.Int J Neurosci，1992,67:241.
收稿日期：1997年4月29日
修稿日期：1998年6月26日, http://www.100md.com