低剂量辐射增强小鼠胸腺细胞PKC亚型的表达
作者：谢 风 高 申 刘树铮
单位：谢 风 高 申 刘树铮 白求恩医科大学中日联谊医院检验科(长春 130021)
关键词：辐射剂量；蛋白激酶C；流式细胞术；胸腺
中国病理生理杂志990220 摘 要 目的和方法：本实验采用流式细胞术研究了不同剂量X射线全身照射后4、12、24和48h，昆明小鼠胸腺细胞蛋白激酶C亚型表达的变化。结果：75mGy全身照射后PKC-α、β1、β2表达均有增强，于照射后12h达峰值，PKC-α、β2于48h恢复至假照水平，PKC-β1于48 h仍明显增高。4Gy照射后，PKC-α表达显著下降。
Increased expression of PKC isoforms in thymocytes
, http://www.100md.com
after WBI with low dose X-rays
XIE Feng, GAO Shen, LIU Shu-Zheng
Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun (130021)
Abstract AIM and METHODS: Male Kunming mice were whole-body irradiated with 75 mGy or 4 Gy X-rays. The expressions of PKC (protein kinase C) isoforms of thymic lymphocytes were analyzed by immuno-fluorescence flow cytometry with corresponding polyclonal antibodies at different time intervals after irradiation. RESULTS: The positive cells for PKC α，PKC β1 and β2 all increased after WBI with 75 mGy, reaching its peak 12 hours after WBI. The expressions of PKC α，β2returned to normal level, and the expression of PKC β2 still remained at a higher level than normal 48 hours after WBI with 75 mGy. The positive cells for PKC α decreased 24 and 48 hours after WBI with 4 Gy. CONCLUSION: Low dose radiation can induce expression of PKC isoforns and promote signal transduction of T lymphocytes.
, http://www.100md.com
MeSH Radiation dosage; Protein kinase C; Flow cytometry; Thymocytes
近几年来，大量的实验使人们逐步认识到低剂量辐射能够引发一些高剂量辐射所致不同的生物效应，已成为辐射研究领域的一个新的热点。其作用机制正不断被揭示[1]。就淋巴细胞信号传递系统而言，本实验室报道75mGy X射线单次全身照射后，小鼠TCR/CD3的表达增强，c-fos,c-jun表达上调，细胞内[Ca2+]i动员加快，PKC总活性增高[2]。对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)亚型的研究尚未见报道。本实验应用流式细胞术，观察低剂量照射后不同时间PKC-α，PKC-β1及PKC-β2蛋白表达的变化，进一步分析低剂量辐射对信号传递的影响。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、实验动物：
雄性昆明系小鼠20±2g，购于白求恩医科大学实验动物部。设75mGy、4Gy照射组和假照组，照射后4、12、24、48h断头处死小鼠取胸腺，制单细胞悬液。每组15只鼠，每3只小鼠的胸腺细胞混合为一样本，即每组n=5。
二、照射条件：
Philips深部X射线全身照射(WBI)，电压200kV，电流10mA，滤过板0.5mm铜，1.0mm铝，球靶距50cm或212cm，总剂量为4Gy(剂量率0.287Gy/min)和75mGy(剂量率12.5mGy/min)。
三、荧光抗体标记：
PKC-α，PKC-β1及PKC-β2多克隆抗体(Santa Cruz，美国)，羊抗兔IgG-FITC(Jackson,美国)，PMA(Sigma)。调单细胞悬液为1×107/mL，(悬于含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养基中)，然后加入PMA，终浓度为100nmol/L，于37℃，体积分数为5%CO2孵箱中培育，20min后用PBS洗二次，加第一抗体PKC-α,PKCβ1，PKCβ2(1∶50稀释)50μL,4℃反应45min，PBS洗涤二次，加第二抗体羊抗兔IgG-FITC(1:100稀释)20μL, 4℃反应45min，PBS洗二次后进行FCM分析。
, 百拇医药
四、用Coulter Elite流式细胞仪对细胞进行FCM多参数分析，激光光源15 mW氩离子激光，波长488nm,收集10000个细胞，进行FCM分析。
五、所有数据均以平均数和标准差(
±s)表示，各组之间的数值比较采用两样本均数t检验。
结 果
一、PKC-α的表达：
PKC-α阳性细胞数在75mGy X射线照射后12h及24h明显增加，而4Gy X射线照射后数量明显下降，见表1。
表1 75mGy与4Gy X射线全身照射后胸腺细胞PKC-α的表达
Tab 1 The expression of PKC-α in thymocytes at
, 百拇医药
different time intervals after WBI with
75mGy and 4 Gy X-rays (±s，n=5) Time after irrad
Percentage of PKC-a positive cells
Sham
75 mGy
4 Gy
4 h
11.64±1.61
13.38±2.25
, 百拇医药
9.98±1.52
12 h
13.90±2.16
21.94±4.33**
7.76±2.14**
24 h
10.86±1.50
16.75±2.80**
6.84±1.95**
48 h
10.10±2.32
10.80±2.18
, 百拇医药
8.76±1.93
*P<0.01， vs sham
二、PKC-β1的表达：
由表2可见75mGy X射线照射后4、12、24、48h，PKC-β1表达均增强，12h达峰值。4Gy照射后胸腺细胞PKC-β1的表达仅在24h稍降低，但差异不显著。
三、PKC-β2的表达：
由表3可见75mGy X射线照射后12h及24h PKC-β2表达增强，48h恢复到假照水平。4Gy照射后4 h胸腺细胞PKC-β2的表达稍有增高，其它时间呈降低趋势，但均无明显差异。
, 百拇医药
表2 75mGy与4Gy X射线全身照射后胸腺细胞PKC-β1的表达
Tab 2 The expression of PKC-β1 in thymocytes at different time
intervals after WBI with 75mGy and 4Gy X-rays (±s，n=5) Time after irrad
Percentage of PKC-β2 positive cells
Sham
75 mGy
, 百拇医药
4 Gy
4 h
9.42±1.61
12.34±1.37*
9.74±5.09
12 h
9.74±1.46
25.60±7.36**
9.50±3.21
24 h
8.45±1.37
20.02±2.17**
, http://www.100md.com
6.74±2.78
48 h
7.60±1.10
14.01±2.54**
9.72±1.44
*P<0.05，**P<0.01，vs sham表3 75mGy与4Gy X射线全身照射后胸腺细胞PKC-β2的表达
Tab 3 The expression of PKC-β2 in thymocytes at different time
intervals after WBI with 75mGy and 4Gy X-rays (±s，n=5) Time after irrad
, 百拇医药
Percentage of PKC-β2 positive cells
Sham
75 mGy
4 Gy
4 h
11.26±0.91
12.88±3.19
14.28±2.93
12 h
12.56±2.06
21.90±4.47**
, http://www.100md.com
11.62±2.84
24 h
11.32±1.86
16.63±2.40**
9.72±1.44
48 h
9.54±1.64
9.22±2.59
8.70±1.54
**P<0.01，vs sham讨 论
各种细胞接受激素、神经递质、细胞因子和抗原等刺激时通过不同的信号传递通路引起细胞的功能表达。已知T淋巴细胞表面接受抗原或丝裂原作用后通过其TCR/CD3复合体诱导磷酸脂酶C的激活引起一系列酶促反应，导致PKC的活化和Ca2+的动员，随后引起细胞内的分子级联反应[3]，此中PKC活化诱导的蛋白磷酸化占有重要地位。PKC有多种亚型，各亚型显示了不同的酶学特性及不同的组织表达和特定的细胞内定位[4]。目前已明确在动物组织中至少有10种PKC亚型[5]，分为三组，即传统PKC(conventional PKCs,包括α,β,γ)，Ca2+非依赖性PKC(Ca2+-independent PKCs,包括δ,ε,ξ,η)及选择性PKC(alternative PKCs,包括θ,ι),其中较常见的为α,β,γ三种。组织定位表明，α,β亚型主要分布于外周组织，而γ亚型主要分布于中枢神经系统，各种亚型有高度的同源性，其结构可分为两个功能区，具有催化活性的亲水区和具有调节作用能同膜结合的疏水区。由于PKC能够对多种刺激作用反应，可以催化多种靶蛋白发生磷酸化，因此在信号传递中起着枢纽作用。我室对脾脏组织和分离的脾T、B细胞匀浆PKC总活性研究表明，75mGy全身照射后脾脏T淋巴细胞活性上升最快，B淋巴细胞活性上升较晚，分别于照射后12h及4d达峰值，均于照射后7d酶催化活性回降达对照值以下，提示细胞内存在反馈机制，本研究对胸腺细胞PKC亚型研究表明，75mGy照射后，其PKC α,β1,β2亚型亦在12h达最高，而4Gy照射后仅有PKC α表达显著下降。这些实验结果表明，高、低剂量全身照射后胸腺细胞的PKC亚型表达的变化特点存在明显的差别。不同剂量引起绝然不同的免疫反应变化可能与此有关。
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PMA和其它佛波酯的作用被认为是基于其与DG的结构相似性，无论是体内还是体外实验PMA都可以直接激活PKC。已有实验表明，PKC本身就是PMA的受体[6]，PKC和PMA结合后大大增加酶对Ca2+和磷酯的敏感性。低浓度的PMA(100nmol/L)就可引起PKC在生理Ca2+浓度下被激活。本实验结果提示，低剂量全身照射后胸腺细胞中PKC可发生量和质的变化，这些变化的发生可能与照射后TCR/CD3表达上调有关[7]。但低剂量照射后在PKC表达上升和[Ca2+]i动员增强与TCR/CD3表达上调之间的变化性质尚缺乏实验资料。因此还必须研究PKC上游的变化以阐明整个反应过程各环节间的关系。
参考文献
1 Rigaud O, Moustacchi E. Radioadaptation for gene mutation and the possible molecular mechanisms of the adaptive response. Mutat Res 1996, 358:127.
, 百拇医药
2 刘树铮，苏 旭，韩振波，等.低剂量辐射对T淋巴细胞游离钙和蛋白激酶C的影响.中华医学杂志，1994，74(8)：509.
3 Isakov N, Scholtz W, Altman A. Signal transduction and intracellular events in T-lymphocyte activation. Immunol Today, 1986, 7:271.
4 Bareggi R, Grill V, Zweyer M, et al. Distribution of the extended family of protein kinase C isoenzymes in fetal organs of mice: an immunohistochemical study. Cell Tissue Res, 1995, 280:617.
5 Nishizuka Y. Studies and prospectives of the protein kinase C family for cellular regulation. Cancer, 1993, 63:1892.
, 百拇医药
6 Nakabayashi H, Chan KF, Huang KP. Role of protein kinase C in the regulation of rat liver glycogen synthase. Arch, Biochem, Biophys, 1987, 252(1):81.
7 刘树铮，苏 旭，张迎春.小剂量X射线全射照射后淋巴细胞TCR/CD3表达和[Ca2+]i的变化.辐射研究与辐射工艺学报，1994，12(1)：61.
收稿日期：1997年3月12日
修稿日期：1998年1月19日
, http://www.100md.com
单位：谢 风 高 申 刘树铮 白求恩医科大学中日联谊医院检验科(长春 130021)
关键词：辐射剂量；蛋白激酶C；流式细胞术；胸腺
中国病理生理杂志990220 摘 要 目的和方法：本实验采用流式细胞术研究了不同剂量X射线全身照射后4、12、24和48h，昆明小鼠胸腺细胞蛋白激酶C亚型表达的变化。结果：75mGy全身照射后PKC-α、β1、β2表达均有增强，于照射后12h达峰值，PKC-α、β2于48h恢复至假照水平，PKC-β1于48 h仍明显增高。4Gy照射后，PKC-α表达显著下降。
Increased expression of PKC isoforms in thymocytes
, http://www.100md.com
after WBI with low dose X-rays
XIE Feng, GAO Shen, LIU Shu-Zheng
Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun (130021)
Abstract AIM and METHODS: Male Kunming mice were whole-body irradiated with 75 mGy or 4 Gy X-rays. The expressions of PKC (protein kinase C) isoforms of thymic lymphocytes were analyzed by immuno-fluorescence flow cytometry with corresponding polyclonal antibodies at different time intervals after irradiation. RESULTS: The positive cells for PKC α，PKC β1 and β2 all increased after WBI with 75 mGy, reaching its peak 12 hours after WBI. The expressions of PKC α，β2returned to normal level, and the expression of PKC β2 still remained at a higher level than normal 48 hours after WBI with 75 mGy. The positive cells for PKC α decreased 24 and 48 hours after WBI with 4 Gy. CONCLUSION: Low dose radiation can induce expression of PKC isoforns and promote signal transduction of T lymphocytes.
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MeSH Radiation dosage; Protein kinase C; Flow cytometry; Thymocytes
近几年来，大量的实验使人们逐步认识到低剂量辐射能够引发一些高剂量辐射所致不同的生物效应，已成为辐射研究领域的一个新的热点。其作用机制正不断被揭示[1]。就淋巴细胞信号传递系统而言，本实验室报道75mGy X射线单次全身照射后，小鼠TCR/CD3的表达增强，c-fos,c-jun表达上调，细胞内[Ca2+]i动员加快，PKC总活性增高[2]。对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)亚型的研究尚未见报道。本实验应用流式细胞术，观察低剂量照射后不同时间PKC-α，PKC-β1及PKC-β2蛋白表达的变化，进一步分析低剂量辐射对信号传递的影响。
材料与方法
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一、实验动物：
雄性昆明系小鼠20±2g，购于白求恩医科大学实验动物部。设75mGy、4Gy照射组和假照组，照射后4、12、24、48h断头处死小鼠取胸腺，制单细胞悬液。每组15只鼠，每3只小鼠的胸腺细胞混合为一样本，即每组n=5。
二、照射条件：
Philips深部X射线全身照射(WBI)，电压200kV，电流10mA，滤过板0.5mm铜，1.0mm铝，球靶距50cm或212cm，总剂量为4Gy(剂量率0.287Gy/min)和75mGy(剂量率12.5mGy/min)。
三、荧光抗体标记：
PKC-α，PKC-β1及PKC-β2多克隆抗体(Santa Cruz，美国)，羊抗兔IgG-FITC(Jackson,美国)，PMA(Sigma)。调单细胞悬液为1×107/mL，(悬于含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养基中)，然后加入PMA，终浓度为100nmol/L，于37℃，体积分数为5%CO2孵箱中培育，20min后用PBS洗二次，加第一抗体PKC-α,PKCβ1，PKCβ2(1∶50稀释)50μL,4℃反应45min，PBS洗涤二次，加第二抗体羊抗兔IgG-FITC(1:100稀释)20μL, 4℃反应45min，PBS洗二次后进行FCM分析。
, 百拇医药
四、用Coulter Elite流式细胞仪对细胞进行FCM多参数分析，激光光源15 mW氩离子激光，波长488nm,收集10000个细胞，进行FCM分析。
五、所有数据均以平均数和标准差(
±s)表示，各组之间的数值比较采用两样本均数t检验。结 果
一、PKC-α的表达：
PKC-α阳性细胞数在75mGy X射线照射后12h及24h明显增加，而4Gy X射线照射后数量明显下降，见表1。
表1 75mGy与4Gy X射线全身照射后胸腺细胞PKC-α的表达
Tab 1 The expression of PKC-α in thymocytes at
, 百拇医药
different time intervals after WBI with
75mGy and 4 Gy X-rays (
±s，n=5) Time after irradPercentage of PKC-a positive cells
Sham
75 mGy
4 Gy
4 h
11.64±1.61
13.38±2.25
, 百拇医药
9.98±1.52
12 h
13.90±2.16
21.94±4.33**
7.76±2.14**
24 h
10.86±1.50
16.75±2.80**
6.84±1.95**
48 h
10.10±2.32
10.80±2.18
, 百拇医药
8.76±1.93
*P<0.01， vs sham
二、PKC-β1的表达：
由表2可见75mGy X射线照射后4、12、24、48h，PKC-β1表达均增强，12h达峰值。4Gy照射后胸腺细胞PKC-β1的表达仅在24h稍降低，但差异不显著。
三、PKC-β2的表达：
由表3可见75mGy X射线照射后12h及24h PKC-β2表达增强，48h恢复到假照水平。4Gy照射后4 h胸腺细胞PKC-β2的表达稍有增高，其它时间呈降低趋势，但均无明显差异。
, 百拇医药
表2 75mGy与4Gy X射线全身照射后胸腺细胞PKC-β1的表达
Tab 2 The expression of PKC-β1 in thymocytes at different time
intervals after WBI with 75mGy and 4Gy X-rays (
±s，n=5) Time after irradPercentage of PKC-β2 positive cells
Sham
75 mGy
, 百拇医药
4 Gy
4 h
9.42±1.61
12.34±1.37*
9.74±5.09
12 h
9.74±1.46
25.60±7.36**
9.50±3.21
24 h
8.45±1.37
20.02±2.17**
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6.74±2.78
48 h
7.60±1.10
14.01±2.54**
9.72±1.44
*P<0.05，**P<0.01，vs sham表3 75mGy与4Gy X射线全身照射后胸腺细胞PKC-β2的表达
Tab 3 The expression of PKC-β2 in thymocytes at different time
intervals after WBI with 75mGy and 4Gy X-rays (
±s，n=5) Time after irrad, 百拇医药
Percentage of PKC-β2 positive cells
Sham
75 mGy
4 Gy
4 h
11.26±0.91
12.88±3.19
14.28±2.93
12 h
12.56±2.06
21.90±4.47**
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11.62±2.84
24 h
11.32±1.86
16.63±2.40**
9.72±1.44
48 h
9.54±1.64
9.22±2.59
8.70±1.54
**P<0.01，vs sham讨 论
各种细胞接受激素、神经递质、细胞因子和抗原等刺激时通过不同的信号传递通路引起细胞的功能表达。已知T淋巴细胞表面接受抗原或丝裂原作用后通过其TCR/CD3复合体诱导磷酸脂酶C的激活引起一系列酶促反应，导致PKC的活化和Ca2+的动员，随后引起细胞内的分子级联反应[3]，此中PKC活化诱导的蛋白磷酸化占有重要地位。PKC有多种亚型，各亚型显示了不同的酶学特性及不同的组织表达和特定的细胞内定位[4]。目前已明确在动物组织中至少有10种PKC亚型[5]，分为三组，即传统PKC(conventional PKCs,包括α,β,γ)，Ca2+非依赖性PKC(Ca2+-independent PKCs,包括δ,ε,ξ,η)及选择性PKC(alternative PKCs,包括θ,ι),其中较常见的为α,β,γ三种。组织定位表明，α,β亚型主要分布于外周组织，而γ亚型主要分布于中枢神经系统，各种亚型有高度的同源性，其结构可分为两个功能区，具有催化活性的亲水区和具有调节作用能同膜结合的疏水区。由于PKC能够对多种刺激作用反应，可以催化多种靶蛋白发生磷酸化，因此在信号传递中起着枢纽作用。我室对脾脏组织和分离的脾T、B细胞匀浆PKC总活性研究表明，75mGy全身照射后脾脏T淋巴细胞活性上升最快，B淋巴细胞活性上升较晚，分别于照射后12h及4d达峰值，均于照射后7d酶催化活性回降达对照值以下，提示细胞内存在反馈机制，本研究对胸腺细胞PKC亚型研究表明，75mGy照射后，其PKC α,β1,β2亚型亦在12h达最高，而4Gy照射后仅有PKC α表达显著下降。这些实验结果表明，高、低剂量全身照射后胸腺细胞的PKC亚型表达的变化特点存在明显的差别。不同剂量引起绝然不同的免疫反应变化可能与此有关。
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PMA和其它佛波酯的作用被认为是基于其与DG的结构相似性，无论是体内还是体外实验PMA都可以直接激活PKC。已有实验表明，PKC本身就是PMA的受体[6]，PKC和PMA结合后大大增加酶对Ca2+和磷酯的敏感性。低浓度的PMA(100nmol/L)就可引起PKC在生理Ca2+浓度下被激活。本实验结果提示，低剂量全身照射后胸腺细胞中PKC可发生量和质的变化，这些变化的发生可能与照射后TCR/CD3表达上调有关[7]。但低剂量照射后在PKC表达上升和[Ca2+]i动员增强与TCR/CD3表达上调之间的变化性质尚缺乏实验资料。因此还必须研究PKC上游的变化以阐明整个反应过程各环节间的关系。
参考文献
1 Rigaud O, Moustacchi E. Radioadaptation for gene mutation and the possible molecular mechanisms of the adaptive response. Mutat Res 1996, 358:127.
, 百拇医药
2 刘树铮，苏 旭，韩振波，等.低剂量辐射对T淋巴细胞游离钙和蛋白激酶C的影响.中华医学杂志，1994，74(8)：509.
3 Isakov N, Scholtz W, Altman A. Signal transduction and intracellular events in T-lymphocyte activation. Immunol Today, 1986, 7:271.
4 Bareggi R, Grill V, Zweyer M, et al. Distribution of the extended family of protein kinase C isoenzymes in fetal organs of mice: an immunohistochemical study. Cell Tissue Res, 1995, 280:617.
5 Nishizuka Y. Studies and prospectives of the protein kinase C family for cellular regulation. Cancer, 1993, 63:1892.
, 百拇医药
6 Nakabayashi H, Chan KF, Huang KP. Role of protein kinase C in the regulation of rat liver glycogen synthase. Arch, Biochem, Biophys, 1987, 252(1):81.
7 刘树铮，苏 旭，张迎春.小剂量X射线全射照射后淋巴细胞TCR/CD3表达和[Ca2+]i的变化.辐射研究与辐射工艺学报，1994，12(1)：61.
收稿日期：1997年3月12日
修稿日期：1998年1月19日
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