谷氨酰胺对缺氧复氧损伤人小肠上皮细胞谷胱甘肽的影响
作者：戴定威 吴圣楣 戚秋芬 李 敏 陈惠金 蔡 威
单位：上海市儿科医学研究所 上海第二医科大学附属新华医院(上海200092)
关键词：肠；小；上皮；细胞；低氧；谷氨酰胺；丙二醛
中国病理生理杂志990211 摘 要 目的：探讨谷氨酰胺(GLN)对缺氧复氧损伤人小肠上皮细胞(IEC)内还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的影响。方法：采用原代培养人IEC作为实验模型，用荧光法测定体外培养IEC内GSH和MDA含量。结果：正常对照组GSH含量最高，在对照组加入GLN并不影响GSH含量(P>0.05)。缺氧60 min或90 min复氧30 min损伤IEC细胞内GSH含量均显著低于正常对照组(P<0.05)，预先应用GLN可显著阻止缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量下降(P<0.05)。相反，正常对照组MDA含量最低，缺氧60 min复氧30 min IEC细胞内MDA水平显著高于正常对照组(P<0.01)，预先应用GLN可显著降低缺氧复氧损伤IEC细胞内MDA水平(P<0.05)。结论：补充GLN可维持缺氧复氧损伤IEC细胞GSH水平，减轻细胞膜脂质过氧化。
, 百拇医药
Effects of glutamine on intracellular reduced glutathione in cultured human intestinal epithelial cells with anoxia/reoxygenation
DAI Ding-Wei, WU Sheng-Mei, QI Qiu-Fen, LI Min, CHEN Hui-Jin, CAI Wei
Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai (200092)
Abstract AIM：To study the effects of glutamine on intracellular reduced glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in cultured human intestinal epithelial cells with anoxia/reoxygenation (A/R) in vitro.METHODS: Human intestinal epithelial cells in primary culture was used as a model and intracellular GSH and MDA were determined by using fluorometric method.RESULTS: Normal control group had the highest GSH level and there was no difference between NS vs 2 mmol/L glutamine group (P>0.05)。 With 60 min or 90 min of anoxia followed 30 min of reoxygenation, GSH levels were significantly lowered in NS groups compared to those in glutamine groups (P<0.05). Normal control group had the lowest MDA level. With 60 min of anoxia followed 30 min of reoxygenation, MDA level was significantly higher in A/R group compared to that in glutamine group (P<0.05). CONCLUSIONS: Glutamine supplementation might partially preserve GSH levels and lessen lipid peroxidation of cell membrane in human IEC during A/R in vitro.
, 百拇医药
MeSH Intestine, small; Epithelium; Cells; Anoxia; Glutamine; Malondialdehyde
缺血所致小肠损伤的主要原因之一是再灌注时生成氧自由基(oxygen free radical, OFR),OFR直接和多聚不饱和脂肪酸作用导致细胞膜脂质过氧化和细胞死亡[1]。还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)是机体抗OFR损伤的重要物质。谷氨酰胺(glutamine, GLN)是合成GSH的必需物质，肠上皮通过代谢GLN生成大量合成GSH的前体物质谷氨酸，因此，GLN可能是通过维持细胞内GSH水平而发挥细胞保护作用。本实验采用原代培养人胎小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell, IEC),观察GLN对缺氧复氧(anoxia/reoxygenation, A/R)损伤人IEC细胞内GSH水平和细胞膜脂质过氧化的影响。
, 百拇医药 材料和方法
一、材料：
1.试剂和药品：粗胶原酶Ⅺ型、胰蛋白酶、表皮生长因子、胰岛素、肝素、山梨醇、邻苯二甲醛(o-phthaladehyde, OPT)等为Sigma产品，Dulbecco改良Eagle氏培养基、胎牛血清、谷胺酰胺(glutamine, GLN)为Gibco产品，中性蛋白酶Ⅰ型(Boehringer mannheim,德国)，青霉素(上海第二制药厂)，链霉素(上海第三制药厂)，硫代巴比妥酸、1，1，3，3-四甲氧基丙烷均为Fluka AG Buchs公司产品。
2.实验仪器：Queue细胞培养箱(Queun Systems, USA)，RF-540型荧光分光光度计(日本)。
二、方法：
1.IEC细胞培养：采用本实验室建立的人胎IEC分离培养方法[2]。
, 百拇医药
2.缺氧复氧模型的复制：取原代培养d 10， IEC，以质量分数为0.25%胰蛋白酶消化，离心洗涤去胰蛋白酶，细胞用新鲜培养液稀释为2×109/L。台盼蓝染色细胞存活率为98%。再种植在24孔板中，每孔1 mL细胞悬液。按文献方法造成IEC缺氧复氧损伤[3]。即吸去24孔内90%培养液，以减少气体弥散距离，剩余培养液能维持细胞存活。将之置入一密闭容器中，负压抽吸其中空气，换入纯氮气，密闭后置入培养箱中培养60min或90 min(缺氧)，再取出24孔板，加培养液至原含量，将之置入培养箱中培养30min(复氧)。对照组细胞直接置培养箱中培养，培养箱条件均为37℃、体积分数为95% O2、5%CO2。
3.实验分组：实验设正常对照组、缺氧60min复氧30min损伤组(简称A/R 60min)、缺氧90min复氧30min损伤组(A/R 90min)，其中各组又设生理盐水(NS)对照组和GLN处理组，每组4孔。各组在缺氧复氧损伤前分别加入GLN (2mmol/L)或等量生理盐水。
, 百拇医药
4.GSH含量测定：取0.5mL细胞悬液，用荧光法测定IEC细胞内GSH含量，参考沈惠麒等方法略加修改[4]。
5.MDA含量测定：TBA荧光法[5]，测定条件λex=515nm,λem=550nm。
6.统计分析：实验数据均以
±s表示，组间差异比较采用双侧t检验(a=0.05)。
结 果
(一)结果见表1。在培养液中加入2 mmol/L GLN对无缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量无影响。缺氧60 min复氧30 min后IEC细胞内GSH含量显著低于无缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量，GLN处理组GSH含量显著高于缺氧复氧组。缺氧90 min复氧30 min后IEC细胞内GSH含量进一步下降，但加入GLN组GSH含量显著高于缺氧复氧组。
, 百拇医药
表1 GLN对缺氧复氧损伤IEC细胞GSH的影响
Tab 1 Effects of GLN on intracellular GSH in human IEC with
anoxia/reoxygenation (μg/106 cells,±s,n=4) Control group
A/R group
A/R 60 min
A/R 90 min
NS
10.64±2.08
, 百拇医药
7.01±1.29▲
6.10±1.09▲
GLN
10.68±2.24
8.55±1.32
8.12±1.23
▲P<0.05，vs control group
(二)缺氧60min复氧30min后IEC细胞内MDA含量显著高于对照组(1.41±0.12 vs 1.08±0.10，P<0.01)，预先应用GLN组MDA水平显著低于缺氧复氧组(1.21±0.11 vs 1.41±0.12 P<0.05)。
, 百拇医药
讨 论
在小肠缺血再灌注时，氧在多种酶(黄嘌呤氧化酶、NADPH、细胞色素、P-450 还原酶等)的催化下发生电子还原，生成超氧阴离子(O2)并衍生出一系列的氧自由基，这些自由基，特别是高度活泼的*OH，可导致脂质过氧化和/或使细胞某些酶活性丧失，引起细胞或组织损伤。GSH在细胞抗氧化损伤中起着极重要的作用。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-px)催化GSH和H2O2反应生成H2O，使得O2通过中间体H2O2生成高度活性的膜过氧化剂*OH这个链被打断，从而保护细胞免受OFR的毒性损伤。GSH-px对H2O2的还原比过氧化氢酶更重要，后者只局限于细胞过氧化氢酶体部位。GSH还可直接和高活性OFR反应，不需要酶的催化。GSH在还原OFR的同时自身被氧化为GSSG，后者又通过GSSG还原酶的催化还原为GSH，以保持细胞内硫醇的平衡。缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, I-R)组织细胞内GSH显著下降[6～8]，并发现，I-R组织细胞损伤程度和缺血前细胞内GSH量成反比[6，7]。静脉注射GSH可提高细胞内GSH水平，可明显减轻再灌注组织细胞的损伤[6]。
, 百拇医药
GSH是谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽。谷氨酸不能通过细胞膜，而GLN易于通过细胞膜，是细胞内谷氨酸的来源[7]。最近研究发现GLN缺乏可直接导致细胞GSH水平下降[7]。静脉或口服GLN可减轻放疗、化疗等病理状态下肠粘膜的损伤[9]。GLN对肠粘膜保护作用的机制尚不清楚，但可能与维持细胞抗氧化防御机制有关。离子辐射和一些化疗药物通过增强氧化剂的活性而损伤细胞。辐射所生成的OFR可直接作用于DNA而诱发细胞的损伤。组织对辐射的敏感性与组织细胞GSH含量成反比[10]。GSH量的变化也影响一些化疗药物(如阿霉素、博莱霉素等)的细胞毒性。这些资料提示：GLN通过维持细胞GSH水平而发挥保护细胞抗氧化损伤的作用。Hong等观察到补充GLN与组织中GSH量直接相关，并减轻肝脏组织氧化损伤，增加动物生存率[7]。Harward等报道补充GLN可明显增加I-R损伤小肠粘膜细胞GSH含量[8]。
, 百拇医药 本实验结果显示：缺氧复氧损伤使IEC细胞内GSH含量显著下降，体外应用GLN可部分维持IEC细胞内GSH水平，并减轻缺氧复氧诱发的细胞膜脂质过氧化。表明：提供GLN有益于减轻小肠I-R损伤，GLN是否对严重的小肠I-R损伤具有防治作用尚需进一步研究。
*上海市高等学校青年科学基金资助(96QB43)
参考文献
1 Schoenberg MH, Berger HG. Reperfusion injury after intestinal ischemia. Crit Care Med， 1993， 137:6.
2 戴定威，吴圣楣，廖贤平，等.人胎小肠上皮细胞体外培养研究.上海第二医科大学学报，1996， 16：321.
3 Batych RE, Chuknyiska RS, Balkley GB, et al. The primary localization of free radical generation after anoxia/reoxygenation in isolated endothelial cells. Surgery, 1987, 102:122.
, http://www.100md.com
4 沈惠麒，赵利英，曲青山，等.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志，1988，6：103.
5 翁玉椿，王秀平，卢泳才，等.细胞和细胞膜内过氧化脂质的微量定量.细胞生物学杂志，1985，7：142.
6 Jennische E. Possible influence of glutathione on postischemic liver injury. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand, 1984, 92:55.
7 Hong RW, Rounds JD, Helton WS, et al. Glutamine preserves liver glutathione after lethal hepatic injury. Ann Surg, 1991, 215:114.
, http://www.100md.com
8 Harward TS, Coe D, Souba WW, et al. Glutamine preserves gut glutathione levels during intestinal ischemia/reperfusion. J Surg Res, 1994, 56:351.
9 戴定威，吴圣楣.谷胺酰氨在肠道的代谢及其对肠粘膜的保护作用.国外医学临床生物化学与检验学分册，1995，16：253.
10 Bump EA, Yu NY, Brown JM. Radiosensitization of hypoxic tumor cells by depleting intracellular glutathione. Science, 1983, 217:544.
收稿日期：1997年4月1日
修稿日期：1998年3月3日, 百拇医药
单位：上海市儿科医学研究所 上海第二医科大学附属新华医院(上海200092)
关键词：肠；小；上皮；细胞；低氧；谷氨酰胺；丙二醛
中国病理生理杂志990211 摘 要 目的：探讨谷氨酰胺(GLN)对缺氧复氧损伤人小肠上皮细胞(IEC)内还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的影响。方法：采用原代培养人IEC作为实验模型，用荧光法测定体外培养IEC内GSH和MDA含量。结果：正常对照组GSH含量最高，在对照组加入GLN并不影响GSH含量(P>0.05)。缺氧60 min或90 min复氧30 min损伤IEC细胞内GSH含量均显著低于正常对照组(P<0.05)，预先应用GLN可显著阻止缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量下降(P<0.05)。相反，正常对照组MDA含量最低，缺氧60 min复氧30 min IEC细胞内MDA水平显著高于正常对照组(P<0.01)，预先应用GLN可显著降低缺氧复氧损伤IEC细胞内MDA水平(P<0.05)。结论：补充GLN可维持缺氧复氧损伤IEC细胞GSH水平，减轻细胞膜脂质过氧化。
, 百拇医药
Effects of glutamine on intracellular reduced glutathione in cultured human intestinal epithelial cells with anoxia/reoxygenation
DAI Ding-Wei, WU Sheng-Mei, QI Qiu-Fen, LI Min, CHEN Hui-Jin, CAI Wei
Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai (200092)
Abstract AIM：To study the effects of glutamine on intracellular reduced glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in cultured human intestinal epithelial cells with anoxia/reoxygenation (A/R) in vitro.METHODS: Human intestinal epithelial cells in primary culture was used as a model and intracellular GSH and MDA were determined by using fluorometric method.RESULTS: Normal control group had the highest GSH level and there was no difference between NS vs 2 mmol/L glutamine group (P>0.05)。 With 60 min or 90 min of anoxia followed 30 min of reoxygenation, GSH levels were significantly lowered in NS groups compared to those in glutamine groups (P<0.05). Normal control group had the lowest MDA level. With 60 min of anoxia followed 30 min of reoxygenation, MDA level was significantly higher in A/R group compared to that in glutamine group (P<0.05). CONCLUSIONS: Glutamine supplementation might partially preserve GSH levels and lessen lipid peroxidation of cell membrane in human IEC during A/R in vitro.
, 百拇医药
MeSH Intestine, small; Epithelium; Cells; Anoxia; Glutamine; Malondialdehyde
缺血所致小肠损伤的主要原因之一是再灌注时生成氧自由基(oxygen free radical, OFR),OFR直接和多聚不饱和脂肪酸作用导致细胞膜脂质过氧化和细胞死亡[1]。还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)是机体抗OFR损伤的重要物质。谷氨酰胺(glutamine, GLN)是合成GSH的必需物质，肠上皮通过代谢GLN生成大量合成GSH的前体物质谷氨酸，因此，GLN可能是通过维持细胞内GSH水平而发挥细胞保护作用。本实验采用原代培养人胎小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell, IEC),观察GLN对缺氧复氧(anoxia/reoxygenation, A/R)损伤人IEC细胞内GSH水平和细胞膜脂质过氧化的影响。
, 百拇医药 材料和方法
一、材料：
1.试剂和药品：粗胶原酶Ⅺ型、胰蛋白酶、表皮生长因子、胰岛素、肝素、山梨醇、邻苯二甲醛(o-phthaladehyde, OPT)等为Sigma产品，Dulbecco改良Eagle氏培养基、胎牛血清、谷胺酰胺(glutamine, GLN)为Gibco产品，中性蛋白酶Ⅰ型(Boehringer mannheim,德国)，青霉素(上海第二制药厂)，链霉素(上海第三制药厂)，硫代巴比妥酸、1，1，3，3-四甲氧基丙烷均为Fluka AG Buchs公司产品。
2.实验仪器：Queue细胞培养箱(Queun Systems, USA)，RF-540型荧光分光光度计(日本)。
二、方法：
1.IEC细胞培养：采用本实验室建立的人胎IEC分离培养方法[2]。
, 百拇医药
2.缺氧复氧模型的复制：取原代培养d 10， IEC，以质量分数为0.25%胰蛋白酶消化，离心洗涤去胰蛋白酶，细胞用新鲜培养液稀释为2×109/L。台盼蓝染色细胞存活率为98%。再种植在24孔板中，每孔1 mL细胞悬液。按文献方法造成IEC缺氧复氧损伤[3]。即吸去24孔内90%培养液，以减少气体弥散距离，剩余培养液能维持细胞存活。将之置入一密闭容器中，负压抽吸其中空气，换入纯氮气，密闭后置入培养箱中培养60min或90 min(缺氧)，再取出24孔板，加培养液至原含量，将之置入培养箱中培养30min(复氧)。对照组细胞直接置培养箱中培养，培养箱条件均为37℃、体积分数为95% O2、5%CO2。
3.实验分组：实验设正常对照组、缺氧60min复氧30min损伤组(简称A/R 60min)、缺氧90min复氧30min损伤组(A/R 90min)，其中各组又设生理盐水(NS)对照组和GLN处理组，每组4孔。各组在缺氧复氧损伤前分别加入GLN (2mmol/L)或等量生理盐水。
, 百拇医药
4.GSH含量测定：取0.5mL细胞悬液，用荧光法测定IEC细胞内GSH含量，参考沈惠麒等方法略加修改[4]。
5.MDA含量测定：TBA荧光法[5]，测定条件λex=515nm,λem=550nm。
6.统计分析：实验数据均以
±s表示，组间差异比较采用双侧t检验(a=0.05)。结 果
(一)结果见表1。在培养液中加入2 mmol/L GLN对无缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量无影响。缺氧60 min复氧30 min后IEC细胞内GSH含量显著低于无缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量，GLN处理组GSH含量显著高于缺氧复氧组。缺氧90 min复氧30 min后IEC细胞内GSH含量进一步下降，但加入GLN组GSH含量显著高于缺氧复氧组。
, 百拇医药
表1 GLN对缺氧复氧损伤IEC细胞GSH的影响
Tab 1 Effects of GLN on intracellular GSH in human IEC with
anoxia/reoxygenation (μg/106 cells,
±s,n=4) Control groupA/R group
A/R 60 min
A/R 90 min
NS
10.64±2.08
, 百拇医药
7.01±1.29▲
6.10±1.09▲
GLN
10.68±2.24
8.55±1.32
8.12±1.23
▲P<0.05，vs control group
(二)缺氧60min复氧30min后IEC细胞内MDA含量显著高于对照组(1.41±0.12 vs 1.08±0.10，P<0.01)，预先应用GLN组MDA水平显著低于缺氧复氧组(1.21±0.11 vs 1.41±0.12 P<0.05)。
, 百拇医药
讨 论
在小肠缺血再灌注时，氧在多种酶(黄嘌呤氧化酶、NADPH、细胞色素、P-450 还原酶等)的催化下发生电子还原，生成超氧阴离子(O2)并衍生出一系列的氧自由基，这些自由基，特别是高度活泼的*OH，可导致脂质过氧化和/或使细胞某些酶活性丧失，引起细胞或组织损伤。GSH在细胞抗氧化损伤中起着极重要的作用。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-px)催化GSH和H2O2反应生成H2O，使得O2通过中间体H2O2生成高度活性的膜过氧化剂*OH这个链被打断，从而保护细胞免受OFR的毒性损伤。GSH-px对H2O2的还原比过氧化氢酶更重要，后者只局限于细胞过氧化氢酶体部位。GSH还可直接和高活性OFR反应，不需要酶的催化。GSH在还原OFR的同时自身被氧化为GSSG，后者又通过GSSG还原酶的催化还原为GSH，以保持细胞内硫醇的平衡。缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, I-R)组织细胞内GSH显著下降[6～8]，并发现，I-R组织细胞损伤程度和缺血前细胞内GSH量成反比[6，7]。静脉注射GSH可提高细胞内GSH水平，可明显减轻再灌注组织细胞的损伤[6]。
, 百拇医药
GSH是谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽。谷氨酸不能通过细胞膜，而GLN易于通过细胞膜，是细胞内谷氨酸的来源[7]。最近研究发现GLN缺乏可直接导致细胞GSH水平下降[7]。静脉或口服GLN可减轻放疗、化疗等病理状态下肠粘膜的损伤[9]。GLN对肠粘膜保护作用的机制尚不清楚，但可能与维持细胞抗氧化防御机制有关。离子辐射和一些化疗药物通过增强氧化剂的活性而损伤细胞。辐射所生成的OFR可直接作用于DNA而诱发细胞的损伤。组织对辐射的敏感性与组织细胞GSH含量成反比[10]。GSH量的变化也影响一些化疗药物(如阿霉素、博莱霉素等)的细胞毒性。这些资料提示：GLN通过维持细胞GSH水平而发挥保护细胞抗氧化损伤的作用。Hong等观察到补充GLN与组织中GSH量直接相关，并减轻肝脏组织氧化损伤，增加动物生存率[7]。Harward等报道补充GLN可明显增加I-R损伤小肠粘膜细胞GSH含量[8]。
, 百拇医药 本实验结果显示：缺氧复氧损伤使IEC细胞内GSH含量显著下降，体外应用GLN可部分维持IEC细胞内GSH水平，并减轻缺氧复氧诱发的细胞膜脂质过氧化。表明：提供GLN有益于减轻小肠I-R损伤，GLN是否对严重的小肠I-R损伤具有防治作用尚需进一步研究。
*上海市高等学校青年科学基金资助(96QB43)
参考文献
1 Schoenberg MH, Berger HG. Reperfusion injury after intestinal ischemia. Crit Care Med， 1993， 137:6.
2 戴定威，吴圣楣，廖贤平，等.人胎小肠上皮细胞体外培养研究.上海第二医科大学学报，1996， 16：321.
3 Batych RE, Chuknyiska RS, Balkley GB, et al. The primary localization of free radical generation after anoxia/reoxygenation in isolated endothelial cells. Surgery, 1987, 102:122.
, http://www.100md.com
4 沈惠麒，赵利英，曲青山，等.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志，1988，6：103.
5 翁玉椿，王秀平，卢泳才，等.细胞和细胞膜内过氧化脂质的微量定量.细胞生物学杂志，1985，7：142.
6 Jennische E. Possible influence of glutathione on postischemic liver injury. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand, 1984, 92:55.
7 Hong RW, Rounds JD, Helton WS, et al. Glutamine preserves liver glutathione after lethal hepatic injury. Ann Surg, 1991, 215:114.
, http://www.100md.com
8 Harward TS, Coe D, Souba WW, et al. Glutamine preserves gut glutathione levels during intestinal ischemia/reperfusion. J Surg Res, 1994, 56:351.
9 戴定威，吴圣楣.谷胺酰氨在肠道的代谢及其对肠粘膜的保护作用.国外医学临床生物化学与检验学分册，1995，16：253.
10 Bump EA, Yu NY, Brown JM. Radiosensitization of hypoxic tumor cells by depleting intracellular glutathione. Science, 1983, 217:544.
收稿日期：1997年4月1日
修稿日期：1998年3月3日, 百拇医药