发热的动物模型复制方法的改进：制备EP冷贮温度的新选择暨南大学医学院 病理生理教研室 发热研究室(广州 510632)
作者：陈小琳 杨皓庄 王达安 戚仁斌 李楚杰
单位：
关键词：
中国病理生理杂志990330 发热实验是病理生理教学体系中重要实验之一。它不仅可以培养学生复制疾病模型的基本技能，观察发热的病理过程，还可论证内生致热源(endogenous pyrogens, EPs)的作用，这在多年实践中取得很好的教学效果。但在制备EPs过程中遇到了一个重要技术问题，即提取EPs后贮存于何种适宜低温中，可保存其致热活性？传统上把提取得EPs液贮于4℃中[1]，但未及1周，其致热活性就显著减弱，影响了实验效果。为重新选择冷贮温度及贮存时间，以减少致热活性的丧失，本研究观察比较EPs置4℃，-20℃,-30℃不同的时间所保有的致热活性。
材料与方法
, 百拇医药
(一)试剂与仪器：精制大肠杆菌内毒素(Escherichia coli endotoxin, ET)由上海第二军医大学微生物教研室提供，ST-1测温仪购自上海医用仪表厂。
(二)EPs的制备：给家兔肝素化(4000U/kg，iv)，经颈总动脉采血，按5μg/100mL全血的比例加入ET，于38℃水浴中震荡培育1h，2 000r/min离心15min，弃上清，加入与其同量的无菌生理盐水，在38℃水溶中继续培育18h，2 000r/min离心15min收集上清(含EPs)分装并分别贮于4℃，-20℃，-30℃冰箱中，经耐热试验证明所得的EPs未污染ET。
(三)致热性试验：用健康大耳白家兔(本院动物中心提供)进行实验，体重2～3kg，雌雄不拘，实验分3批进行。
1.EPs在不同温度下冷贮5 d的致热性比较：24只家兔随机分为4组，每组6只，Ⅰ、对照组(control)EPs组：静脉注射新提取的EPs，剂量3mL/kg，不经冷贮(室温23～26℃)；Ⅱ、4℃EPs组；Ⅲ.-20℃EPs组；Ⅳ.-30℃ EPs组。后3组剂量同I组，注射前冰箱取出分装冷贮5 d的EPs，在室温中复温。
, 百拇医药
2.第二批 ：EPs在不同温度中冷贮8d的致热性比较：分组和剂量类同第一批，分别注射不同温度冷贮8 d的EPs观察其致热活性。
3.第三批：EPs在不同低温中冷贮30d的致热性比较：注射物及剂量类似上批相应注射物，由于第二批实验发现4℃EPs的致热活性大部丢失，故未纳入第三批实验，只分3个组。 上述3批实验中，对照EPs组共用。
(四)动物适应、测温及指标检测：
1.适应：方法同前[2]。
2.测温：动物置实验架上，从肛门插入测温探头，深10 cm，读结肠温度，每10 min 1次，取3次的均数作为基础体温，然后分别静脉注射相应EPs，注后每10 min记录结肠温度1次，观察2 h。
3.指标[3]：①平均体温反应曲线(mean thermal response curve, MTRC)；②平均最大体温反应高度(mean maximal height of thermal response, △T)；③平均2h体温反应指数(mean 2 h thermal response index, TRI2)。
, 百拇医药
(五)除污染：实验室用紫外线照射，器械、玻璃器皿在180℃干热2h，其余用品高压消毒。
(六)统计处理：数据用
±s表示，均数差异的显著性用t检验法判断。
结果
一、EPs在不同温度冷贮5d的致热效应比较：
结果见图1、表1。图1的MTRC显示，EPs贮于-20℃或-30℃5d，其致热效应与对照EPs组接近，但贮于4℃5d，其致热效应低于其它3组。表1也显示，贮于4℃的EPs,其△T和TRI2均明显低于对照EPs组和其它两组。
二、EPs在不同温度冷贮8d的致热效应比较：
, 百拇医药
结果见图2、表1。如图2所示，虽各组均引起发热，但注射EPs后1.5h，4℃EPs的体温高度已低于发热水平(<0.3℃)，其它各组则仍处于发热水平(>0.3℃)以上，到了2h,只有对照组EPs和-20℃EPs组仍高于0.3℃；4℃EPs组及-30℃EPs组则低于0.3℃，表1也表明，无论△T或TRI2，除-20℃EPs与对照EPs组的差异无显著外，4℃EPs和-30℃EPs组均显著低于对照EPs组，而且，-30℃EPs组(△T)也显著低于-20℃EPs组。
表1 不同温度下保存5 d、8 d、30 d的EPs平均最大体温反应高度(ΔT)及2 h平均体温反应指数(TRI2)的比较
Tab 1 Comparison of mean maximal height of thermal response (ΔT) and comparison of mean 2 h thermal response index(TRI2) of EPs conserved in different temperatures Group
, http://www.100md.com
5 days
8 days
30 days
ΔT(℃)
TRI2
ΔT(℃)
TRI2
ΔT(℃)
TRI2
Control EPs
1.13±0.09
6.94±0.95
, http://www.100md.com
1.13±0.09
6.94±0.95
1.13±0.09
6.94±0.95
4℃ EPs
0.75±0.10*
4.65±1.26*
0.47±0.08*
2.10±0.67*
-
-
, http://www.100md.com
-20℃ EPs
1.10±0.16
6.71±1.16
1.08±0.14△
6.75±0.82△
0.97±0.20△
5.22±0.92*
-30℃ EPs
1.05±0.12
6.45±1.38
0.85±0.20*
, 百拇医药
4.76±1.14*
0.68±0.10*
4.13±0.80*
*P<0.05，vs control EPs group;△P<0.05，vs -30℃ EPs group. Control EPs=isolated and used in the same day
Fig 1 Comparison of mean thermal response curves of EPs conserved in different temperatures for 5 days
图1 不同温度下保存5 d的EPs平均体温反应曲线的比较
, 百拇医药
Fig 2 Comparison of mean thermal response curves of EPs conserved in different temperatures for 8 days
图2 不同温度下保存8 d的EPs平均体温反应曲线的比较
三、EPs于-20℃和-30℃贮于30d的致热效应比较：
结果见图3、表1。图3的3条MTRC大致可分3个等级：对照EPs致热性最大，-20℃EPs次之，-30℃EPs更次之。表1也表明，-30℃EPs组的△T和TRI2均明显低于对照EPs组，-20℃EPs的TRI2明显低于对照EPs组，-30℃EPs组的△T明显低于-20℃EPs组。
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Fig 3 Comparison of mean termal response curves of EPs conserved in different temperatures for 20 days and 30 days
图3 不同温度下保存20 d和30 d的EPs平均体温反应曲线的比较讨论
上述实验结果表明，EPs在4℃贮5d，其致热活性尚大部保存，但延至8d则大部丢失，远不及新制备的EPs；EPs在-20℃贮8d，其致热活性仍接近对照EPs，但若延至30d，则致热活性有一定程度减弱，提示可能其结构已有损伤，后者主要来自冻融损伤，但其致热活性仍高于在4℃贮存8d的EPs，并相当于对照EPs组的75%。
至于在-30℃贮存的EPs,虽然第5d致热活性接近对照EPs和-20℃EPs,并明显高于4℃EPs,但延至8d，则开始减弱，不仅明显低于对照EPs，也低于-20℃EPs,可能-30℃所造成的冻融损伤大于-20℃。
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综上所述，在3个温度中，应选择-20℃作为冷贮EPs的适宜温度。作者据此推荐，今后用于教学实验(或其它科研实验)的EPs制备，需要低温贮存超过1周时，采用-20℃能保存最大的致热活性，不宜采用4℃的传统温度，当然目前用于科研，根据需要可采用重组细胞因子(IL-1α、IL-1β、TNF-α)等[4]，但用于教学，价格昂贵，不胜耗费。为了接近自然条件的发热，应采用外致热源(ET等)于产EPs细胞(如血单核细胞)诱生EPs，用于教学既可节省经费，又可达到教学的综合目的。
参考文献
1 陆大祥，颜亮，张希贤.内生致热原性发热.见：张希贤主编.病理生理学实习指导.北京：科学技术文献出版社，1989.10.
2 王华东，胡巢凤，王彦平.α-MSH对家兔ET性发热反应及脑腹中隔区AVP含量的影响.中国病理生理杂志，1998，14:130.
3 Zang Yi， Li Chujie. The effects of perfusion of lateral ventricle with CaCl2 on the febrile response and cAMP content in plasma and cerebrospinal fluid during LP-induced fever. Sci In China(SeriesB)，1991,34:317.
4 李楚杰.发热时体温的正调节和负调节.中国病理生理杂志，1994，10:553.
1998年12月28日收稿，1999年2月1日修回, 百拇医药
单位：
关键词：
中国病理生理杂志990330 发热实验是病理生理教学体系中重要实验之一。它不仅可以培养学生复制疾病模型的基本技能，观察发热的病理过程，还可论证内生致热源(endogenous pyrogens, EPs)的作用，这在多年实践中取得很好的教学效果。但在制备EPs过程中遇到了一个重要技术问题，即提取EPs后贮存于何种适宜低温中，可保存其致热活性？传统上把提取得EPs液贮于4℃中[1]，但未及1周，其致热活性就显著减弱，影响了实验效果。为重新选择冷贮温度及贮存时间，以减少致热活性的丧失，本研究观察比较EPs置4℃，-20℃,-30℃不同的时间所保有的致热活性。
材料与方法
, 百拇医药
(一)试剂与仪器：精制大肠杆菌内毒素(Escherichia coli endotoxin, ET)由上海第二军医大学微生物教研室提供，ST-1测温仪购自上海医用仪表厂。
(二)EPs的制备：给家兔肝素化(4000U/kg，iv)，经颈总动脉采血，按5μg/100mL全血的比例加入ET，于38℃水浴中震荡培育1h，2 000r/min离心15min，弃上清，加入与其同量的无菌生理盐水，在38℃水溶中继续培育18h，2 000r/min离心15min收集上清(含EPs)分装并分别贮于4℃，-20℃，-30℃冰箱中，经耐热试验证明所得的EPs未污染ET。
(三)致热性试验：用健康大耳白家兔(本院动物中心提供)进行实验，体重2～3kg，雌雄不拘，实验分3批进行。
1.EPs在不同温度下冷贮5 d的致热性比较：24只家兔随机分为4组，每组6只，Ⅰ、对照组(control)EPs组：静脉注射新提取的EPs，剂量3mL/kg，不经冷贮(室温23～26℃)；Ⅱ、4℃EPs组；Ⅲ.-20℃EPs组；Ⅳ.-30℃ EPs组。后3组剂量同I组，注射前冰箱取出分装冷贮5 d的EPs，在室温中复温。
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2.第二批 ：EPs在不同温度中冷贮8d的致热性比较：分组和剂量类同第一批，分别注射不同温度冷贮8 d的EPs观察其致热活性。
3.第三批：EPs在不同低温中冷贮30d的致热性比较：注射物及剂量类似上批相应注射物，由于第二批实验发现4℃EPs的致热活性大部丢失，故未纳入第三批实验，只分3个组。 上述3批实验中，对照EPs组共用。
(四)动物适应、测温及指标检测：
1.适应：方法同前[2]。
2.测温：动物置实验架上，从肛门插入测温探头，深10 cm，读结肠温度，每10 min 1次，取3次的均数作为基础体温，然后分别静脉注射相应EPs，注后每10 min记录结肠温度1次，观察2 h。
3.指标[3]：①平均体温反应曲线(mean thermal response curve, MTRC)；②平均最大体温反应高度(mean maximal height of thermal response, △T)；③平均2h体温反应指数(mean 2 h thermal response index, TRI2)。
, 百拇医药
(五)除污染：实验室用紫外线照射，器械、玻璃器皿在180℃干热2h，其余用品高压消毒。
(六)统计处理：数据用
±s表示，均数差异的显著性用t检验法判断。结果
一、EPs在不同温度冷贮5d的致热效应比较：
结果见图1、表1。图1的MTRC显示，EPs贮于-20℃或-30℃5d，其致热效应与对照EPs组接近，但贮于4℃5d，其致热效应低于其它3组。表1也显示，贮于4℃的EPs,其△T和TRI2均明显低于对照EPs组和其它两组。
二、EPs在不同温度冷贮8d的致热效应比较：
, 百拇医药
结果见图2、表1。如图2所示，虽各组均引起发热，但注射EPs后1.5h，4℃EPs的体温高度已低于发热水平(<0.3℃)，其它各组则仍处于发热水平(>0.3℃)以上，到了2h,只有对照组EPs和-20℃EPs组仍高于0.3℃；4℃EPs组及-30℃EPs组则低于0.3℃，表1也表明，无论△T或TRI2，除-20℃EPs与对照EPs组的差异无显著外，4℃EPs和-30℃EPs组均显著低于对照EPs组，而且，-30℃EPs组(△T)也显著低于-20℃EPs组。
表1 不同温度下保存5 d、8 d、30 d的EPs平均最大体温反应高度(ΔT)及2 h平均体温反应指数(TRI2)的比较
Tab 1 Comparison of mean maximal height of thermal response (ΔT) and comparison of mean 2 h thermal response index(TRI2) of EPs conserved in different temperatures Group
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5 days
8 days
30 days
ΔT(℃)
TRI2
ΔT(℃)
TRI2
ΔT(℃)
TRI2
Control EPs
1.13±0.09
6.94±0.95
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1.13±0.09
6.94±0.95
1.13±0.09
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4℃ EPs
0.75±0.10*
4.65±1.26*
0.47±0.08*
2.10±0.67*
-
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-20℃ EPs
1.10±0.16
6.71±1.16
1.08±0.14△
6.75±0.82△
0.97±0.20△
5.22±0.92*
-30℃ EPs
1.05±0.12
6.45±1.38
0.85±0.20*
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4.76±1.14*
0.68±0.10*
4.13±0.80*
*P<0.05，vs control EPs group;△P<0.05，vs -30℃ EPs group. Control EPs=isolated and used in the same day
Fig 1 Comparison of mean thermal response curves of EPs conserved in different temperatures for 5 days
图1 不同温度下保存5 d的EPs平均体温反应曲线的比较
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Fig 2 Comparison of mean thermal response curves of EPs conserved in different temperatures for 8 days
图2 不同温度下保存8 d的EPs平均体温反应曲线的比较
三、EPs于-20℃和-30℃贮于30d的致热效应比较：
结果见图3、表1。图3的3条MTRC大致可分3个等级：对照EPs致热性最大，-20℃EPs次之，-30℃EPs更次之。表1也表明，-30℃EPs组的△T和TRI2均明显低于对照EPs组，-20℃EPs的TRI2明显低于对照EPs组，-30℃EPs组的△T明显低于-20℃EPs组。
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Fig 3 Comparison of mean termal response curves of EPs conserved in different temperatures for 20 days and 30 days
图3 不同温度下保存20 d和30 d的EPs平均体温反应曲线的比较讨论
上述实验结果表明，EPs在4℃贮5d，其致热活性尚大部保存，但延至8d则大部丢失，远不及新制备的EPs；EPs在-20℃贮8d，其致热活性仍接近对照EPs，但若延至30d，则致热活性有一定程度减弱，提示可能其结构已有损伤，后者主要来自冻融损伤，但其致热活性仍高于在4℃贮存8d的EPs，并相当于对照EPs组的75%。
至于在-30℃贮存的EPs,虽然第5d致热活性接近对照EPs和-20℃EPs,并明显高于4℃EPs,但延至8d，则开始减弱，不仅明显低于对照EPs，也低于-20℃EPs,可能-30℃所造成的冻融损伤大于-20℃。
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综上所述，在3个温度中，应选择-20℃作为冷贮EPs的适宜温度。作者据此推荐，今后用于教学实验(或其它科研实验)的EPs制备，需要低温贮存超过1周时，采用-20℃能保存最大的致热活性，不宜采用4℃的传统温度，当然目前用于科研，根据需要可采用重组细胞因子(IL-1α、IL-1β、TNF-α)等[4]，但用于教学，价格昂贵，不胜耗费。为了接近自然条件的发热，应采用外致热源(ET等)于产EPs细胞(如血单核细胞)诱生EPs，用于教学既可节省经费，又可达到教学的综合目的。
参考文献
1 陆大祥，颜亮，张希贤.内生致热原性发热.见：张希贤主编.病理生理学实习指导.北京：科学技术文献出版社，1989.10.
2 王华东，胡巢凤，王彦平.α-MSH对家兔ET性发热反应及脑腹中隔区AVP含量的影响.中国病理生理杂志，1998，14:130.
3 Zang Yi， Li Chujie. The effects of perfusion of lateral ventricle with CaCl2 on the febrile response and cAMP content in plasma and cerebrospinal fluid during LP-induced fever. Sci In China(SeriesB)，1991,34:317.
4 李楚杰.发热时体温的正调节和负调节.中国病理生理杂志，1994，10:553.
1998年12月28日收稿，1999年2月1日修回, 百拇医药