嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究
作者：王家宁 胡大一 马雅銮 高天祥 刘勃
单位：首都医科大学附属北京红十字朝阳医院(北京100020)
关键词：寡核苷酸类；反义；基因；MYC；肌；平滑；细胞
中国病理生理杂志990317 摘 要 目的：探讨c-myc基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义c-myc寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞(SMC)增殖的作用。方法：采用针对大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子的嵌合性硫代修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(AS-ODN)，以lipofectin导入SMC后，通过细胞计数和3H-TdR掺入观察其对SMC增殖的抑制作用。结果：c-myc AS-ODN不仅对从静止状态刺激的SMC增殖有抑制作用，而且对处于增殖状态的SMC的增殖也有显著抑制作用，这种抑制作用可因加入正义c-myc ODN而减弱甚至消除，而且随着剂量的增加，抑制作用越来越明显。一次性应用c-myc AS-ODN可达到较持久的作用。而正义ODN和错配ODN对SMC增殖无影响。结论：c-myc AS-ODN以剂量依赖和序列特异方式抑制SMC增殖。c-myc基因表达在SMC增殖的信号传导通路中起重要作用。为采用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的反义战略防治再狭窄研究奠定了基础。
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Inhibition of rat aortic smooth muscle cell proliferation by chimeric phosphorothioate
antisense c-myc oligodeoxynucleotide
WANG Jia-Ning, HU Da-Yi, MA Ya-Luan, GAO Tian-Xiang, LIU Bo
The Heart Cennter, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences，Beijing(100020)
Abstract AIM：Investigate the role of c-myc gene expression in the signal transduction pathways mediating smooth muscle cell (SMC) proliferation and the effect of chimeric phosphorothioate antisense c-myc oligodeoxynucleotide (AS-ODN) on rat aortic SMC proliferation.METHODS：Chimeric phosphorothioate c-myc AS-ODN targeting the 1st 5 codons of translation initiation region of c-myc mRNA was introduced by lipofectin and its inhibitory effect on SMC proliferation was observed by cell count and [3H]-TdR incorporation. RESULTS：c-myc AS-ODN markedly suppressed proliferation of not only SMC stimulating from quiescent state but also exponential SMC. The inhibitory effect of c-myc AS-ODN on SMC proliferation was decreased and even abrogated by adding sense c-myc ODN. The larger dose there was, the greater inhibitory effect of c-myc AS-ODN on SMC proliferation there was. A single administration of c-myc AS-ODN had lasting action.Sense c-myc ODN and mismatch c-myc ODN had no significant effect on SMC proliferation compared with control. CONCLUSIONS：c-myc AS-ODN inhibited SMC proliferation in a dose-dependent and sequence-specific manner. This investigation indicates that c-myc gene product is involved in the signal transduction pathways mediating SMC proliferation and provides a basis for future study of the potential role of antisenese strategy using c-myc AS-ODN designed to inhibit SMC proliferation for the prevention of coronary restenosis.
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MeSH Oligodeoxyribonucleotides, antisense; Genes, myc; Muscle, smooth; Cells
经皮腔内冠脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)已成为冠心病的主要治疗手段之一，但术后3～6个月内发生的再狭窄是影响PTCA远期疗效的限制因素，迄今尚无有效防治再狭窄的措施[1]。反义核酸技术是近十年来兴起的技术。它的特异性和负调控靶基因的作用为再狭窄的防治带来了新的希望。
动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)的增殖是再狭窄形成的重要机制之一。c-myc基因表达是SMC从G0/G1期进入S期所必需的。多种引起SMC增殖的生长因子和血清刺激均导致c-myc基因表达增高。本研究采用针对大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子的嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, AS-ODN)，通过阳离子脂质体lipofectin导入培养的大鼠SMC，观察其对SMC增殖的影响，以期探索一条抑制SMC增殖进而防治再狭窄的新途径。
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材料与方法
(一)试剂：DMEM培养基、lipofectin、HEPES和胰蛋白酶购自GIBCO/BRL公司，胎牛血清(fetal calf serum, FCS)购自中国医科院天津血研所，3H-TdR购自中科院原子能研究所。
(二)ODN的合成和序列：ODN由美国Research公司合成。ODN 5′和3′端各3个磷酸二酯键中的一氧原子被硫取代，其它磷酸二酯键未行修饰。合成的ODN经HPLC纯化，冻干保存。正义(sense)序列5′ATG CCC CTC AAC GTG 3′;反义(antisense)序列5′CAC GTT GAG GGG CAT 3′；错配(mismatch)序列5′ CAC GTG GAG TGG CAT 3′。
(三)尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ODN的稳定性：将处于指数生长期的SMC培养上清液(含20%FCS的DMEM)取出，分别在电泳前的不同时间，加入c-myc AS-ODN至SMC培养上清液中，使其浓度达到200 mg/L，置37℃体积分数为5%CO2的孵箱中孵育。电泳时取1μL加入7μL缓冲液，2μL甲酰胺，混匀，于55℃加热5 min，再加2μL缓冲液，混匀，用微量进样器按顺序上样。加样前，先用1500V电压预电泳15 min。切断电流后，加入样品，使用1500V电压进行电泳。电泳结束后取下凝胶。EB染色1 h，紫外灯下观察照相。
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(四)SMC的培养：方法参照文献[2]。
(五)[3H]-TdR的掺入实验：方法参照文献[3]。
(六)统计方法：实验数据采用SPSS软件处理，所有计量资料均先行方差分析。若方差齐性，多组之间的两两比较采用q检验；若方差不齐，进行秩和检验，多组之间的两两比较采用推广的t检验。
结果
(一)c-myc AS-ODN在细胞培养上清液中的稳定性：c-myc AS-ODN在细胞上清液中相当稳定，一直到孵育第7天，AS-ODN也没有明显降解，说明本研究所采用的嵌合性硫代磷酸修饰的ODN性能稳定，能够抵抗核酸酶的降解。
(二)c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制：
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(1)c-myc AS-ODN对从静止状态刺激的SMC增殖的抑制：将SMC悬液接种于96孔培养板，孵育24 h后，换无血清的DMEM静止SMC 24 h，弃去培养液，加入含lipofectin 8μmol/L和c-myc AS-ODN 100 nmol/L DMEM培养液，4 h后换20%FCS的DMEM，分别于不同时间进行细胞计数，每组设3个平行孔。实验设正义ODN组，错配ODN组和对照组。结果显示，正义c-myc ODN和错配c-myc ODN对SMC增殖无影响，而c-myc AS-ODN与其它各组间差异均有显著(P<0.01)。
(2)c-myc AS-ODN对处于增殖状态的SMC增殖的抑制作用：将SMC悬液接种于96孔培养板，孵育48 h后，换含8 μmol/L lipofectin和100 nmol/L c-myc AS-ODN的DMEM培养液4 h后，换20% FCS的DMEM，分别于不同时间进行细胞计数。每组设3个平行孔。实验同时设正义ODN组、错配ODN组和对照组。结果显示，c-myc AS-ODN能显著抑制增殖状态SMC的增殖，与其它各组间相比，差异有显著，P<0.05。
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(三)Lipofectin/AS-ODN作用于SMC 4 h后，再次加入c-myc AS-ODN是否进一步抑制SMC增殖：lipofectin/AS-ODN处理SMC 4 h后，再次加入c-myc AS-ODN并不能显著增加首次使用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的效果。说明一次性使用c-myc AS-ODN对SMC增殖抑制作用的持久性，无需反复应用。
(四)生长抑制率与c-myc AS-ODN剂量的关系(图1)：生长抑制率=正常对照组细胞数-实验组细胞数/正常对照组细胞数-接种细胞数×100%。c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制存在着明显的剂量效应关系，生长抑制率=0.36192+0.15727 lgConc,其中Conc代表c-myc AS-ODN的浓度，单位为μmol/L,相关系数r=0.9867，P<0.01。
Fig 1 Curve showing dose-dependent growth inhibition of SMC after c-myc AS-ODN administration. Percent inhibition was calculated at day 7 by comparison of cell number in c-myc AS-ODN treated cells with that of control group.
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图1 不同浓度的c-myc AS-ODN对生长抑制率的影响
(五)正义c-myc AS-ODN对c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的逆转作用(图2)：在c-myc AS-ODN浓度不变的情况下，改变正义与反义ODN的浓度比，可以看出，随着正义c-myc AS-ODN剂量的加大，c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制作用逐渐减弱，在正义ODN与反义ODN浓度之比为10∶1时，正义ODN几乎完全消除反义ODN抑制SMC增殖的作用。
Fig 2 Growth curves of SMC showing that the growth-inhibitory effect of c-myc AS-ODN is prevented by excess of sense oligomers. Rat SMC were incubated with 100 nmol/L c-myc AS-ODN alone or with excess sense oligomers in the presence of 8 μmol/L lipofectin for 4 h, medium was replaced with 20% FCS*DMEM. Live cells were counted at the indicated period of time
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图2 正义c-myc ODN对c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的影响
(六)c-myc AS-ODN对SMC [3 H]-TdR掺入的影响(图3)：c-myc ODN能显著抑制[3H]-TdR掺入SMC，c-myc AS-ODN组与其它各组之间相比，差异有显著(P<0.01)。
Fig 3 The amount of [3H]-TdR incorporation of SMC treated with antisense, sense and mismatch oligomers and left untreated with oligomers
图3 c-myc AS-ODN对SMC [3 H]-TdR掺入的影响
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(七)正义c-myc AS-ODN对c-myc ODN抑制[3H]-TdR掺入SMC的影响(图略)：c-myc AS-ODN对SMC [3 H]-TdR掺入的抑制，随着正义c-myc ODN剂量的加大，其作用逐渐减弱。在正义与反义c-myc ODN浓度之比为10∶1，[3H]-TdR的掺入量与对照组相比，P>0.05,说明大剂量的正义c-myc ODN可完全逆转c-myc AS-ODN的作用。
讨论
反义核酸技术抑制SMC增殖已有报道[4～6]。反义ODN针对的靶点包括c-myc、非肌源性肌球蛋白重链(nonmuscle myosin heavy chain)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)等。本研究采用针对大鼠c-myc mRNA翻译起始区前5个密码子的嵌合性硫代修饰c-myc AS-ODN，在细胞上清液中非常稳定，将其通过lipofectin导入SMC后以剂量依赖和序列特异方式抑制SMC增殖。现将有关问题讨论如下：
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(一)c-myc AS-ODN的设计[7]：本研究中所针对的序列是大鼠c-myc mRNA的翻译起始区，因为该区较少含有二级结构，便于AS-ODN与靶序列相结合。据计算，在基因组中识别一单一特异序列所需的最小数目为12～15个碱基。在实际研究中，大多采用15～30个左右碱基的长度。本实验中c-myc AS-ODN的长度为15个碱基。本实验采用了磷酸骨架修饰，将核苷酸间的磷酸二酯键的一个氧原子被硫取代，目的在于增加ODN对核酸酶的抵抗性，同时保留了修饰的ODN仍为RNase H底物的特点，通过间接方式诱导靶序列的降解。ODN的修饰固然可以增加对核酸酶的抵抗性，却有可能降低其与靶序列的亲合性。因此本实验只修饰两端部分序列，两端的修饰是保护ODN免受核酸酶降解所必需的，是一种三明治式的嵌合性修饰。
(二)c-myc AS-ODN的稳定性：c-myc AS-ODN在细胞培养上清液中孵育不同时间后，进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现孵育7 d后，其浓度仍然没有显著变化，未发生明显降解，说明嵌合性硫代修饰的ODN非常稳定。
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(三)剂量依赖性：本研究结果表明，c-myc不仅能抑制从静止状态刺激的SMC增殖，而且对处于增殖状态的SMC亦有类似的抑制作用。随着c-myc AS-ODN剂量的加大，其对SMC增殖的抑制作用越来越明显，在c-myc AS-ODN的浓度为100 nmol/L时，第7 d时生长抑制率为63.5%，c-myc AS-ODN浓度为5 μmol/L时，生长抑制率为99.3%，存在着明显的剂量效应关系。
(四)作用的持久性：虽然一次性使用c-myc AS-ODN，可以看出在相当长的一段时间内显著抑制了SMC增殖，再次加入c-myc AS-ODN，对首次使用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的作用仅有轻度加强，使生长抑制率增加6%～10%，但差异无显著性，进一步说明了c-myc AS-ODN对SMC增殖的作用持久性。一次性使用c-myc AS-ODN对SMC增殖可达到比较持久的效果，这可能与c-myc基因是一迅速早期反应基因有关。
(五)c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制具有序列特异性：c-myc AS-ODN显著抑制了SMC增殖和[3H]-TdR掺入，而正义ODN和错配ODN对SMC增殖和[3H]-TdR掺入无影响。c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制作用可因加入过量的正义c-myc ODN而减弱甚至消除，这进一步说明c-myc AS-ODN作用的序列特异性。
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本研究进一步提示c-myc基因在SMC增殖中起着重要作用，c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制为防治血管损伤后再狭窄的发生提供了一种新的思路。
*湖北省十堰市郧阳医学院附属太和医院心内科(442000)
参考文献
1 Franklin SM, Faxon DP. Pharmacological prevention of restenosis after coronary angioplasty: review of randomized trials. Coronary Artery Dis, 1993, 4: 232.
2 汪浩川，刘秉文，傅明德.人动脉平滑肌细胞贴块培养法.华西医科大学学报，1995，26(1)：105.
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3 熊一力，赵华月.穿心莲成分API0134对猪主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用.中华心血管病杂志，1995，23(3)：214.
4 Simons M, Posenberg RD. Antisense nonmuscle myosin heavy chain and c-myb oligonucleotides suppress smooth muscle cell proliferation in vitro. Circ Res, 1992, 70:835.
5 Simons M, Edelman ER, Dekeyser JL, et al. Antisense c-myb oligonucleotides inhibit intimal arterial smooth muscle cell accumulation in vivo. Nature, 1992, 359:67.
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6 Speir E, Epstein SE. Inhibition of smooth muscle cell proliferation by antisense oligodeoxynucleotide targeting the messenger RNA encoding proliferating cell nuclear antigen. Circulation, 1992, 86:538.
7 Bennett MR, Evan GL. Antisense therapy for angioplasty restenosis: some critical considerations. Circulation, 1995, 92:1981.
1997年6月27日收稿，1998年4月15日修回, 百拇医药
单位：首都医科大学附属北京红十字朝阳医院(北京100020)
关键词：寡核苷酸类；反义；基因；MYC；肌；平滑；细胞
中国病理生理杂志990317 摘 要 目的：探讨c-myc基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义c-myc寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞(SMC)增殖的作用。方法：采用针对大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子的嵌合性硫代修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(AS-ODN)，以lipofectin导入SMC后，通过细胞计数和3H-TdR掺入观察其对SMC增殖的抑制作用。结果：c-myc AS-ODN不仅对从静止状态刺激的SMC增殖有抑制作用，而且对处于增殖状态的SMC的增殖也有显著抑制作用，这种抑制作用可因加入正义c-myc ODN而减弱甚至消除，而且随着剂量的增加，抑制作用越来越明显。一次性应用c-myc AS-ODN可达到较持久的作用。而正义ODN和错配ODN对SMC增殖无影响。结论：c-myc AS-ODN以剂量依赖和序列特异方式抑制SMC增殖。c-myc基因表达在SMC增殖的信号传导通路中起重要作用。为采用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的反义战略防治再狭窄研究奠定了基础。
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Inhibition of rat aortic smooth muscle cell proliferation by chimeric phosphorothioate
antisense c-myc oligodeoxynucleotide
WANG Jia-Ning, HU Da-Yi, MA Ya-Luan, GAO Tian-Xiang, LIU Bo
The Heart Cennter, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences，Beijing(100020)
Abstract AIM：Investigate the role of c-myc gene expression in the signal transduction pathways mediating smooth muscle cell (SMC) proliferation and the effect of chimeric phosphorothioate antisense c-myc oligodeoxynucleotide (AS-ODN) on rat aortic SMC proliferation.METHODS：Chimeric phosphorothioate c-myc AS-ODN targeting the 1st 5 codons of translation initiation region of c-myc mRNA was introduced by lipofectin and its inhibitory effect on SMC proliferation was observed by cell count and [3H]-TdR incorporation. RESULTS：c-myc AS-ODN markedly suppressed proliferation of not only SMC stimulating from quiescent state but also exponential SMC. The inhibitory effect of c-myc AS-ODN on SMC proliferation was decreased and even abrogated by adding sense c-myc ODN. The larger dose there was, the greater inhibitory effect of c-myc AS-ODN on SMC proliferation there was. A single administration of c-myc AS-ODN had lasting action.Sense c-myc ODN and mismatch c-myc ODN had no significant effect on SMC proliferation compared with control. CONCLUSIONS：c-myc AS-ODN inhibited SMC proliferation in a dose-dependent and sequence-specific manner. This investigation indicates that c-myc gene product is involved in the signal transduction pathways mediating SMC proliferation and provides a basis for future study of the potential role of antisenese strategy using c-myc AS-ODN designed to inhibit SMC proliferation for the prevention of coronary restenosis.
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MeSH Oligodeoxyribonucleotides, antisense; Genes, myc; Muscle, smooth; Cells
经皮腔内冠脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)已成为冠心病的主要治疗手段之一，但术后3～6个月内发生的再狭窄是影响PTCA远期疗效的限制因素，迄今尚无有效防治再狭窄的措施[1]。反义核酸技术是近十年来兴起的技术。它的特异性和负调控靶基因的作用为再狭窄的防治带来了新的希望。
动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)的增殖是再狭窄形成的重要机制之一。c-myc基因表达是SMC从G0/G1期进入S期所必需的。多种引起SMC增殖的生长因子和血清刺激均导致c-myc基因表达增高。本研究采用针对大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子的嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, AS-ODN)，通过阳离子脂质体lipofectin导入培养的大鼠SMC，观察其对SMC增殖的影响，以期探索一条抑制SMC增殖进而防治再狭窄的新途径。
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材料与方法
(一)试剂：DMEM培养基、lipofectin、HEPES和胰蛋白酶购自GIBCO/BRL公司，胎牛血清(fetal calf serum, FCS)购自中国医科院天津血研所，3H-TdR购自中科院原子能研究所。
(二)ODN的合成和序列：ODN由美国Research公司合成。ODN 5′和3′端各3个磷酸二酯键中的一氧原子被硫取代，其它磷酸二酯键未行修饰。合成的ODN经HPLC纯化，冻干保存。正义(sense)序列5′ATG CCC CTC AAC GTG 3′;反义(antisense)序列5′CAC GTT GAG GGG CAT 3′；错配(mismatch)序列5′ CAC GTG GAG TGG CAT 3′。
(三)尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ODN的稳定性：将处于指数生长期的SMC培养上清液(含20%FCS的DMEM)取出，分别在电泳前的不同时间，加入c-myc AS-ODN至SMC培养上清液中，使其浓度达到200 mg/L，置37℃体积分数为5%CO2的孵箱中孵育。电泳时取1μL加入7μL缓冲液，2μL甲酰胺，混匀，于55℃加热5 min，再加2μL缓冲液，混匀，用微量进样器按顺序上样。加样前，先用1500V电压预电泳15 min。切断电流后，加入样品，使用1500V电压进行电泳。电泳结束后取下凝胶。EB染色1 h，紫外灯下观察照相。
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(四)SMC的培养：方法参照文献[2]。
(五)[3H]-TdR的掺入实验：方法参照文献[3]。
(六)统计方法：实验数据采用SPSS软件处理，所有计量资料均先行方差分析。若方差齐性，多组之间的两两比较采用q检验；若方差不齐，进行秩和检验，多组之间的两两比较采用推广的t检验。
结果
(一)c-myc AS-ODN在细胞培养上清液中的稳定性：c-myc AS-ODN在细胞上清液中相当稳定，一直到孵育第7天，AS-ODN也没有明显降解，说明本研究所采用的嵌合性硫代磷酸修饰的ODN性能稳定，能够抵抗核酸酶的降解。
(二)c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制：
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(1)c-myc AS-ODN对从静止状态刺激的SMC增殖的抑制：将SMC悬液接种于96孔培养板，孵育24 h后，换无血清的DMEM静止SMC 24 h，弃去培养液，加入含lipofectin 8μmol/L和c-myc AS-ODN 100 nmol/L DMEM培养液，4 h后换20%FCS的DMEM，分别于不同时间进行细胞计数，每组设3个平行孔。实验设正义ODN组，错配ODN组和对照组。结果显示，正义c-myc ODN和错配c-myc ODN对SMC增殖无影响，而c-myc AS-ODN与其它各组间差异均有显著(P<0.01)。
(2)c-myc AS-ODN对处于增殖状态的SMC增殖的抑制作用：将SMC悬液接种于96孔培养板，孵育48 h后，换含8 μmol/L lipofectin和100 nmol/L c-myc AS-ODN的DMEM培养液4 h后，换20% FCS的DMEM，分别于不同时间进行细胞计数。每组设3个平行孔。实验同时设正义ODN组、错配ODN组和对照组。结果显示，c-myc AS-ODN能显著抑制增殖状态SMC的增殖，与其它各组间相比，差异有显著，P<0.05。
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(三)Lipofectin/AS-ODN作用于SMC 4 h后，再次加入c-myc AS-ODN是否进一步抑制SMC增殖：lipofectin/AS-ODN处理SMC 4 h后，再次加入c-myc AS-ODN并不能显著增加首次使用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的效果。说明一次性使用c-myc AS-ODN对SMC增殖抑制作用的持久性，无需反复应用。
(四)生长抑制率与c-myc AS-ODN剂量的关系(图1)：生长抑制率=正常对照组细胞数-实验组细胞数/正常对照组细胞数-接种细胞数×100%。c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制存在着明显的剂量效应关系，生长抑制率=0.36192+0.15727 lgConc,其中Conc代表c-myc AS-ODN的浓度，单位为μmol/L,相关系数r=0.9867，P<0.01。
Fig 1 Curve showing dose-dependent growth inhibition of SMC after c-myc AS-ODN administration. Percent inhibition was calculated at day 7 by comparison of cell number in c-myc AS-ODN treated cells with that of control group.
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图1 不同浓度的c-myc AS-ODN对生长抑制率的影响
(五)正义c-myc AS-ODN对c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的逆转作用(图2)：在c-myc AS-ODN浓度不变的情况下，改变正义与反义ODN的浓度比，可以看出，随着正义c-myc AS-ODN剂量的加大，c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制作用逐渐减弱，在正义ODN与反义ODN浓度之比为10∶1时，正义ODN几乎完全消除反义ODN抑制SMC增殖的作用。
Fig 2 Growth curves of SMC showing that the growth-inhibitory effect of c-myc AS-ODN is prevented by excess of sense oligomers. Rat SMC were incubated with 100 nmol/L c-myc AS-ODN alone or with excess sense oligomers in the presence of 8 μmol/L lipofectin for 4 h, medium was replaced with 20% FCS*DMEM. Live cells were counted at the indicated period of time
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图2 正义c-myc ODN对c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的影响
(六)c-myc AS-ODN对SMC [3 H]-TdR掺入的影响(图3)：c-myc ODN能显著抑制[3H]-TdR掺入SMC，c-myc AS-ODN组与其它各组之间相比，差异有显著(P<0.01)。
Fig 3 The amount of [3H]-TdR incorporation of SMC treated with antisense, sense and mismatch oligomers and left untreated with oligomers
图3 c-myc AS-ODN对SMC [3 H]-TdR掺入的影响
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(七)正义c-myc AS-ODN对c-myc ODN抑制[3H]-TdR掺入SMC的影响(图略)：c-myc AS-ODN对SMC [3 H]-TdR掺入的抑制，随着正义c-myc ODN剂量的加大，其作用逐渐减弱。在正义与反义c-myc ODN浓度之比为10∶1，[3H]-TdR的掺入量与对照组相比，P>0.05,说明大剂量的正义c-myc ODN可完全逆转c-myc AS-ODN的作用。
讨论
反义核酸技术抑制SMC增殖已有报道[4～6]。反义ODN针对的靶点包括c-myc、非肌源性肌球蛋白重链(nonmuscle myosin heavy chain)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)等。本研究采用针对大鼠c-myc mRNA翻译起始区前5个密码子的嵌合性硫代修饰c-myc AS-ODN，在细胞上清液中非常稳定，将其通过lipofectin导入SMC后以剂量依赖和序列特异方式抑制SMC增殖。现将有关问题讨论如下：
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(一)c-myc AS-ODN的设计[7]：本研究中所针对的序列是大鼠c-myc mRNA的翻译起始区，因为该区较少含有二级结构，便于AS-ODN与靶序列相结合。据计算，在基因组中识别一单一特异序列所需的最小数目为12～15个碱基。在实际研究中，大多采用15～30个左右碱基的长度。本实验中c-myc AS-ODN的长度为15个碱基。本实验采用了磷酸骨架修饰，将核苷酸间的磷酸二酯键的一个氧原子被硫取代，目的在于增加ODN对核酸酶的抵抗性，同时保留了修饰的ODN仍为RNase H底物的特点，通过间接方式诱导靶序列的降解。ODN的修饰固然可以增加对核酸酶的抵抗性，却有可能降低其与靶序列的亲合性。因此本实验只修饰两端部分序列，两端的修饰是保护ODN免受核酸酶降解所必需的，是一种三明治式的嵌合性修饰。
(二)c-myc AS-ODN的稳定性：c-myc AS-ODN在细胞培养上清液中孵育不同时间后，进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现孵育7 d后，其浓度仍然没有显著变化，未发生明显降解，说明嵌合性硫代修饰的ODN非常稳定。
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(三)剂量依赖性：本研究结果表明，c-myc不仅能抑制从静止状态刺激的SMC增殖，而且对处于增殖状态的SMC亦有类似的抑制作用。随着c-myc AS-ODN剂量的加大，其对SMC增殖的抑制作用越来越明显，在c-myc AS-ODN的浓度为100 nmol/L时，第7 d时生长抑制率为63.5%，c-myc AS-ODN浓度为5 μmol/L时，生长抑制率为99.3%，存在着明显的剂量效应关系。
(四)作用的持久性：虽然一次性使用c-myc AS-ODN，可以看出在相当长的一段时间内显著抑制了SMC增殖，再次加入c-myc AS-ODN，对首次使用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的作用仅有轻度加强，使生长抑制率增加6%～10%，但差异无显著性，进一步说明了c-myc AS-ODN对SMC增殖的作用持久性。一次性使用c-myc AS-ODN对SMC增殖可达到比较持久的效果，这可能与c-myc基因是一迅速早期反应基因有关。
(五)c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制具有序列特异性：c-myc AS-ODN显著抑制了SMC增殖和[3H]-TdR掺入，而正义ODN和错配ODN对SMC增殖和[3H]-TdR掺入无影响。c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制作用可因加入过量的正义c-myc ODN而减弱甚至消除，这进一步说明c-myc AS-ODN作用的序列特异性。
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本研究进一步提示c-myc基因在SMC增殖中起着重要作用，c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制为防治血管损伤后再狭窄的发生提供了一种新的思路。
*湖北省十堰市郧阳医学院附属太和医院心内科(442000)
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1997年6月27日收稿，1998年4月15日修回, 百拇医药