当前位置: 首页 > 期刊 > 《中国病理生理杂志》 > 1999年第3期
编号:10271378
肺动脉与冠状动脉内皮环氧合酶及TXA2合酶基因表达的差异*
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 1999年第3期
     作者:于江洲 王迪浔

    单位:同济医科大学病理生理学教研室(武汉430030)

    关键词:缺氧;内皮;前列腺素内过氧化物合酶;血栓烷合成酶;基因表达

    肺动脉与冠状动脉内皮环氧合酶及TXA2合酶基因表达的差异 摘 要 目的与方法:应用分子杂交和放免法观察了缺氧下培养的猪肺动脉内皮细胞(PAEC)和冠状动脉内皮细胞(CAEC)的环氧合酶-1(COX-1),环氧合酶-2(COX-2)和血栓素A2合酶(TXS)基因表达及前列腺素生成的变化。结果:(1)常氧下培养24 h PAEC的COX-2 mRNA含量为CAEC的1.5倍;PAEC的PGI2生成量明显高于CAEC。(2)缺氧培养24 h PAEC和CAEC中COX-1mRNA均增加,分别是其常氧对照组的2.5倍和3倍,而COX-2 mRNA含量仅在PAEC中明显增多,达其对照组的1.6倍。(3)缺氧对CAEC的PGI2生成量增加的幅度大于PAEC的增量。(4)PAEC和CAEC在常氧下和缺氧时TXS基因表达TXA2产量均无明显差异。结论:PAEC和CAEC在常氧下和缺氧时COX基因表达和PGI2生成的差异可能与肺动脉和冠脉的基础张力和缺氧反应的差异有关。
, http://www.100md.com
    Expression of cyclooxygenase and thromboxane synthase genes in pulmonary and coronary arterial endothelial cells

    YU Jiang-Zhou, WANG Di-Xun

    Department of Pathophysiology, Tongji Medical University, Wuhan(430030)

    Abstract AIM:The expression of cyclooxygenase-1 (COX-1), cyclooxygenase-2(COX-2) as well as thromboxane synthase (TXS) genes and the production of PGI2 and TXA2 in cultured pulmonary and coronary artery endothelial cells (PAEC and CAEC) were studied by methods of dot blot and RIA.RESULTS:(1)After cultured in normoxia for 24h, COX-2 mRNA in PAEC was 1.5 times as much as those in CAEC(P<0.05); (2)After cultured in hypoxia for 24 h, COX-1 mRNA were 2.5 times in PAEC and 3 times in CAEC compared with normoxic control. However, COX-2 mRNA only increased in hypoxic PAEC, which was 1.6 times that of it's normoxic group; (3) Hypoxia increased the production of PGI2 both in PAEC and CAEC, its increment in PAEC was higher than that in CAEC;(4) There was no difference in TXS gene expression and TXA2 production of PAEC and CAEC either in normoxic or in hypoxic group.CONCLUSION:The difference in COX gene expression and PGI2 production between PAEC and CAEC might be responsible for their different basal tone and their different responsiveness to hypoxia.
, 百拇医药
    MeSH Anoxia; Endothelium; Prostaglandin-endoperoxide synthase; Thromboxane synthetase; Gene expression

    血管的缺氧反应有器官异质性,缺氧使肺动脉发生收缩反应,而体循环和冠状动脉,脑动脉则出现舒张反应。此异质性的机制目前还不清楚。前列腺素(PGs)是肺、冠状动脉缺氧反应中起重要作用的血管活性物质,近年发现PGs生成的限速酶,即环加氧酶有二种亚型:环氧合酶-1(cyclooxyenase-1,COX-1)和环氧合酶-2(cyclooxyenase-2,COX-2),两者的生理和病理生理作用尚待研究。本研究探讨在常氧和缺氧下肺动脉与冠状动脉内皮细胞的COX-1、COX-2的基因表达和PGI2、TXA2生成的差异,为了解肺动脉与冠脉血管对缺氧反应差异的机制提供线索。

    材料与方法
, http://www.100md.com
    (一)内皮细胞培养及分组:猪肺动脉内皮细胞培养及猪冠状动脉内皮细胞分离依本室方法[1,2]。内皮细胞Ⅷ因子免疫染色鉴定。第3代内皮细胞用于实验。内皮细胞培养分2组:(1)常氧对照组:在CO2培养箱中培养24 h。(2)缺氧组:在含95%N2,5%CO2混合气的自制密封小室内37℃培养24 h。

    (二)cDNA探针制备:COX cDNA由美国密西根大学Dewitt博士惠赠。血栓素A2合成酶(thromboxane synthase,TXS) cDNA质粒由美国德克萨斯州立大学Wang博士惠赠。被转染到大肠杆菌JM109中并扩增,经碱变性法提取质粒DNA,经酶切电泳,冻融法回收COX-1,COX-2及TXS cDNA探针。

    (三)细胞总RNA的提取与斑点杂交(dot blot):细胞总RNA的提取采用一步法进行[3]。琼脂糖-甲醛电泳可见清晰的18S和28S条带。取25 μg细胞样品RNA点样于硝酸纤维膜。冻融法回收cDNA片断。用随机引物标记法以[α-32P]-dCTP标记COX-1,COX-2和TXS cDNA片断作为杂交探针。将杂交膜放入预杂交液中42℃杂交24 h,按常规洗膜。-70℃曝光,显影后经TJY-300型全自动图像分析仪测定斑点的光密度以确定COX和TXS mRNA的相对量。
, 百拇医药
    (四)条件培养液中TXB2和6-keto-PGF含量测定:应用放射免疫法测定TXA2和PGI2的稳定代谢产物血栓素B2(TXB2)和6-酮一前列腺素F1α(6-keto-PGF)含量。由江苏省血栓研究所提供试剂盒,放免测定结果以x-47.gif (98 bytes)±s表示,进行组间t检验。

    结果

    一、常氧和缺氧时肺动脉内皮细胞(pulmonary endothelial cells,PAEC)和冠脉内皮细胞(coronary artery endothelial cells,CAEC)中COX-1和COX-2mRNA的含量以及TXS mRNA含量:
, 百拇医药
    培养的PAEC和CAEC在常氧下均有COX基因表达,PAEC中COX-2 mRNA含量较高,为CAEC的1.5倍。而COX-1 mRNA含量在两种内皮细胞中无差异。缺氧时PAEC和CAEC COX-1 mRNA水平均升高,分别为其常氧对照组的2.5倍和3倍,COX-2 mRNA含量仅在PAEC中明显升高,达对照组的1.6倍,缺氧对CAEC的COX-2 mRNA含量无明显影响(图1)。

    二、培养的PAEC和CAEC在常氧下均有TXS基因表达。缺氧对两者TXS mRNA水平均无明显影响。

    三、常氧和缺氧时PAEC和CAEC条件培养基中6-keto-PGF和TXB2的含量:

    从表1可见,在常氧下两种内皮细胞均有6-keto-PGF和TXB2生成,并且PAEC的6-keto-PGF的生成量明显高于CAEC,但两者生成TXB2量无明显差异。缺氧可使两种内皮细胞的6-keto-PGF生成显著增加,PAEC的增加量相对少于CAEC者,而缺氧对两种内皮细胞的TXA2的生成无明显影响,故PAEC的缺氧条件培养液中6-keto-PGF/TXB2比值明显低于CAEC者。
, 百拇医药
    表1 PAECs和CAECs在常氧或缺氧下培养24 h时培养基中6-keto-PGF和TXB2的含量

    Tab 1 6-keto-PGF and TXB2 content in medium of PAECs

    and CAECs cultured under normoxia or hypoxia for 24 hours (ng/L, x-48.gif (98 bytes)±s, n=3)

    PAEC

    CAEC
, 百拇医药
    6-keto-PGF

    TXB2

    6-keto-PGF

    6-keto-PGF

    TXB2

    6-keto-PGF

    TXB2

    TXB2

    Normoxia

    154.42±22.53
, 百拇医药
    60.83±10.92

    2.35±0.52

    96.25±9.62

    52.64±8.64

    1.69±0.61

    Hypoxia

    259.42±17.48*

    77.04±10.05

    3.19±0.39*

    229.15±32.14*
, 百拇医药
    55.68±10.61

    4.43±0.36*

    *P<0.05, vs normoxia group; △P<0.05, vs CAEC 04.gif (5967 bytes)

    Fig 1 Dot blot of COX-1 mRNA and COX-2 mRNA in PAECs and CAECs cultured in normoxic or hypoxic medium for 24 hours N=normoxia H=hypoxia

    图1 肺动脉和冠状动脉内皮细胞在常氧或缺氧下培养24 h时COX-1 mRNA和 COX-2 mRNA的斑点杂交
, 百拇医药
    讨论

    研究发现,常氧下PAEC及CAEC均有COX和TXS基因表达及PGI2,TXA2的生成,但PAEC的PGI2生成量多于CAEC。本室以前也发现猪PAEC的PGI2生成多于猪主动脉内皮细胞[4]。PGI2的主要生物学作用是舒张血管,常氧下肺动脉内皮细胞生成较大量PGI2,提示其与维持肺动脉低张状态有关。缺氧时,CAEC生成PGI2增加的幅度及6-keto-PGF/TXB2比值增加的幅度大于PAEC者,表明在缺氧性冠脉舒张反应中存在PGI2的作用。PAEC在缺氧时也有PGI2生成增多,这符合我室以往研究的结论,即在缺氧性肺血管收缩反应中扩管性前列腺素起调节作用。Farber等也曾报道,培养的牛PAEC和主动脉内皮细胞在缺氧反应中产生的PGs存在差异[5]。环加氧酶是PGs生成中的限速酶,目前已发现有两种亚型。本实验常氧下PAEC的COX-2基因表达高于CAEC,这可能是PAEC常氧下PGI2产生较多的主要分子机制。缺氧时PAEC和CAEC的COX-1均表达增加,表明COX-1表达增加也是两种内皮细胞缺氧时PGI2生成增多的原因。PAEC在缺氧时COX-2的表达显著增加,而CAEC则无明显变化。这与缺氧时CAEC生成的PGI2多于PAEC的结果不符,可能PAEC缺氧时COX-2表达增加还与肺血管缺氧反应中缩血管性PGs生成有关。本实验也发现在常氧或缺氧下,TXS的基因表达及TXA2的生成在PAEC和CAEC间无明显差异,说明TXA2可能与肺动脉和冠脉缺氧反应差异无关。
, 百拇医药
    *国家八五攻关项目(No.85-915-03-06)

    参考文献

    1 Su YC, Wang DX. Effects of cigarette smoking, hypoxia and vasoactive mediators on the production of PGI2 and TXA2 in cultured pulmonary artery endothelial cells.J Tongji Med Univ, 1991,11(1):6.

    2 于江洲,王迪浔.缺氧时猪肺动脉平滑肌细胞中环氧合酶和血栓素合酶基因表达变化的研究.同济医科大学学报,1997,26(1):7.

    3 Hieda HS, Gomez-Sanchez CE. Hypoxia increases endothelin release in bovine endothelial cells in culture, but epinephrine, norepinephrine, serotonin, histamine and angiotensin Ⅱ do not. Life Sci, 1990,47:247.
, 百拇医药
    4 Su YC, Jin XR. Relation of TXA2 and PGI2 to the different strains of rats. J Tongji Med Univ, 1989,9(3):148.

    5 Farber HW,Barnett HF. Differences in prostaglandin metabolism in cultured aortic and pulmonary arterial endothelial cells exposed to acute and chronic hypoxia. Circ Res, 1991, 68:1446.

    1997年8月26日收稿,1998年3月17日修回, 百拇医药