红细胞带Ⅲ蛋白C1肽链的纯化及其功能的初步研究
作者：傅国辉 姜晓姝 王孝铭 滨奇直孝*
单位：哈尔滨医科大学病理生理教研室(哈尔滨 150086)
关键词：带3蛋白质；肽类；红细胞
红细胞带 摘 要 目的：研究红细胞带Ⅲ蛋白C1肽链(带Ⅲ蛋白Ala893-Va1911)的特性及其功能。方法：以100 mmol/L NaOH预处理红细胞膜血影，再用胰蛋白酶消化，采用高效液相色谱(HPLC)及氨基酸测序仪分析检定了从红细胞血影中释放的多肽，并纯化了带Ⅲ蛋白C1肽链，以不同浓度的C1肽链与新鲜的红细胞血影进行温浴。结果：C1肽链与红细胞内的新蛋白酶活性有关。
Purification and characterization of C1 peptide released from band 3 protein
, 百拇医药
FU Guo-Hui, JIANG Xiao-Shu, WANG Xiao-Ming, Naotaka Hamasaki
Dept. of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin (150086)
Abstract AIM: In order to study the properties of C1 peptide(band 3 Ala893-Va1911).METHODS:The human erythrocyte white ghost were pre-treated by 100 mmol/L NaOH and then digested by trypsin. Using the HPLC and amino acid sequencer, we identified the peptides that released from white ghost, and purified the C1 peptides(band 3 Ala893-Va1911). The C1 peptides were used to incubate with fresh white ghosts.RESULTS:C1 peptides related with a novel protease activity.
, 百拇医药
MeSH Band 3 protein; Peptides; Erythrocytes
带Ⅲ蛋白(band 3)是由911个氨基酸组成，分子量约10万的糖蛋白质，它占红细胞膜蛋白质总量的25%[1]，其N-末端为亲水性，参与红细胞的各种生理活动[2]。C-末端为疏水性，预测它14次贯穿红细胞膜的脂质双分子层，这一区域也是C1-/HCO-3离子交换的活性部位[3]。位于红细胞内侧的、由32个氨基酸组成的C末端尾部与跨膜部分不同，其特点是含有大量携带负电荷、具有很强亲水性的氨基酸。这段肽链虽然有两个胰蛋白酶的切断位点，但在一般条件下，胰蛋白酶却不能发挥作用，说明C末端尾部并不像N末端那样游离于细胞浆内，可能与其它蛋白质发生相互作用或以其它形式附着在红细胞膜上[4]。本实验首先检定了在胰蛋白酶作用下从红细胞膜释放的多肽，并从中分离纯化了C1(Ala893-Va1911)肽链，再分别以不同浓度的C1肽链与新鲜红细胞膜血影进行温浴实验，对带Ⅲ蛋白C末端的特性及功能进行初步研究。
, 百拇医药
材料与方法
红细胞膜血影的制备：正常人血(4℃ 保存不超过2周)由日本国福冈市红十字中心血站提供，全血用PBS在室温条件下洗4次，然后悬浮于PBS溶液中，向该悬浮液中加入胰蛋白酶(0.2 mg/mL)在37℃条件下消化1 h，以去除红细胞膜表面的蛋白质。消化结束后再用PBS洗红细胞4次，向洗过的红细胞中加入20倍体积的5 mmol/L NaHCO3，使红细胞溶解，并在冰浴条件下搅拌5 min，同时加入蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟(0.2 mg/mL)，溶解后的红细胞在4℃条件下，以12 000×g，在4℃离心30 min，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次，最终以1 mg/mL的蛋白浓度将红细胞血影悬浮在5 mmol/L NaHCO3溶液中[4]。
C1肽键的纯化：取分离制备的红细胞膜血影，向其中加入5倍体积的100 mmol/L NaOH，在冰浴中搅拌15 min，以28 400×g，在4℃离心20 min，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次后，重新悬浮于5 mmol/L NaHCO3溶液中，调蛋白浓度至1.5 mg/mL，向该样品中以15 μg/mL的浓度加入胰蛋白酶，在37℃条件下消化1 h，然后以27 200×g，4℃离心30 min，上清用逆相高效液相色谱技术进行多肽检定，用气相氨基酸测序仪(Applied Biosystems, model 492)测序，回收C1肽链。
, 百拇医药
色谱分离的条件：采用逆相色谱柱Cosmosil C-18, 4.6 mm×250 mm，流动相为0～100%线性梯度的乙腈(内含0.1% 三氟乙酸)。
新鲜红细胞膜血影的制备：全血40 mL，用PBS洗4次，然后溶解于5 mmol/L NaHCO3溶液中，用5 mmol/L NaHCO3洗2次，5 mmol/L NaHCO3含0.15 mol/L NaCl洗1次，调蛋白浓度至1 mg/mL。
温浴实验：取纯化的C1肽链，以0、5、10、30、80 μmol/L的浓度分别加入5个试管，冷冻离心干燥后向其中加入新鲜红细胞膜血影，轻轻混均，在37℃温浴1 h后在4℃以15 000×g离心20 min，上清用逆相高效液相色谱进行分析后，有多肽吸收峰的样品进行氨基酸测序。
SDS-PAGE(聚丙烯凝胶电泳)：蛋白分析采用laemmli 1970年报告的方法。蛋白质首先用Lowry法进行定量，然后用9%聚丙烯凝胶进行电泳分析。
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结果
因为红细胞膜在自然状态下，带Ⅲ蛋白的C末端尾部对胰蛋白酶具有抵抗性。因此，我们选择不同浓度NaOH对细胞膜进行了处理，根据从红细胞膜释放C1肽链的多少最终确定100 mmol/L NaOH为最适浓度(图1)。C1肽链的释放以32 min多肽释放量为标准，后者在不同条件下释放量恒定，每一点为3次实验的平均值。图2显示了红细胞膜带Ⅲ蛋白在胰蛋白酶的作用下所释放多肽的HPLC图谱，多肽分析采用逆相色谱柱(Cosmosil C-18,4.6 mm×250 mm)和0～100%线性梯度的乙腈(内含0.1%三氟乙酸)，根据氨基酸测序确定了C1肽链的所在位置，收集C1肽链的样品，再以0.05 mL/min的缓慢流速进行2次HPLC分析，直至获得高纯度的C1多肽样品。
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Fig 1 Effect of NaOH treatment on the amount of C1 peptide released into the supernatant 图1 氢氧化钠对红细胞膜C1肽链释放量的影响
Fig 2 HPLC analyses of membrane peptides released into the supernatant following trypsin treatment 图2 氢氧化钠预处理红细胞膜在胰蛋白酶作用下释放至上清中多肽的HPLC图谱
取C1多肽与新鲜红细胞血影进行温浴实验，经离心获得沉淀(红细胞膜)及上清(释放的多肽)，沉淀的SDS-PAGE图像显示当C1多肽在5、10 μmol/L时与对照实验(0 μmol/L)无差异，在沉淀及上清中均未见蛋白质带的增加或减少，但当C1多肽浓度达到30 μmol/L时，带Ⅲ蛋白及带4.1蛋白被逐渐分解(图3)，我们对温浴的上清进行HPLC分析，结果显示，当C1多肽浓度在5，10 μmol/L时，HPLC图谱为单一的主峰，经氨基酸测序证明该主峰为C1多肽和血型糖蛋白A(GPA)Lys101-Gln131，当C1多肽浓度升至30，80 μmol/L时，HPLC图谱显示了3个主峰，经氨基酸测序证明3个主峰分别为GPA Lys 101-Leu118\,GPA Ser119-Gln131和C1多肽，这说明当C1达到一定浓度后能激活一种特异性的酶，该酶切断了GPA Leu118-Ser119肽键，使单一的GPA Lys101-Gln131被切成两个肽链，而其它肽链没有激活此酶的作用(结果未发表)。
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讨论
目前的研究表明，膜蛋白之间往往在细胞膜上聚合成复合体或与细胞浆内的蛋白质相互作用。但是关于蛋白质之间相互作用的确切部位及氨基酸顺序所知甚少。带Ⅲ蛋白C-末端尾部对胰蛋白酶具有抵抗性，说明它不是游离地存在于细胞浆内[5]，我们采用不同浓度的NaOH(10～100 mmol/L)处理红细胞膜血影之后，C-末端尾部游离于红细胞表面，在胰蛋白酶作用下，该肽链被切成两断(我们纯化了其中的一个肽链即C1肽链)，并与其它非穿膜部分的肽链一起释放至上清内，C1肽链向上清内释放量在一定范围内随着NaOH浓度的升高而增多。按照我们最初的设想C1肽链具有亲水性，含有大量带负电荷的氨基酸，它可能与细胞浆内的某些蛋白相互作用，从这一想法出发，我们分离纯化了C1-肽链并将不同浓度的C1肽链与未经处理的红细胞血影一起温浴，以期待通过高浓度的C1肽链电荷的吸引，使通过C1肽链结合于细胞膜的蛋白质脱离细胞膜进入上清中来，但从温浴实验后的沉淀(膜)及上清的电泳图谱中，我们没有发现所期待的蛋白质(图3，上清电泳图谱未发表)但一个意外的发现是C1肽链与红细胞内的酶活性有关，从电泳图谱中我们发现随着C1浓度的升高红细胞膜蛋白不断被分解，更为引人注意的是释放至上清中的多肽经HPLC分析可见，当C1浓度在5，10 μmol/L时，HPLC单一的主峰为C1及GPA C末端Lys101-Gln131，而当C1肽链浓度超过30 μmol/L以上时，却有3个主峰出现，经氨基酸测序证明3个主峰分别为C1、GPA Lys101-Leu118和GPA Ser119-Gln131。GPA是存在于红细胞上的由131个氨基酸组成的一次性穿膜蛋白质，其主要功能目前尚不十分清楚，它的C末端位于红细胞内，我们试比较C1和GPA A Lys101-Gln131两条肽链的氨基酸序列：
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带Ⅲ蛋白C1：ATFDEEEGRDEYDEVAMPV
GPA C末端：(RRLIK) KSPSDVKPLPSPDTDVPL ↓ SSVEIENPETSDQ与带Ⅲ蛋白一样，GPA C末端也由大量带正电荷的氨基酸组成，这一事实支持一种可能性，即两者之间在自然状态下可能存在相互作用的关系，所以在低浓度的C1作用时，两者在HPLC图谱中共同形成单一的主峰。当C1肽链浓度超过30 μmol/L以上时，可以激活一种酶，该酶特异地切断GPA Leu118-Ser119肽链，而用其它肽链取代C1肽链做对照没有此现象发生(结果未发表)，经检索未发现有关该酶的任何报道。这种新活性蛋白酶的发现对研究红细胞膜带Ⅲ蛋白C-末端尾部特性及功能乃至红细胞的生理功能具有重要意义。该蛋白酶可能是一种全新氨基酸序列的蛋白质，也可能是一种已知蛋白质但尚未发现其具酶活性，我们将从纯化这种蛋白酶入手对其本质进行深入研究。
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Fig 3 SDS-PAGE of fresh white ghosts prepared from human erythrocyte The fresh white ghosts were pre-incubated with C1 peptide
图3 新鲜人血红细胞血影与不同浓度C1多肽温浴后膜SDS-PAGE电泳图谱
*日本国九州大学医学部临床检查医学讲座
参考文献
1 Hiroyuke Kuma, Kaori Inoue, Guohui Fu.Secondary structure of synthetic peptides corresponding to the first membrane-contact portion of normal band 3 and its deletion mutant (SAO). J Biochem, 1998, 124:509.
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2 Joseph R Casey, Reinhert A F, Reithmeier. Analysis of the oligomeric state of band 3. J Biol Chem 1991, 266:15 726.
3 Akiva M, Kenshi Okubo, Dongchon Kang. A structure study of the carboxyl terminal region of the human erythrocyte band 3 protein. J Biochem, 1995, 118:1192
4 Fu Guohui, Jiang Xiaoshu. Study of the C-terminal properties of human erythrocyte membrane protein band 3(英文稿). 哈尔滨医科大学学报，1998，32：8.
5 Dongchon Kang, Kenshi Okubo, Naotake Hamasaki. A structural study of the membrane domain of band 3 by tryptic digestion. J Biol Chem 1992, 267:19 211.
1998年7月13日收稿，1999年1月13日修回, http://www.100md.com
单位：哈尔滨医科大学病理生理教研室(哈尔滨 150086)
关键词：带3蛋白质；肽类；红细胞
红细胞带 摘 要 目的：研究红细胞带Ⅲ蛋白C1肽链(带Ⅲ蛋白Ala893-Va1911)的特性及其功能。方法：以100 mmol/L NaOH预处理红细胞膜血影，再用胰蛋白酶消化，采用高效液相色谱(HPLC)及氨基酸测序仪分析检定了从红细胞血影中释放的多肽，并纯化了带Ⅲ蛋白C1肽链，以不同浓度的C1肽链与新鲜的红细胞血影进行温浴。结果：C1肽链与红细胞内的新蛋白酶活性有关。
Purification and characterization of C1 peptide released from band 3 protein
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FU Guo-Hui, JIANG Xiao-Shu, WANG Xiao-Ming, Naotaka Hamasaki
Dept. of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin (150086)
Abstract AIM: In order to study the properties of C1 peptide(band 3 Ala893-Va1911).METHODS:The human erythrocyte white ghost were pre-treated by 100 mmol/L NaOH and then digested by trypsin. Using the HPLC and amino acid sequencer, we identified the peptides that released from white ghost, and purified the C1 peptides(band 3 Ala893-Va1911). The C1 peptides were used to incubate with fresh white ghosts.RESULTS:C1 peptides related with a novel protease activity.
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MeSH Band 3 protein; Peptides; Erythrocytes
带Ⅲ蛋白(band 3)是由911个氨基酸组成，分子量约10万的糖蛋白质，它占红细胞膜蛋白质总量的25%[1]，其N-末端为亲水性，参与红细胞的各种生理活动[2]。C-末端为疏水性，预测它14次贯穿红细胞膜的脂质双分子层，这一区域也是C1-/HCO-3离子交换的活性部位[3]。位于红细胞内侧的、由32个氨基酸组成的C末端尾部与跨膜部分不同，其特点是含有大量携带负电荷、具有很强亲水性的氨基酸。这段肽链虽然有两个胰蛋白酶的切断位点，但在一般条件下，胰蛋白酶却不能发挥作用，说明C末端尾部并不像N末端那样游离于细胞浆内，可能与其它蛋白质发生相互作用或以其它形式附着在红细胞膜上[4]。本实验首先检定了在胰蛋白酶作用下从红细胞膜释放的多肽，并从中分离纯化了C1(Ala893-Va1911)肽链，再分别以不同浓度的C1肽链与新鲜红细胞膜血影进行温浴实验，对带Ⅲ蛋白C末端的特性及功能进行初步研究。
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材料与方法
红细胞膜血影的制备：正常人血(4℃ 保存不超过2周)由日本国福冈市红十字中心血站提供，全血用PBS在室温条件下洗4次，然后悬浮于PBS溶液中，向该悬浮液中加入胰蛋白酶(0.2 mg/mL)在37℃条件下消化1 h，以去除红细胞膜表面的蛋白质。消化结束后再用PBS洗红细胞4次，向洗过的红细胞中加入20倍体积的5 mmol/L NaHCO3，使红细胞溶解，并在冰浴条件下搅拌5 min，同时加入蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟(0.2 mg/mL)，溶解后的红细胞在4℃条件下，以12 000×g，在4℃离心30 min，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次，最终以1 mg/mL的蛋白浓度将红细胞血影悬浮在5 mmol/L NaHCO3溶液中[4]。
C1肽键的纯化：取分离制备的红细胞膜血影，向其中加入5倍体积的100 mmol/L NaOH，在冰浴中搅拌15 min，以28 400×g，在4℃离心20 min，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次后，重新悬浮于5 mmol/L NaHCO3溶液中，调蛋白浓度至1.5 mg/mL，向该样品中以15 μg/mL的浓度加入胰蛋白酶，在37℃条件下消化1 h，然后以27 200×g，4℃离心30 min，上清用逆相高效液相色谱技术进行多肽检定，用气相氨基酸测序仪(Applied Biosystems, model 492)测序，回收C1肽链。
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色谱分离的条件：采用逆相色谱柱Cosmosil C-18, 4.6 mm×250 mm，流动相为0～100%线性梯度的乙腈(内含0.1% 三氟乙酸)。
新鲜红细胞膜血影的制备：全血40 mL，用PBS洗4次，然后溶解于5 mmol/L NaHCO3溶液中，用5 mmol/L NaHCO3洗2次，5 mmol/L NaHCO3含0.15 mol/L NaCl洗1次，调蛋白浓度至1 mg/mL。
温浴实验：取纯化的C1肽链，以0、5、10、30、80 μmol/L的浓度分别加入5个试管，冷冻离心干燥后向其中加入新鲜红细胞膜血影，轻轻混均，在37℃温浴1 h后在4℃以15 000×g离心20 min，上清用逆相高效液相色谱进行分析后，有多肽吸收峰的样品进行氨基酸测序。
SDS-PAGE(聚丙烯凝胶电泳)：蛋白分析采用laemmli 1970年报告的方法。蛋白质首先用Lowry法进行定量，然后用9%聚丙烯凝胶进行电泳分析。
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结果
因为红细胞膜在自然状态下，带Ⅲ蛋白的C末端尾部对胰蛋白酶具有抵抗性。因此，我们选择不同浓度NaOH对细胞膜进行了处理，根据从红细胞膜释放C1肽链的多少最终确定100 mmol/L NaOH为最适浓度(图1)。C1肽链的释放以32 min多肽释放量为标准，后者在不同条件下释放量恒定，每一点为3次实验的平均值。图2显示了红细胞膜带Ⅲ蛋白在胰蛋白酶的作用下所释放多肽的HPLC图谱，多肽分析采用逆相色谱柱(Cosmosil C-18,4.6 mm×250 mm)和0～100%线性梯度的乙腈(内含0.1%三氟乙酸)，根据氨基酸测序确定了C1肽链的所在位置，收集C1肽链的样品，再以0.05 mL/min的缓慢流速进行2次HPLC分析，直至获得高纯度的C1多肽样品。
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Fig 1 Effect of NaOH treatment on the amount of C1 peptide released into the supernatant 图1 氢氧化钠对红细胞膜C1肽链释放量的影响
Fig 2 HPLC analyses of membrane peptides released into the supernatant following trypsin treatment 图2 氢氧化钠预处理红细胞膜在胰蛋白酶作用下释放至上清中多肽的HPLC图谱
取C1多肽与新鲜红细胞血影进行温浴实验，经离心获得沉淀(红细胞膜)及上清(释放的多肽)，沉淀的SDS-PAGE图像显示当C1多肽在5、10 μmol/L时与对照实验(0 μmol/L)无差异，在沉淀及上清中均未见蛋白质带的增加或减少，但当C1多肽浓度达到30 μmol/L时，带Ⅲ蛋白及带4.1蛋白被逐渐分解(图3)，我们对温浴的上清进行HPLC分析，结果显示，当C1多肽浓度在5，10 μmol/L时，HPLC图谱为单一的主峰，经氨基酸测序证明该主峰为C1多肽和血型糖蛋白A(GPA)Lys101-Gln131，当C1多肽浓度升至30，80 μmol/L时，HPLC图谱显示了3个主峰，经氨基酸测序证明3个主峰分别为GPA Lys 101-Leu118\,GPA Ser119-Gln131和C1多肽，这说明当C1达到一定浓度后能激活一种特异性的酶，该酶切断了GPA Leu118-Ser119肽键，使单一的GPA Lys101-Gln131被切成两个肽链，而其它肽链没有激活此酶的作用(结果未发表)。
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目前的研究表明，膜蛋白之间往往在细胞膜上聚合成复合体或与细胞浆内的蛋白质相互作用。但是关于蛋白质之间相互作用的确切部位及氨基酸顺序所知甚少。带Ⅲ蛋白C-末端尾部对胰蛋白酶具有抵抗性，说明它不是游离地存在于细胞浆内[5]，我们采用不同浓度的NaOH(10～100 mmol/L)处理红细胞膜血影之后，C-末端尾部游离于红细胞表面，在胰蛋白酶作用下，该肽链被切成两断(我们纯化了其中的一个肽链即C1肽链)，并与其它非穿膜部分的肽链一起释放至上清内，C1肽链向上清内释放量在一定范围内随着NaOH浓度的升高而增多。按照我们最初的设想C1肽链具有亲水性，含有大量带负电荷的氨基酸，它可能与细胞浆内的某些蛋白相互作用，从这一想法出发，我们分离纯化了C1-肽链并将不同浓度的C1肽链与未经处理的红细胞血影一起温浴，以期待通过高浓度的C1肽链电荷的吸引，使通过C1肽链结合于细胞膜的蛋白质脱离细胞膜进入上清中来，但从温浴实验后的沉淀(膜)及上清的电泳图谱中，我们没有发现所期待的蛋白质(图3，上清电泳图谱未发表)但一个意外的发现是C1肽链与红细胞内的酶活性有关，从电泳图谱中我们发现随着C1浓度的升高红细胞膜蛋白不断被分解，更为引人注意的是释放至上清中的多肽经HPLC分析可见，当C1浓度在5，10 μmol/L时，HPLC单一的主峰为C1及GPA C末端Lys101-Gln131，而当C1肽链浓度超过30 μmol/L以上时，却有3个主峰出现，经氨基酸测序证明3个主峰分别为C1、GPA Lys101-Leu118和GPA Ser119-Gln131。GPA是存在于红细胞上的由131个氨基酸组成的一次性穿膜蛋白质，其主要功能目前尚不十分清楚，它的C末端位于红细胞内，我们试比较C1和GPA A Lys101-Gln131两条肽链的氨基酸序列：
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带Ⅲ蛋白C1：ATFDEEEGRDEYDEVAMPV
GPA C末端：(RRLIK) KSPSDVKPLPSPDTDVPL ↓ SSVEIENPETSDQ与带Ⅲ蛋白一样，GPA C末端也由大量带正电荷的氨基酸组成，这一事实支持一种可能性，即两者之间在自然状态下可能存在相互作用的关系，所以在低浓度的C1作用时，两者在HPLC图谱中共同形成单一的主峰。当C1肽链浓度超过30 μmol/L以上时，可以激活一种酶，该酶特异地切断GPA Leu118-Ser119肽链，而用其它肽链取代C1肽链做对照没有此现象发生(结果未发表)，经检索未发现有关该酶的任何报道。这种新活性蛋白酶的发现对研究红细胞膜带Ⅲ蛋白C-末端尾部特性及功能乃至红细胞的生理功能具有重要意义。该蛋白酶可能是一种全新氨基酸序列的蛋白质，也可能是一种已知蛋白质但尚未发现其具酶活性，我们将从纯化这种蛋白酶入手对其本质进行深入研究。
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Fig 3 SDS-PAGE of fresh white ghosts prepared from human erythrocyte The fresh white ghosts were pre-incubated with C1 peptide
图3 新鲜人血红细胞血影与不同浓度C1多肽温浴后膜SDS-PAGE电泳图谱
*日本国九州大学医学部临床检查医学讲座
参考文献
1 Hiroyuke Kuma, Kaori Inoue, Guohui Fu.Secondary structure of synthetic peptides corresponding to the first membrane-contact portion of normal band 3 and its deletion mutant (SAO). J Biochem, 1998, 124:509.
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2 Joseph R Casey, Reinhert A F, Reithmeier. Analysis of the oligomeric state of band 3. J Biol Chem 1991, 266:15 726.
3 Akiva M, Kenshi Okubo, Dongchon Kang. A structure study of the carboxyl terminal region of the human erythrocyte band 3 protein. J Biochem, 1995, 118:1192
4 Fu Guohui, Jiang Xiaoshu. Study of the C-terminal properties of human erythrocyte membrane protein band 3(英文稿). 哈尔滨医科大学学报，1998，32：8.
5 Dongchon Kang, Kenshi Okubo, Naotake Hamasaki. A structural study of the membrane domain of band 3 by tryptic digestion. J Biol Chem 1992, 267:19 211.
1998年7月13日收稿，1999年1月13日修回, http://www.100md.com