冬虫夏草醇提取物对大鼠缺血再灌注过程心肌保护作用研究
作者：刘凤芝 李延平 黄明莉 姜杰玲 谢振华 赵雅君 孙金圣 王孝铭
单位：哈尔滨医科大学病理生理教研室(哈尔滨150086)
关键词：腺嘌呤核苷酸类；心肌再灌注损伤；中草药
冬虫夏草醇提取物对大鼠缺血再灌注过程心肌保护作用研究
摘 要 目的和方法：观察冬虫夏草对缺血再灌注过程心肌保护作用。采用Langendorff非循环式离体心脏灌流方法，与正常对照组、缺血再灌组、刺五加注射液用药组相对比，研究了冬虫夏草醇提取物对大鼠心肌缺血-再灌注过程脂质过氧化产物(MDA)和腺嘌呤核苷酸含量的影响。结果：冬虫夏草醇提取物显著降低了再灌注心肌的MDA水平(P<0.01)及显著提高了心肌中腺嘌呤核苷酸含量(P<0.01)。结论：冬虫夏草可通过改善心肌的能量代谢减少缺血再灌注损伤，对心肌的保护作用明显优于刺五加注射液。
, 百拇医药
The protective effect of Cordyceps Sinensis (Berk) succi on the myocardium during ischemia reperfusion
LIU Feng-Zhi, LI Yan-Ping, HUANG Ming-Li, JINANG Jie-Ling,XIE Zhen-Huan, ZHAO Ya-Jun, SUN Jin-Sheng, WANG Xiao-Ming
Department of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin (150086)
Abstract AIM and METHODS:We adapted the none circulating method perfused rat heart and high performance liquid chromatography technique (HPLC) and compared with the control group, the ischemia reperfusion group and the Acanthopanox Senticosus group, studied the effect of Cordyceps Sinensis (Berk) succi on the content of adenine nucleotides and MDA during ischemia reperfusion. RESULTS：It was shown that adenine nucleotide and total adenine nucleotide pool level increased obviously in the Cordyceps group and the level of MDA in the cardium decreased obviously during ischemia reperfusion (P<0.01). CONCLUSION：Cordyceps can reduce ischemial reperfusion injury by improving cardial energy metabolism and the protective effect of Cordyceps in much better than that of the Acanthopanax Senfi Cosus.
, 百拇医药
MeSH Adenine nucleotides; Myocardial reperfusion injury; Drugs, Chinese herbal
冬虫夏草为我国特有的名贵中药，自古以来为人类治病健身之珍品，现已由人工培养菌丝体产品代替。经临床证明[1]：能明显提高人体的免疫功能，可选择性地作用于心脏有关部位，增强心肌细胞的抗缺氧能力、增加心脏的营养性血流量及降低胆固醇和β脂蛋白作用，但有关冬虫夏草菌丝体的醇提取物在心肌缺血再灌损伤过程对能量代谢及脂质过氧化物的影响尚未见报道。因此本文以过氧化脂质及腺苷酸含量为指标观察了冬虫夏草醇提取物在缺血再灌注过程中，对心肌的保护作用，这对今后临床心血管疾病的防治及新药开发都具有重要意义。
材料与方法
一、主要试剂：
, 百拇医药
AMP、ADP、ATP等各种标准品(Sigma)，刺五加注射液(黑龙江完达山药厂)，冬虫夏草菌粉(白求恩医科大学药厂)，按文献[2]所报道方法，制成含20%生药的水溶液。
二、色谱条件：
日本岛津LC-6A高效液相色谱仪，色谱柱：Hypersi/BDS填料，4.6×150 mm，紫外检测波长210 nm，灵敏度0.46 UFS，流动相组成：215 mmol/L KH2PO4\,2.3 mmol/L硫酸氢四丁胺和3.5%乙腈水溶液，pH 6.25。
三、实验动物及实验步骤：
健康雄性Wistar大鼠(本校肿瘤研究所实验动物室提供)，体重(250±40)g，随机分为4组：对照组(灌流55 min)，缺血再灌(ischemia/reperfusion,I/R)组(预灌15 min、缺血20 min\,再灌20 min)，刺五加+I/R组、虫草+I/R组(同上)，按0.2 mL药液/L KHB液的药量给药100 mL。采用Langendorff离体心脏灌流法造成心脏缺血再灌注模型。灌注结束，立即在-70℃下将心肌冷冻，(1)作高能磷酸化合物含量测定：将左室心肌称重，在0.42 mol/L高氯酸溶液中0～4℃制成匀浆(100 mg/mL)，按100 mg组织加0.35 mL氢氧化钾的量中和后，用超声细胞粉碎器打碎(250 mA超声3 min)使能量物质释放。7 000 r/min离心10 min，上清液用0.25 μm微孔滤膜过滤去杂质，取10 μL注高效液相色谱检测。(2)MDA水平测定，按文献[3]所述方法测定。
, 百拇医药
四、统计学处理：
实验数据采用平均数±标准差(
±s)表示，组间差异显著性采用t检验方法判别。
结果
1.大鼠心肌组织中ATP及总腺苷酸(TAN)含量变化：I/R组含量显著低于对照组(P<0.01)，刺五加(AS)+I/R组显著高于缺血组(P<0.01)，但仍不及对照组水平(P<0.01)。虫草组(CP)+I/R显著高于缺血I/R组及刺五加+I/R组(P<0.01)，与对照组无显著差异，见表1。
2.冬虫夏草醇提取物对大鼠心肌组织中脂质过氧化物(MDA)水平的影响：I/R组MDA水平明显高于对照组(P<0.01)，刺五加+I/R组、虫草+I/R组明显低于I/R组(P<0.01)，虫草+I/R组更优于刺五加+I/R组，见表2。
, 百拇医药
表1 心肌样品中高能磷酸化合物的含量
Tab 1 The content of high energy phosphate compound in myocardium (
±s)
Group
n
ATP
ADP
AMP
TAN
Control
, 百拇医药
6
2.12±0.08
3.77±0.49
1.31±0.29
7.15±0.84
I/R
6
0.74±0.07**
1.81±0.23
0.93±0.36*
3.48±0.42**
, 百拇医药
AS+I/R
6
1.38±0.15*△
2.59±0.58*△
1.15±0.11
5.23±0.59
**△△
CP+I/R
6
2.00±0.13＃＃
3.16±1.04＃＃
, 百拇医药
1.80±0.54＃
7.48±0.53＃＃
*P<0.05，**P<0.01，vs control;△P<0.05，△△P<0.01，vs I/R；＃P<0.05，＃＃P<0.01，vs I/R， or AS+I/R；TAN=ATP+ADP+AMP；AS＝Acanthcpanox;CP=cordyceps 表2 虫草醇提取物对大鼠心肌MDA的影响
Tab 2 The effect of cordyceps on MDA leval in rat myocardium (
±s)
Group
, 百拇医药
n
MDA(nmol/g)
Control
10
43.07±11.32
I/R
8
58.89±9.24**
AS+I/R
9
43.54±9.54＃＃
CP+IR
, http://www.100md.com
6
36.06±7.17＃＃
**P<0.01, vs control; ＃＃P<0.01 vs I/R 讨论
在心血管疾病中，经常发生缺血再灌注损伤，其机制可能是多因素的，但主要环节有三个[4，5]：即能量代谢失常和钙超载、自由基的生成。能量代谢障碍是始动因素，ATP是心肌细胞直接利用的能源物质，其含量变化与心脏功能密切相关；氧自由基可损伤心肌细胞膜，生成脂质过氧化物，是造成缺血再灌注损伤的直接原因。冬虫夏草可使心肌的ATP、ADP、AMP水平显著提高，达正常状态，而刺五加虽然也使ATP含量显著提高，但并不能恢复到无缺血再灌时的水平。虫草使缺血心肌ATP及总腺苷酸显著升高的原因之一可能是由于虫草中含有一些ATP合成的前体物质，使ATP合成的水平通过补救途径迅速提高。
, 百拇医药
据报道，虫草菌粉可明显降低老令大鼠血浆中MDA水平[6]。以及肝组织中MDA水平，本实验进一步证实，冬虫夏草可显著降低缺血再灌心肌的MDA水平。
冬虫夏草对心肌缺血再灌注过程具有较好的自由基清除作用和促使心肌能量代谢物质迅速恢复至正常水平的作用，疗效优于目前临床应用的心血管药物—刺五加注射液，有可能成为今后临床上抗缺血再灌注损伤大有前途的药物。
参考文献
1 刘灿坤.冬虫夏草及虫草菌丝体药理研究近况.山东中医杂志，1991，10(5)：42.
2 楼雅卿，瘳小曼，陆迎春.人工虫草菌丝体醇提物和发酵液的心血管药理研究.中草药，1986，17：17.
3 徐叔云，卡如谦，陈修.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.936.
, 百拇医药
4 Reimer A, Rober B, Tatum H.Pathobiology of acute myocardidal ischemia:metabolic, functional and ultrastructural studies.Am J Cardiol, 1983, 52:72A.
5 Classen J B, Mergner W J, Costa M. ATP hydrolysis ischemic mitochondria.J Cell Physiol, 1989, 141:53.
6 李金生，雷历，刘军.发酵虫草菌对老龄大鼠红细胞超氧化物歧化酶和血浆脂质过氧化物的影响.江西医学院学报，1993，32：1.
1997年8月25日收稿，1998年6月3日修回, 百拇医药
单位：哈尔滨医科大学病理生理教研室(哈尔滨150086)
关键词：腺嘌呤核苷酸类；心肌再灌注损伤；中草药
冬虫夏草醇提取物对大鼠缺血再灌注过程心肌保护作用研究
摘 要 目的和方法：观察冬虫夏草对缺血再灌注过程心肌保护作用。采用Langendorff非循环式离体心脏灌流方法，与正常对照组、缺血再灌组、刺五加注射液用药组相对比，研究了冬虫夏草醇提取物对大鼠心肌缺血-再灌注过程脂质过氧化产物(MDA)和腺嘌呤核苷酸含量的影响。结果：冬虫夏草醇提取物显著降低了再灌注心肌的MDA水平(P<0.01)及显著提高了心肌中腺嘌呤核苷酸含量(P<0.01)。结论：冬虫夏草可通过改善心肌的能量代谢减少缺血再灌注损伤，对心肌的保护作用明显优于刺五加注射液。
, 百拇医药
The protective effect of Cordyceps Sinensis (Berk) succi on the myocardium during ischemia reperfusion
LIU Feng-Zhi, LI Yan-Ping, HUANG Ming-Li, JINANG Jie-Ling,XIE Zhen-Huan, ZHAO Ya-Jun, SUN Jin-Sheng, WANG Xiao-Ming
Department of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin (150086)
Abstract AIM and METHODS:We adapted the none circulating method perfused rat heart and high performance liquid chromatography technique (HPLC) and compared with the control group, the ischemia reperfusion group and the Acanthopanox Senticosus group, studied the effect of Cordyceps Sinensis (Berk) succi on the content of adenine nucleotides and MDA during ischemia reperfusion. RESULTS：It was shown that adenine nucleotide and total adenine nucleotide pool level increased obviously in the Cordyceps group and the level of MDA in the cardium decreased obviously during ischemia reperfusion (P<0.01). CONCLUSION：Cordyceps can reduce ischemial reperfusion injury by improving cardial energy metabolism and the protective effect of Cordyceps in much better than that of the Acanthopanax Senfi Cosus.
, 百拇医药
MeSH Adenine nucleotides; Myocardial reperfusion injury; Drugs, Chinese herbal
冬虫夏草为我国特有的名贵中药，自古以来为人类治病健身之珍品，现已由人工培养菌丝体产品代替。经临床证明[1]：能明显提高人体的免疫功能，可选择性地作用于心脏有关部位，增强心肌细胞的抗缺氧能力、增加心脏的营养性血流量及降低胆固醇和β脂蛋白作用，但有关冬虫夏草菌丝体的醇提取物在心肌缺血再灌损伤过程对能量代谢及脂质过氧化物的影响尚未见报道。因此本文以过氧化脂质及腺苷酸含量为指标观察了冬虫夏草醇提取物在缺血再灌注过程中，对心肌的保护作用，这对今后临床心血管疾病的防治及新药开发都具有重要意义。
材料与方法
一、主要试剂：
, 百拇医药
AMP、ADP、ATP等各种标准品(Sigma)，刺五加注射液(黑龙江完达山药厂)，冬虫夏草菌粉(白求恩医科大学药厂)，按文献[2]所报道方法，制成含20%生药的水溶液。
二、色谱条件：
日本岛津LC-6A高效液相色谱仪，色谱柱：Hypersi/BDS填料，4.6×150 mm，紫外检测波长210 nm，灵敏度0.46 UFS，流动相组成：215 mmol/L KH2PO4\,2.3 mmol/L硫酸氢四丁胺和3.5%乙腈水溶液，pH 6.25。
三、实验动物及实验步骤：
健康雄性Wistar大鼠(本校肿瘤研究所实验动物室提供)，体重(250±40)g，随机分为4组：对照组(灌流55 min)，缺血再灌(ischemia/reperfusion,I/R)组(预灌15 min、缺血20 min\,再灌20 min)，刺五加+I/R组、虫草+I/R组(同上)，按0.2 mL药液/L KHB液的药量给药100 mL。采用Langendorff离体心脏灌流法造成心脏缺血再灌注模型。灌注结束，立即在-70℃下将心肌冷冻，(1)作高能磷酸化合物含量测定：将左室心肌称重，在0.42 mol/L高氯酸溶液中0～4℃制成匀浆(100 mg/mL)，按100 mg组织加0.35 mL氢氧化钾的量中和后，用超声细胞粉碎器打碎(250 mA超声3 min)使能量物质释放。7 000 r/min离心10 min，上清液用0.25 μm微孔滤膜过滤去杂质，取10 μL注高效液相色谱检测。(2)MDA水平测定，按文献[3]所述方法测定。
, 百拇医药
四、统计学处理：
实验数据采用平均数±标准差(
±s)表示，组间差异显著性采用t检验方法判别。结果
1.大鼠心肌组织中ATP及总腺苷酸(TAN)含量变化：I/R组含量显著低于对照组(P<0.01)，刺五加(AS)+I/R组显著高于缺血组(P<0.01)，但仍不及对照组水平(P<0.01)。虫草组(CP)+I/R显著高于缺血I/R组及刺五加+I/R组(P<0.01)，与对照组无显著差异，见表1。
2.冬虫夏草醇提取物对大鼠心肌组织中脂质过氧化物(MDA)水平的影响：I/R组MDA水平明显高于对照组(P<0.01)，刺五加+I/R组、虫草+I/R组明显低于I/R组(P<0.01)，虫草+I/R组更优于刺五加+I/R组，见表2。
, 百拇医药
表1 心肌样品中高能磷酸化合物的含量
Tab 1 The content of high energy phosphate compound in myocardium (
±s)Group
n
ATP
ADP
AMP
TAN
Control
, 百拇医药
6
2.12±0.08
3.77±0.49
1.31±0.29
7.15±0.84
I/R
6
0.74±0.07**
1.81±0.23
0.93±0.36*
3.48±0.42**
, 百拇医药
AS+I/R
6
1.38±0.15*△
2.59±0.58*△
1.15±0.11
5.23±0.59
**△△
CP+I/R
6
2.00±0.13＃＃
3.16±1.04＃＃
, 百拇医药
1.80±0.54＃
7.48±0.53＃＃
*P<0.05，**P<0.01，vs control;△P<0.05，△△P<0.01，vs I/R；＃P<0.05，＃＃P<0.01，vs I/R， or AS+I/R；TAN=ATP+ADP+AMP；AS＝Acanthcpanox;CP=cordyceps 表2 虫草醇提取物对大鼠心肌MDA的影响
Tab 2 The effect of cordyceps on MDA leval in rat myocardium (
±s)Group
, 百拇医药
n
MDA(nmol/g)
Control
10
43.07±11.32
I/R
8
58.89±9.24**
AS+I/R
9
43.54±9.54＃＃
CP+IR
, http://www.100md.com
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**P<0.01, vs control; ＃＃P<0.01 vs I/R 讨论
在心血管疾病中，经常发生缺血再灌注损伤，其机制可能是多因素的，但主要环节有三个[4，5]：即能量代谢失常和钙超载、自由基的生成。能量代谢障碍是始动因素，ATP是心肌细胞直接利用的能源物质，其含量变化与心脏功能密切相关；氧自由基可损伤心肌细胞膜，生成脂质过氧化物，是造成缺血再灌注损伤的直接原因。冬虫夏草可使心肌的ATP、ADP、AMP水平显著提高，达正常状态，而刺五加虽然也使ATP含量显著提高，但并不能恢复到无缺血再灌时的水平。虫草使缺血心肌ATP及总腺苷酸显著升高的原因之一可能是由于虫草中含有一些ATP合成的前体物质，使ATP合成的水平通过补救途径迅速提高。
, 百拇医药
据报道，虫草菌粉可明显降低老令大鼠血浆中MDA水平[6]。以及肝组织中MDA水平，本实验进一步证实，冬虫夏草可显著降低缺血再灌心肌的MDA水平。
冬虫夏草对心肌缺血再灌注过程具有较好的自由基清除作用和促使心肌能量代谢物质迅速恢复至正常水平的作用，疗效优于目前临床应用的心血管药物—刺五加注射液，有可能成为今后临床上抗缺血再灌注损伤大有前途的药物。
参考文献
1 刘灿坤.冬虫夏草及虫草菌丝体药理研究近况.山东中医杂志，1991，10(5)：42.
2 楼雅卿，瘳小曼，陆迎春.人工虫草菌丝体醇提物和发酵液的心血管药理研究.中草药，1986，17：17.
3 徐叔云，卡如谦，陈修.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.936.
, 百拇医药
4 Reimer A, Rober B, Tatum H.Pathobiology of acute myocardidal ischemia:metabolic, functional and ultrastructural studies.Am J Cardiol, 1983, 52:72A.
5 Classen J B, Mergner W J, Costa M. ATP hydrolysis ischemic mitochondria.J Cell Physiol, 1989, 141:53.
6 李金生，雷历，刘军.发酵虫草菌对老龄大鼠红细胞超氧化物歧化酶和血浆脂质过氧化物的影响.江西医学院学报，1993，32：1.
1997年8月25日收稿，1998年6月3日修回, 百拇医药