诱导型一氧化氮合酶在强啡肽致脊髓损伤中的作用*
作者：胡文辉 杨慧芬 强文安 孙秀君 刘 娜 万选才 刘景生 任民峰 李 芳 王国强 肖 剑 廖维宏
单位：杨慧芬 强文安 孙秀君 刘娜 万选才 刘景生 任民峰 中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院(北京 100005)；胡文辉 李芳 王国强 肖剑 廖维宏 第三军医大学大坪医院野战外科研究所
关键词：强啡肽；一氧化氮；脊髓损伤
中国病理生理杂志990308 摘 要 目的：探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在强啡肽致脊髓损伤中的作用。方法：[3H]-左旋精氨酸转化法测定腹侧和背侧脊髓iNOS活性，原位杂交法观测脊髓iNOS mRNA表达及其细胞分布。结果：大鼠蛛网膜下腔注射(InI)强啡肽A1-17(Dyn) 20 nmol引起持久性截瘫和迟发性神经元死亡；在Dyn致瘫后2～3 h iNOS mRNA表达开始增多增强，4 h达高峰，24 h和48 h仍见广泛表达，其分布以胶质细胞和大运动神经元为主；腹侧脊髓iNOS活性在Dyn致瘫后4 h显著升高，并持续至24 h和48 h；提前10 min InI选择性iNOS抑制剂氨基胍1 μmol可显著对抗Dyn 20 nmol引起的持久瘫及伤后4 h腹侧脊髓iNOS活性升高。结论：iNOS持续性高表达与Dyn致脊髓损伤机制有关。
, http://www.100md.com
Increases of inducible nitric oxide synthase activity and mRNA expression in rat spinal cord after dynorphin neurotoxicity
HU Wen-Hui, YANG Hui-Fen, LI Fang, QIANG Wen-An, SUN Xiu-Jun, LIU Na,WAN Xuan-Cai, LIU Jing-Sheng, REN Min-Feng, WANG Guo-Qiang, XIAO Jian, LIAO Wei-Hong
Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing(100005)
, 百拇医药
Abstract AIM:To explore the role of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in dynorphin-induced spinal cord injury. METHODS:The iNOS activities in ventral and dorsal spinal cord were measured with [3 H]-L-Arginine conversion. The iNOS mRAN expression and its cell distribution were detected with in situ hybridization.RESULTS:Intrathecal injection of dynorphin A1-17 (Dyn) 20 nmol induced permant paraplegia and delayed neuronal death.The iNOS mRNA expression began to increase at 2～3 h, peaked at 4 h and remained extensive at 24～48 h after Dyn spinal neurotoxicity, predominantly in glia cells and large motoneurons. The iNOS activities in ventral cord significantly increased at 4 h and persisted up to 24～48 h. Intrathecal pretreatment with aminoguanidine 1 μmol, a selective iNOS inhibitor, 10 min before Dyn 20 nmol significantly ameliorated Dyn-induced neurological outcome and antagonized the increase of iNOS activities at 4 h after Dyn neurotoxicity. CONCLUSION:Persistent high expression of iNOS might be involved in the pathophysiology of dynorphin-induced spinal cord injury.
, 百拇医药
MeSH Dynorphin; Nitric oxide; Spinal cord injuries
蛛网膜下腔注射(intrathecal injection, InI)强啡肽A1-17(dynorphinA1-17,Dyn),在强烈镇痛的同时可导致正常动物的脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)，并可加重SCI动物的损伤程度[1]。关于Dyn致SCI的机制尚不清楚。我们实验室以往工作表明N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体拮抗剂和Ca2+通道阻断剂均能对抗Dyn致瘫，提示NMDA和Ca2+与Dyn致SCl机制有关[2]。一氧化氮(nitric oxide, NO)在神经、免疫和心血管等多个系统中具有广泛而复杂的生理与病理作用[3]，近来引起普遍关注。诱导型NO合酶(inducible NO synthase, iNOS)受基因转录调控，一旦形成则缓慢持久产生大量NO，在免疫、肿瘤和脑缺血等病理过程具有细胞毒性作用[3，4]。我们曾采用NADPH-黄递酶(NADPH-diaphorase, Nd)组化技术首次观察到Dyn致瘫可诱导脊髓腹角细胞表达NOS[5]。本文采用3H-左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)转化及iNOS原位杂交技术观测Dyn致瘫后iNOS活性和mRNA表达，并探讨iNOS选择性抑制剂氨基胍(aminoguanidine, AG)对Dyn致SCI作用的影响。
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材料与方法
(一)动物、手术和药物引入:Wistar 大鼠，雌雄各半，体重(270±15)g，由中日友好临床医学研究所动物室提供。按Yaksh法进行蛛网膜下腔插管[2，6]。给
国家自然科学基金资助(No. 39370786)
药体积10 μL并用生理盐水10 μL冲洗。AG用1 mol/L HCl快速溶解后用0.1 mol/L NaOH调pH至7.4。其余药物均用生理盐水配制。
(二)后肢运动功能测定：根据Faden 8点分级法和Behrmann 5点分级法加以改进[6]。
(三)iNOS活性测定：采用本研究室建立的3H-L-Arg转化法试剂盒测定iNOS活性。
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(四)原位杂交：
常规灌注4%多聚甲醛并维持固定1～2 h。取出T11～S3脊髓于4%多聚甲醛中4℃后固定2～4 h。转至20%～30%蔗糖0.1 mol/L PBS防冻液(原位杂交时需高压消毒)中4℃过夜。以InI尖端为中心，向上向下每0.5 cm为一段，横向切取脊髓。为确保形态学的可比性，根据实验设计，沿脊髓双侧或单侧进行纵行切口，将双切口、单切口和未切口脊髓合为一起进行冰冻切片，厚度为40 μm,按A、B、C、D、E连续收集切片于20%～30%蔗糖液中，4℃存放数天内使用，或-20℃冻存数月内使用。
以Acc I酶切iNOS cDNA质粒，回收684 bp的DNA片段，按地高辛DNA标记与检测试剂盒说明标记探针并检测定量。按以下程序进行飘浮法原位杂交：(1)取出-20℃保存的冰冻切片解冻后，0.1 mol/L PBS 5 min×3～5; (2)0.1 mol/L甘氨酸5 min；(3) 0.4% Triton X-100 15 min(增加膜通透性)；(4)0.1 mol/L PBS 5 min×1～2(消除Triton X-100 对蛋白酶K的影响)；(5)10 g/L蛋白酶K(新鲜配制)37℃ 20～30 min(提高探针穿透性)；(6) 4%多聚甲醛4℃ 5 min(终止蛋白酶K的作用)；(7)0.1 mol/L PBS 5 min×2～3； (8) 0.2 mol/L HCl 10 min(抑制内源性碱性磷酸酶并封闭非特异性结合位点)；(9)2×SSC 10 min(清洗与过渡)；(10)预杂交液(含50%去离子甲酰胺，5×SSC， 10%硫酸葡聚糖，2×Denhardt液，0.5%SDS和0.2 g/L变性鲑精DNA)42～45℃ 1～2 h；(11)杂交液(预杂交液中加入标记探针0.5 mg/L)煮沸10 min骤冷后，取2～3 μL脊髓切片加入Eppendorf管中，盖好后42～45℃ 20 h；(12) 50%甲酰胺/2×SSC 42℃ 15 min×2；(13)50%甲酰胺/0.1×SSC 42℃ 15 min；(14)0.1×SSC 42℃15 min；(15)按试剂盒说明进行NBT呈色。(16)水洗后0.5%铬明胶液中贴片；(17)充分干燥后直接二甲苯透明封片。
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为排除批间误差，全部切片在一批实验中完成。为排除系统误差，对照组与实验组切片在同一Eppendorff管中进行。重要标本进行重复性实验，以验证结果的可靠性。严格设立阴性对照：①杂交前用RNA酶100 U/mL 37℃预处理切片30 min；②杂交液内去除标记探针；③杂交液加入过量的(100倍以上)未标记探针；④以缓冲液Ⅱ代替地高辛抗体。
(五)统计学方法：对运动功能分级资料进行Mann-Whitney U检验。对iNOS活性测定的数据进行单因素方差分析和Newman-Keuls检验以及非配对资料组间双侧t检验。结果以
±s表示。
结果
(一)Dyn对大鼠脊髓功能的影响：在Dyn 10 nmol InI后，11只大鼠中有5只出现一过性瘫(在1 h内恢复至6～7级)，有2只出现持久性瘫痪，24 h内毫无恢复；20 nmol InI后19只大鼠均出现严重瘫痪，其中1只在1 h内恢复至7级，2只在4 h内恢复至6～7级，16只在24 h均无明显恢复(图1)。
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Fig1 Intratheal pretreatment with selective iNOS inhibitor aminoguanidine(AG) 1 μmol significantly antagonized dynorphin A1-17(Dyn) 20 nmol(D20)-induced permanent paraplegia but did not aggravate Dyn 10 nmol(D10)-induced transient paralysis
*P<0.05,**P<0.01, vs D20. Dots represent numbers of animal图1 选择性iNOS抑制剂氨基胍显著对抗强啡肽致瘫
(二)Dyn致瘫后不同时间背侧与腹侧脊髓iNOS活性变化：在InI对照正常大鼠，上清iNOS在背侧与腹侧间无显著差异(图2)。在Dyn 20 nmol致持久瘫后30 min～2 h，iNOS活性在腹侧脊髓均无显著性变化，但在Dyn致瘫后4、24和48 h均显著升高，而背侧的上清iNOS活性在Dyn致瘫后48 h亦显著升高(图2)。我们在预实验中初步观察了Dyn持久瘫后总脊髓的iNOS活性变化，也获得类似结果。正常总脊髓的iNOS活性为(16.83±2.70) pmol.mg-1.min-1(n=5);iNOS活性在2 h无显著变化(19.30±1.47) pmol.mg-1.min-1,n=7),在24 h显著升高至(27.69±4.24) pmol.mg-1.min-1，n=5,P<0.05。
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(三)选择性iNOS抑制剂AG显著对抗Dyn致瘫：提前10 min InI AG 1μmol能明显对抗Dyn 20 nmol引起的持久瘫和神经损伤； 并不加重Dyn 10 nmol引起的过性瘫(图1)。AG 1 μmol不仅明显对抗Dyn 20 nmol 引起的伤后4 h 腹侧iNOS活性升高，而且抑制腹侧与背侧iNOS活性，与InI对照组相比分别低了60.3%和68.7%(图2)。
Fig2 Activities of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the supernatant of ventral (V) and dorsal (D) spinal cords after dynorphin A1-17(Dyn) 20 nmol-induced spinal cord injury and effect of pretreatment with aminoguanidine(AG) 1 μmol
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**P<0.01，#P<0.05,##P<0.01, vs saline control(Con) and Dyn 4 h respectively. Numbrs of animal are shown in parenthese图2 强啡肽致瘫后腹侧与背侧iNOS活性变化及氨基胍的影响
(四)iNOSmRNA表达的细胞定位和损伤反应：在InI对照动物，仅见腹角运动神经元和背核等大神经元及室管膜细胞中度表达iNOS mRNA (图3A)。在Dyn 20 nmol 致瘫后5、10、20、和30min及1 h均见运动神经元和室管膜细胞明显阳性，但与同步的相应对照组(切片放在同一染管中)比较无明显差异，胶质细胞也未见明显阳性。在2～3 h表达开始增多增强，4 h达高峰，分布广泛，以运动神经元、背核、Ⅶ层及室管膜细胞为著，杂交信号表现典型，胶质细胞(尤其在白质)开始表达iNOS mRNA(图3B～C)。在24 h和48 h仍见广泛性强表达，以胶质细胞和/或小神经元(白质和灰质)为主，弥散性分布(图3D)；在有明显中央性坏死的节段，坏死区可见iNOS mRNA阳性细胞，坏死边缘区也见散在的运动神经元和小细胞阳性；在结构完整的节段，仍见广泛性运动神经元和背核、Ⅶ层及室管膜细胞阳性，并有较多小细胞(可能是胶质细胞)。
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Fig 3 Paralyzing dose of dynorphin A1-17 apparently induced extensive expression of iNOS mRNA in rat spinal cord.
A: saline control. B:2 h , C:4 h，D：24 h.BL , DL and BR,DR are magnified from the left and right ventral horn of B and D respectively. Small arrows indicate glia cells. scale bars=100 μm图3 致瘫剂量强啡肽明显诱导大鼠脊髓广泛性表达iNOS mRNA
讨论
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(一) iNOS在Dyn致脊髓损伤中的作用：本文观察到腹侧脊髓iNOS mRNA在Dyn致伤后2 h开始表达，iNOS活性在4 h开始显著升高，并持续24～48 h以上，其时相变化与迟发性神经元死亡的时间颇为一致；联合应用iNOS抑制剂AG可明显抑制iNOS活性，并显著对抗Dyn致瘫；表明iNOS在Dyn致SCI中起重要作用，也提示iNOS表达受基因调控，需要数小时才能完成。最近Hamada等[7]报道大鼠脊髓压迫损伤后24 h脊髓iNOS mRNA表达最明显，认为iNOS在SCI亚急性期(subacute phase)有重要作用。Iadecola等[8]发现脑缺血后12 h iNOS mRNA开始表达，2 d达高峰，iNOS活性在2 d才升高，iNOS抑制剂AG可明显减轻脑缺血损伤。Dyn致伤引起iNOS表达的时间早于脑缺血，其原因尚不清楚，可能与Dyn致伤特点有关。Dyn致SCI后神经元变性死亡和胶质增生反应均较脑缺血为早。
(二)iNOS的细胞来源：在CNS中，有多种细胞具有表达iNOS的潜力。己发现小胶质细胞和血管平滑肌细胞只表达iNOS，星形胶质细胞和血管内皮细胞可表达iNOS和原生型NOS，而神经元不表达iNOS[4]。CNS损伤后表达iNOS的细胞种类，文献报道颇不一致。Wallace发现皮层损伤诱发星形胶质细胞表达Nd。Endoh等[9]报道短暂性全脑缺血诱发星形胶质细胞表达Nd和iNOS-免疫活性。Iadecola等[8]报道持续性脑缺血后梗死边缘区多形核细胞表达iNOS-免疫活性,2 d开始出现，4 d最高，而巨噬细胞、胶质细胞、平滑肌细胞均为iNOS-免疫反应阴性。Schmidt等证明喹啉酸兴奋毒性损伤后5 d的iNOS活性升高，主要来源于活化的星形胶质细胞和小胶质/巨噬细胞。Boje和Hewett等[10]在体外神经元培养中分别证明小胶质细胞和星形胶质细胞iNOS产生的NO与神经元损伤密切相关。本文首次发现Dyn致SCl后大量胶质细胞和神经元表达iNOS mRNA，而且正常脊髓神经元也表达iNOS mRNA。表达iNOS mRNA的胶质细胞是星形还是小胶质细胞，以及神经元表达iNOS mRNA的原因和意义尚待进一步研究。
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参考文献
1 Shukla VK, Lemaire S. Non-opioid effect of dynorphins:Possible role of the NMDA receptor. TiPS, 1994, 15(12):420.
2 陈 彪，田学峰，任民峰.强啡肽A(1-17)致大鼠脊髓损伤.中国药理学与毒理学杂志，1995，9(1)：30.
3 Gross SS, Wolin MS. Nitric oxide:Pathophysiological mechanism. Annu Rev Physiol, 1995,57:737.
4 Ladecola C. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury. TiNS, 1997,20(3):132.
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5 Hu WH, Lee FCH, Wan XST, et al. Dynorhpin neurotoxicity induced nitric oxide synthase expression in ventral horn cells of rat spinal cord. Neurosci Lett, 1996, 203:13.
6 胡文辉，刘 娜，孙秀君，等.L-NAME加重强啡肽致脊髓损伤作用.Chin J Neurosci,1997,4(3):115.
7 Hamada Y, lkata T, Katoh S, et al. Roles of nitric oxide in compression injury of rat spinal cord. Free Radic Biol Med, 1996, 20(1):1.
8 Ladecola C, Zhang F, Xu X. Inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates cerebral ischemic damage. Am J Physiol, 1995, 268:R286.
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9 Endoh M,Maiese K,Pulsinelli WA,et al.Reactive astrocytes express NADPH diaphorase in vivo after transient ischemia.Neurosci Lett,1993,154:125.
10 Hewett SJ,Csernansky CA,Choi DW.Selective potentiation of NMDA-induced neuronal injury following induction of astrocytic iNOS.Neuron,1994,13:487.
1997年7月9日收稿，1998年3月3日修回, http://www.100md.com
单位：杨慧芬 强文安 孙秀君 刘娜 万选才 刘景生 任民峰 中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院(北京 100005)；胡文辉 李芳 王国强 肖剑 廖维宏 第三军医大学大坪医院野战外科研究所
关键词：强啡肽；一氧化氮；脊髓损伤
中国病理生理杂志990308 摘 要 目的：探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在强啡肽致脊髓损伤中的作用。方法：[3H]-左旋精氨酸转化法测定腹侧和背侧脊髓iNOS活性，原位杂交法观测脊髓iNOS mRNA表达及其细胞分布。结果：大鼠蛛网膜下腔注射(InI)强啡肽A1-17(Dyn) 20 nmol引起持久性截瘫和迟发性神经元死亡；在Dyn致瘫后2～3 h iNOS mRNA表达开始增多增强，4 h达高峰，24 h和48 h仍见广泛表达，其分布以胶质细胞和大运动神经元为主；腹侧脊髓iNOS活性在Dyn致瘫后4 h显著升高，并持续至24 h和48 h；提前10 min InI选择性iNOS抑制剂氨基胍1 μmol可显著对抗Dyn 20 nmol引起的持久瘫及伤后4 h腹侧脊髓iNOS活性升高。结论：iNOS持续性高表达与Dyn致脊髓损伤机制有关。
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Increases of inducible nitric oxide synthase activity and mRNA expression in rat spinal cord after dynorphin neurotoxicity
HU Wen-Hui, YANG Hui-Fen, LI Fang, QIANG Wen-An, SUN Xiu-Jun, LIU Na,WAN Xuan-Cai, LIU Jing-Sheng, REN Min-Feng, WANG Guo-Qiang, XIAO Jian, LIAO Wei-Hong
Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing(100005)
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Abstract AIM:To explore the role of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in dynorphin-induced spinal cord injury. METHODS:The iNOS activities in ventral and dorsal spinal cord were measured with [3 H]-L-Arginine conversion. The iNOS mRAN expression and its cell distribution were detected with in situ hybridization.RESULTS:Intrathecal injection of dynorphin A1-17 (Dyn) 20 nmol induced permant paraplegia and delayed neuronal death.The iNOS mRNA expression began to increase at 2～3 h, peaked at 4 h and remained extensive at 24～48 h after Dyn spinal neurotoxicity, predominantly in glia cells and large motoneurons. The iNOS activities in ventral cord significantly increased at 4 h and persisted up to 24～48 h. Intrathecal pretreatment with aminoguanidine 1 μmol, a selective iNOS inhibitor, 10 min before Dyn 20 nmol significantly ameliorated Dyn-induced neurological outcome and antagonized the increase of iNOS activities at 4 h after Dyn neurotoxicity. CONCLUSION:Persistent high expression of iNOS might be involved in the pathophysiology of dynorphin-induced spinal cord injury.
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MeSH Dynorphin; Nitric oxide; Spinal cord injuries
蛛网膜下腔注射(intrathecal injection, InI)强啡肽A1-17(dynorphinA1-17,Dyn),在强烈镇痛的同时可导致正常动物的脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)，并可加重SCI动物的损伤程度[1]。关于Dyn致SCI的机制尚不清楚。我们实验室以往工作表明N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体拮抗剂和Ca2+通道阻断剂均能对抗Dyn致瘫，提示NMDA和Ca2+与Dyn致SCl机制有关[2]。一氧化氮(nitric oxide, NO)在神经、免疫和心血管等多个系统中具有广泛而复杂的生理与病理作用[3]，近来引起普遍关注。诱导型NO合酶(inducible NO synthase, iNOS)受基因转录调控，一旦形成则缓慢持久产生大量NO，在免疫、肿瘤和脑缺血等病理过程具有细胞毒性作用[3，4]。我们曾采用NADPH-黄递酶(NADPH-diaphorase, Nd)组化技术首次观察到Dyn致瘫可诱导脊髓腹角细胞表达NOS[5]。本文采用3H-左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)转化及iNOS原位杂交技术观测Dyn致瘫后iNOS活性和mRNA表达，并探讨iNOS选择性抑制剂氨基胍(aminoguanidine, AG)对Dyn致SCI作用的影响。
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材料与方法
(一)动物、手术和药物引入:Wistar 大鼠，雌雄各半，体重(270±15)g，由中日友好临床医学研究所动物室提供。按Yaksh法进行蛛网膜下腔插管[2，6]。给
国家自然科学基金资助(No. 39370786)
药体积10 μL并用生理盐水10 μL冲洗。AG用1 mol/L HCl快速溶解后用0.1 mol/L NaOH调pH至7.4。其余药物均用生理盐水配制。
(二)后肢运动功能测定：根据Faden 8点分级法和Behrmann 5点分级法加以改进[6]。
(三)iNOS活性测定：采用本研究室建立的3H-L-Arg转化法试剂盒测定iNOS活性。
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(四)原位杂交：
常规灌注4%多聚甲醛并维持固定1～2 h。取出T11～S3脊髓于4%多聚甲醛中4℃后固定2～4 h。转至20%～30%蔗糖0.1 mol/L PBS防冻液(原位杂交时需高压消毒)中4℃过夜。以InI尖端为中心，向上向下每0.5 cm为一段，横向切取脊髓。为确保形态学的可比性，根据实验设计，沿脊髓双侧或单侧进行纵行切口，将双切口、单切口和未切口脊髓合为一起进行冰冻切片，厚度为40 μm,按A、B、C、D、E连续收集切片于20%～30%蔗糖液中，4℃存放数天内使用，或-20℃冻存数月内使用。
以Acc I酶切iNOS cDNA质粒，回收684 bp的DNA片段，按地高辛DNA标记与检测试剂盒说明标记探针并检测定量。按以下程序进行飘浮法原位杂交：(1)取出-20℃保存的冰冻切片解冻后，0.1 mol/L PBS 5 min×3～5; (2)0.1 mol/L甘氨酸5 min；(3) 0.4% Triton X-100 15 min(增加膜通透性)；(4)0.1 mol/L PBS 5 min×1～2(消除Triton X-100 对蛋白酶K的影响)；(5)10 g/L蛋白酶K(新鲜配制)37℃ 20～30 min(提高探针穿透性)；(6) 4%多聚甲醛4℃ 5 min(终止蛋白酶K的作用)；(7)0.1 mol/L PBS 5 min×2～3； (8) 0.2 mol/L HCl 10 min(抑制内源性碱性磷酸酶并封闭非特异性结合位点)；(9)2×SSC 10 min(清洗与过渡)；(10)预杂交液(含50%去离子甲酰胺，5×SSC， 10%硫酸葡聚糖，2×Denhardt液，0.5%SDS和0.2 g/L变性鲑精DNA)42～45℃ 1～2 h；(11)杂交液(预杂交液中加入标记探针0.5 mg/L)煮沸10 min骤冷后，取2～3 μL脊髓切片加入Eppendorf管中，盖好后42～45℃ 20 h；(12) 50%甲酰胺/2×SSC 42℃ 15 min×2；(13)50%甲酰胺/0.1×SSC 42℃ 15 min；(14)0.1×SSC 42℃15 min；(15)按试剂盒说明进行NBT呈色。(16)水洗后0.5%铬明胶液中贴片；(17)充分干燥后直接二甲苯透明封片。
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为排除批间误差，全部切片在一批实验中完成。为排除系统误差，对照组与实验组切片在同一Eppendorff管中进行。重要标本进行重复性实验，以验证结果的可靠性。严格设立阴性对照：①杂交前用RNA酶100 U/mL 37℃预处理切片30 min；②杂交液内去除标记探针；③杂交液加入过量的(100倍以上)未标记探针；④以缓冲液Ⅱ代替地高辛抗体。
(五)统计学方法：对运动功能分级资料进行Mann-Whitney U检验。对iNOS活性测定的数据进行单因素方差分析和Newman-Keuls检验以及非配对资料组间双侧t检验。结果以
±s表示。结果
(一)Dyn对大鼠脊髓功能的影响：在Dyn 10 nmol InI后，11只大鼠中有5只出现一过性瘫(在1 h内恢复至6～7级)，有2只出现持久性瘫痪，24 h内毫无恢复；20 nmol InI后19只大鼠均出现严重瘫痪，其中1只在1 h内恢复至7级，2只在4 h内恢复至6～7级，16只在24 h均无明显恢复(图1)。
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Fig1 Intratheal pretreatment with selective iNOS inhibitor aminoguanidine(AG) 1 μmol significantly antagonized dynorphin A1-17(Dyn) 20 nmol(D20)-induced permanent paraplegia but did not aggravate Dyn 10 nmol(D10)-induced transient paralysis
*P<0.05,**P<0.01, vs D20. Dots represent numbers of animal图1 选择性iNOS抑制剂氨基胍显著对抗强啡肽致瘫
(二)Dyn致瘫后不同时间背侧与腹侧脊髓iNOS活性变化：在InI对照正常大鼠，上清iNOS在背侧与腹侧间无显著差异(图2)。在Dyn 20 nmol致持久瘫后30 min～2 h，iNOS活性在腹侧脊髓均无显著性变化，但在Dyn致瘫后4、24和48 h均显著升高，而背侧的上清iNOS活性在Dyn致瘫后48 h亦显著升高(图2)。我们在预实验中初步观察了Dyn持久瘫后总脊髓的iNOS活性变化，也获得类似结果。正常总脊髓的iNOS活性为(16.83±2.70) pmol.mg-1.min-1(n=5);iNOS活性在2 h无显著变化(19.30±1.47) pmol.mg-1.min-1,n=7),在24 h显著升高至(27.69±4.24) pmol.mg-1.min-1，n=5,P<0.05。
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(三)选择性iNOS抑制剂AG显著对抗Dyn致瘫：提前10 min InI AG 1μmol能明显对抗Dyn 20 nmol引起的持久瘫和神经损伤； 并不加重Dyn 10 nmol引起的过性瘫(图1)。AG 1 μmol不仅明显对抗Dyn 20 nmol 引起的伤后4 h 腹侧iNOS活性升高，而且抑制腹侧与背侧iNOS活性，与InI对照组相比分别低了60.3%和68.7%(图2)。
Fig2 Activities of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the supernatant of ventral (V) and dorsal (D) spinal cords after dynorphin A1-17(Dyn) 20 nmol-induced spinal cord injury and effect of pretreatment with aminoguanidine(AG) 1 μmol
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**P<0.01，#P<0.05,##P<0.01, vs saline control(Con) and Dyn 4 h respectively. Numbrs of animal are shown in parenthese图2 强啡肽致瘫后腹侧与背侧iNOS活性变化及氨基胍的影响
(四)iNOSmRNA表达的细胞定位和损伤反应：在InI对照动物，仅见腹角运动神经元和背核等大神经元及室管膜细胞中度表达iNOS mRNA (图3A)。在Dyn 20 nmol 致瘫后5、10、20、和30min及1 h均见运动神经元和室管膜细胞明显阳性，但与同步的相应对照组(切片放在同一染管中)比较无明显差异，胶质细胞也未见明显阳性。在2～3 h表达开始增多增强，4 h达高峰，分布广泛，以运动神经元、背核、Ⅶ层及室管膜细胞为著，杂交信号表现典型，胶质细胞(尤其在白质)开始表达iNOS mRNA(图3B～C)。在24 h和48 h仍见广泛性强表达，以胶质细胞和/或小神经元(白质和灰质)为主，弥散性分布(图3D)；在有明显中央性坏死的节段，坏死区可见iNOS mRNA阳性细胞，坏死边缘区也见散在的运动神经元和小细胞阳性；在结构完整的节段，仍见广泛性运动神经元和背核、Ⅶ层及室管膜细胞阳性，并有较多小细胞(可能是胶质细胞)。
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Fig 3 Paralyzing dose of dynorphin A1-17 apparently induced extensive expression of iNOS mRNA in rat spinal cord.
A: saline control. B:2 h , C:4 h，D：24 h.BL , DL and BR,DR are magnified from the left and right ventral horn of B and D respectively. Small arrows indicate glia cells. scale bars=100 μm图3 致瘫剂量强啡肽明显诱导大鼠脊髓广泛性表达iNOS mRNA
讨论
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(一) iNOS在Dyn致脊髓损伤中的作用：本文观察到腹侧脊髓iNOS mRNA在Dyn致伤后2 h开始表达，iNOS活性在4 h开始显著升高，并持续24～48 h以上，其时相变化与迟发性神经元死亡的时间颇为一致；联合应用iNOS抑制剂AG可明显抑制iNOS活性，并显著对抗Dyn致瘫；表明iNOS在Dyn致SCI中起重要作用，也提示iNOS表达受基因调控，需要数小时才能完成。最近Hamada等[7]报道大鼠脊髓压迫损伤后24 h脊髓iNOS mRNA表达最明显，认为iNOS在SCI亚急性期(subacute phase)有重要作用。Iadecola等[8]发现脑缺血后12 h iNOS mRNA开始表达，2 d达高峰，iNOS活性在2 d才升高，iNOS抑制剂AG可明显减轻脑缺血损伤。Dyn致伤引起iNOS表达的时间早于脑缺血，其原因尚不清楚，可能与Dyn致伤特点有关。Dyn致SCI后神经元变性死亡和胶质增生反应均较脑缺血为早。
(二)iNOS的细胞来源：在CNS中，有多种细胞具有表达iNOS的潜力。己发现小胶质细胞和血管平滑肌细胞只表达iNOS，星形胶质细胞和血管内皮细胞可表达iNOS和原生型NOS，而神经元不表达iNOS[4]。CNS损伤后表达iNOS的细胞种类，文献报道颇不一致。Wallace发现皮层损伤诱发星形胶质细胞表达Nd。Endoh等[9]报道短暂性全脑缺血诱发星形胶质细胞表达Nd和iNOS-免疫活性。Iadecola等[8]报道持续性脑缺血后梗死边缘区多形核细胞表达iNOS-免疫活性,2 d开始出现，4 d最高，而巨噬细胞、胶质细胞、平滑肌细胞均为iNOS-免疫反应阴性。Schmidt等证明喹啉酸兴奋毒性损伤后5 d的iNOS活性升高，主要来源于活化的星形胶质细胞和小胶质/巨噬细胞。Boje和Hewett等[10]在体外神经元培养中分别证明小胶质细胞和星形胶质细胞iNOS产生的NO与神经元损伤密切相关。本文首次发现Dyn致SCl后大量胶质细胞和神经元表达iNOS mRNA，而且正常脊髓神经元也表达iNOS mRNA。表达iNOS mRNA的胶质细胞是星形还是小胶质细胞，以及神经元表达iNOS mRNA的原因和意义尚待进一步研究。
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参考文献
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1997年7月9日收稿，1998年3月3日修回, http://www.100md.com