ConA诱导小鼠脾淋巴细胞上清对下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响
作者：张萃 柳忠辉
单位：张萃 广东药学院微生物与免疫学教研室(广州 510224)；柳忠辉 白求恩医科大学免疫学教研室
关键词：伴刀豆球蛋白A；下丘脑；垂体；肾上腺
ConA诱导小鼠脾淋巴细胞上清对下丘脑 摘 要 目的：探讨免疫对神经内分泌系统的上行调节通路。方法：采用ConA诱导淋巴细胞培养上清液给小鼠腹腔注射，测定不同时间(0.5，1，2，4，6 h)的小鼠血浆中CRH，ACTH，皮质酮(CORT)产生的动力学，同时在体外用ConA诱导上清液分别与下丘脑，垂体，肾上腺组织共同培养后观察CRH，ACTH，CORT分泌情况。结果：在体内ConA诱导上清可在2 h内明显促进CRH，ACTH和CORT的产生(P<0.05)。体外培养6 h可明显增加CRH分泌，16 h时ACTH和CORT明显增加(P<0.05)。结论：ConA诱导上清可在下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)三个不同的层次上进行调节。
, 百拇医药
Effects of supernatants induced by ConA on hypothalamo-pituitary-adrenal axis
ZHANG Cui,LIU Zhong-Hui
Department of Microbiology,Guangdong College of Pharmacy,Guangzhou(510224)Department of Immunology,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun(130021)
Abstract AIM：In order to investigate the regulation of neuro-endocrine system up-pathway by immunity.METHODS：the supernatants of cultured spleen's lymphocytes induced by ConA were injected into mice peritoneally，kinetics of plasma corticotropin releasing hormone(CRH),adrenocorticotropic hormone(ACTH) and corticosterone(CORT) in mice were tested at different time (0.5,1,2,4,6 h),or tissue of hypothalamus pituitarium or adrenal was stimulated with supernatants induced by ConA,and the secretion of CRH, ACTH and CORT were observed.RESULTS：Supernatants induced by ConA significantly increased the production of CRH, ACTH and CORT in vivo at 2 h(P<0.05). In vitro,experiment CRH highly increased at 6 h, ACTH and CORT significantly increased at 16 h(P<0.05).CONCLUSION：Supernatant of splenocyts induced by ConA regulated at all three levels of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis.
, 百拇医药
MeSH Concanavalin A; Hypothalamus;Pituitary gland; Adrenal gland
免疫系统与神经内分泌系统的相互调节机制较复杂，介导两大系统相互作用的共同介质为神经肽类，细胞因子和相应的受体[1，2]。为了测定免疫产物对下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamo-pituitary-adrenal axis,HPAA)的作用，采用ConA诱导上清进行体内和体外实验，分别在下丘脑、垂体、肾上腺3个层次上检测促肾上腺皮质释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH),促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)和皮质酮(corticosterone,CORT)分泌量的变化。
材料与方法
一、动物：
, http://www.100md.com
Swiss小鼠，雌性，体重(20±2) g，4周龄，由本院动物室提供。
二、试剂：
刀豆蛋白(ConA)，Sigma公司产品。培养液(IMDM)，美国GIBCO产品。小牛血清，长春生物制品所产品，标准CRH，ACTH，美国Sigma公司产品。[Na125I]，中国原子能研究所。[3H]-皮质酮，上海核技术开发公司。标准皮质酮，荷兰Orgnon公司产品。
三、方法：
1.ConA诱导上清制备及血浆收集：取已用人红细胞免疫5 d的小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液，用ConA刺激(5 μg/mL)40 h收集上清，并给小鼠腹腔注射，每只0.5 mL(实验组)：对照组为无ConA上清，加上ConA 5 μg/mL,同时设生理盐水(NS)对照，剂量与途径同实验组：每组5只，取注射后0.5，1，2，4，6 h的小鼠血浆0.1 mL备用。
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2.ConA诱导上清体外作用：取1：40稀释ConA诱导上清分别与小鼠下丘脑，垂体，肾上腺组织共同培养，同时用培养液(IMDM)做阴性对照，不同组织分别设rIL-6,CRH,ACTH做阳性对照。观察培养后2，4，6，8，16，20 h培养上清中CRH，ACTH，CORT分泌含量。
3.CRH，ACTH，CORT检测 CRH含量放射免疫测定法，参考[3]；ACTH含量放射免疫测定法，参考[4]；CORT含量检测，利用大鼠血浆竞争性蛋白结合分析法测定小鼠血浆皮质酮[5]。
结果
一、体内ConA诱导上清对CRH，ACTH和CORT产生的影响：
结果表明，小鼠腹腔注射上清后，实验组血浆CRH，ACTH，CORT在1 h明显高于对照组，2 h达峰值，4 h低于2 h,峰值处与对照组相比差异有显著性(P<0.05)(图1)。
, 百拇医药
Fig 1 Effect of intraperitoneal injection by ConA induced supernatants on CRH,ACTH and CORT level
图1 体内ConA诱导上清对CRH，ACTH和CORT产生影响
二、体外ConA诱导上清对CRH，ACTH和CORT分泌的影响：
1.ConA诱导上清对下丘脑CRH分泌的影响 结果表明，ConA诱导上清在体外可直接刺激下丘脑组织分泌CRH，6 h时CRH的分泌量明显大于对照组，与阴性对照相比差异有显著(P<0.05)(表1)。
表1 ConA诱导上清对下丘脑分泌CRH的影响
Tab 1 Effects of ConA induced supernatants on secretion of hypothalamus tissue CRH(
±s，ng/L)
, http://www.100md.com
Control
IL-6(2000 U/L)
Supernatants(1:40)
CRH(6 h)
75±25
402±57*
425±308
(16 h)
80±25
506±50*
430±40*
, http://www.100md.com
*P<0.05， vs control
2.ConA诱导上清对垂体ACTH分泌的影响 ConA诱导上清刺激垂体组织ACTH分泌量在16 h时明显高于对照组，与阴性对照组相比差异有显著(P<0.05)(表2)。
表2 ConA诱导上清对垂体分泌ACTH的影响
Tab 2 Effects of ConA induced supernatants on secretion of pituitarium tissue ACTH(
±s,ng/L)
Control
, http://www.100md.com CRH
(5 μg/L)
IL-6
(2000U/L)
Supernatants
(1:40)
ACTH(6 h)
87±20
284±20*
85±11
92±7
(16 h)
, http://www.100md.com
90±24
320±30*
304±30*
278±50*
*P<0.05， vs control
3.ConA诱导上清对肾上腺CORT分泌的影响 肾上腺组织CORT分泌量及时程与ACTH平行。与阴性对照相比差异均有显著(P<0.05)(表3)。
表3 ConA诱导上清对肾上腺分泌CORT的影响
Tab 3 Effects of ConA induced supernatants on secretion of adrenal tissue CORT(
±s,μg/L)
, 百拇医药
Control
ACTH
(5 μg/L)
IL-6
(2000U/L)
Supernatants
(1:40)
CORT(6 h)
0.5±0.03
1.6±0.3*
0.6±0.1
0.7±0.1
, 百拇医药
(16 h)
0.6±0.04
2.0±0.25*
2.9±0.18
2.4±0.3*
*P<0.05， vs control 讨论
神经内分泌系统在感受精神和躯体的刺激下，可导致HPAA的激活，而免疫系统可感受肿瘤，病毒，毒素等抗原刺激，在免疫应答过程中同样存在HPAA的激活[6]，由于该两大系统是机体的两大感觉和调节系统，共同维持机体的生理和病理平衡状态，而二者相互作用的介导物质如何，我们在以往实验基础上作了初步探讨。
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细胞因子在HPAA激活中起到重要的作用，而ConA诱导上清中含有混合细胞因子，在体内可使CRH，ACTH，CORT于2 h分泌达高峰，本实验结果证实了细胞因子对HPAA的影响，与文献报道相符[7]。另外，体外实验亦表明，ConA诱导上清可在不同层次上直接刺激下丘脑，垂体和肾上腺组织分泌神经肽类和皮质酮，当ConA诱导上清刺激下丘脑组织6 h时CRH分泌量，与rIL-6刺激相比结果相近；而上清液刺激垂体，肾上腺组织16 h时，ACTH，CORT分泌量明显增加，与所设的CRH，ACTH及rIL-6阳性对照组结果相似，本实验结果提示细胞因子对不同组织的影响有时程差异。
在以前的实验中我们亦测定过上清液中的细胞因子主要有IL-1，IL-2，IL-6[6]。据文献报道IL-1作为免疫细胞产生的可溶性免疫反应产物，可作用下丘脑，具有CRH样作用，给大鼠腹腔注射IL-1后，下丘脑CRH mRNA增高，IL-1不仅可以作用下丘脑水平，也可以作用垂体，促进ACTH等激素的分泌[8]。除此之外，IL-6作用HPAA的机理与IL-1相似，而IL-2，TNF可直接作用垂体水平使ACTH分泌，当然上清中免疫产物不仅是细胞因子，也可能包含免疫源性神经肽类激素及其他物质，免疫系统除作用HPAA外，体内还存在淋巴-肾上腺轴。本实验中上清液在体内对HPAA的影响并不象体外实验对不同组织作用有时程差异，这可能是上清中含有的混合免疫产物共同作用的结果，在体内HPAA的活化所导致的CRH，ACTH和CORT的连锁变化可在极短时间内完成，当体内糖皮质激素增高后又可反馈调节免疫系统，构成神经内分泌免疫调节网络，总之，网络调节机理相当复杂，本实验只是初步探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 Blalook JE.The syntax of immune-neuroendocrine communication. Immunol today,1994,15:504.
2 范少光，丁桂风.神经内分泌与免疫系统之间相互作用的介导物质：共用的生物学语言.生理科学进展，1995，26(2)：175.
3 柳忠辉，杨贵贞.CRF放射免疫测定法的建立.中国免疫学杂志，1991，7：4.
4 黄兆坚，汪寅章，陆思珍，等.人血浆ACTH放射免疫分析及临床应用.中华内分泌代谢杂志，1986，2：209.
5 张铭，李风兰.一种方便适用的皮质酮测定法.白求恩医科大学学报，1986；12：340.
6 张萃，杨贵贞.HRBC免疫应答所致下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活.中国免疫学杂志，1992，6：347.
7 井村裕夫.内分泌系にぉけゐサィトカィンの役割.ホルモンと临床，1992，40(2)：(103)1.
8 深田顺一.ィンタ-ロィキンによゐ下垂体-副肾系ヘの刺激作用.医学のぁゅみ，1992，3：599.
1997年8月18日收稿，1998年3月3日修回, 百拇医药
单位：张萃 广东药学院微生物与免疫学教研室(广州 510224)；柳忠辉 白求恩医科大学免疫学教研室
关键词：伴刀豆球蛋白A；下丘脑；垂体；肾上腺
ConA诱导小鼠脾淋巴细胞上清对下丘脑 摘 要 目的：探讨免疫对神经内分泌系统的上行调节通路。方法：采用ConA诱导淋巴细胞培养上清液给小鼠腹腔注射，测定不同时间(0.5，1，2，4，6 h)的小鼠血浆中CRH，ACTH，皮质酮(CORT)产生的动力学，同时在体外用ConA诱导上清液分别与下丘脑，垂体，肾上腺组织共同培养后观察CRH，ACTH，CORT分泌情况。结果：在体内ConA诱导上清可在2 h内明显促进CRH，ACTH和CORT的产生(P<0.05)。体外培养6 h可明显增加CRH分泌，16 h时ACTH和CORT明显增加(P<0.05)。结论：ConA诱导上清可在下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)三个不同的层次上进行调节。
, 百拇医药
Effects of supernatants induced by ConA on hypothalamo-pituitary-adrenal axis
ZHANG Cui,LIU Zhong-Hui
Department of Microbiology,Guangdong College of Pharmacy,Guangzhou(510224)Department of Immunology,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun(130021)
Abstract AIM：In order to investigate the regulation of neuro-endocrine system up-pathway by immunity.METHODS：the supernatants of cultured spleen's lymphocytes induced by ConA were injected into mice peritoneally，kinetics of plasma corticotropin releasing hormone(CRH),adrenocorticotropic hormone(ACTH) and corticosterone(CORT) in mice were tested at different time (0.5,1,2,4,6 h),or tissue of hypothalamus pituitarium or adrenal was stimulated with supernatants induced by ConA,and the secretion of CRH, ACTH and CORT were observed.RESULTS：Supernatants induced by ConA significantly increased the production of CRH, ACTH and CORT in vivo at 2 h(P<0.05). In vitro,experiment CRH highly increased at 6 h, ACTH and CORT significantly increased at 16 h(P<0.05).CONCLUSION：Supernatant of splenocyts induced by ConA regulated at all three levels of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis.
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MeSH Concanavalin A; Hypothalamus;Pituitary gland; Adrenal gland
免疫系统与神经内分泌系统的相互调节机制较复杂，介导两大系统相互作用的共同介质为神经肽类，细胞因子和相应的受体[1，2]。为了测定免疫产物对下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamo-pituitary-adrenal axis,HPAA)的作用，采用ConA诱导上清进行体内和体外实验，分别在下丘脑、垂体、肾上腺3个层次上检测促肾上腺皮质释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH),促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)和皮质酮(corticosterone,CORT)分泌量的变化。
材料与方法
一、动物：
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Swiss小鼠，雌性，体重(20±2) g，4周龄，由本院动物室提供。
二、试剂：
刀豆蛋白(ConA)，Sigma公司产品。培养液(IMDM)，美国GIBCO产品。小牛血清，长春生物制品所产品，标准CRH，ACTH，美国Sigma公司产品。[Na125I]，中国原子能研究所。[3H]-皮质酮，上海核技术开发公司。标准皮质酮，荷兰Orgnon公司产品。
三、方法：
1.ConA诱导上清制备及血浆收集：取已用人红细胞免疫5 d的小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液，用ConA刺激(5 μg/mL)40 h收集上清，并给小鼠腹腔注射，每只0.5 mL(实验组)：对照组为无ConA上清，加上ConA 5 μg/mL,同时设生理盐水(NS)对照，剂量与途径同实验组：每组5只，取注射后0.5，1，2，4，6 h的小鼠血浆0.1 mL备用。
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2.ConA诱导上清体外作用：取1：40稀释ConA诱导上清分别与小鼠下丘脑，垂体，肾上腺组织共同培养，同时用培养液(IMDM)做阴性对照，不同组织分别设rIL-6,CRH,ACTH做阳性对照。观察培养后2，4，6，8，16，20 h培养上清中CRH，ACTH，CORT分泌含量。
3.CRH，ACTH，CORT检测 CRH含量放射免疫测定法，参考[3]；ACTH含量放射免疫测定法，参考[4]；CORT含量检测，利用大鼠血浆竞争性蛋白结合分析法测定小鼠血浆皮质酮[5]。
结果
一、体内ConA诱导上清对CRH，ACTH和CORT产生的影响：
结果表明，小鼠腹腔注射上清后，实验组血浆CRH，ACTH，CORT在1 h明显高于对照组，2 h达峰值，4 h低于2 h,峰值处与对照组相比差异有显著性(P<0.05)(图1)。
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Fig 1 Effect of intraperitoneal injection by ConA induced supernatants on CRH,ACTH and CORT level
图1 体内ConA诱导上清对CRH，ACTH和CORT产生影响
二、体外ConA诱导上清对CRH，ACTH和CORT分泌的影响：
1.ConA诱导上清对下丘脑CRH分泌的影响 结果表明，ConA诱导上清在体外可直接刺激下丘脑组织分泌CRH，6 h时CRH的分泌量明显大于对照组，与阴性对照相比差异有显著(P<0.05)(表1)。
表1 ConA诱导上清对下丘脑分泌CRH的影响
Tab 1 Effects of ConA induced supernatants on secretion of hypothalamus tissue CRH(
±s，ng/L), http://www.100md.com
Control
IL-6(2000 U/L)
Supernatants(1:40)
CRH(6 h)
75±25
402±57*
425±308
(16 h)
80±25
506±50*
430±40*
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*P<0.05， vs control
2.ConA诱导上清对垂体ACTH分泌的影响 ConA诱导上清刺激垂体组织ACTH分泌量在16 h时明显高于对照组，与阴性对照组相比差异有显著(P<0.05)(表2)。
表2 ConA诱导上清对垂体分泌ACTH的影响
Tab 2 Effects of ConA induced supernatants on secretion of pituitarium tissue ACTH(
±s,ng/L)Control
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(5 μg/L)
IL-6
(2000U/L)
Supernatants
(1:40)
ACTH(6 h)
87±20
284±20*
85±11
92±7
(16 h)
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90±24
320±30*
304±30*
278±50*
*P<0.05， vs control
3.ConA诱导上清对肾上腺CORT分泌的影响 肾上腺组织CORT分泌量及时程与ACTH平行。与阴性对照相比差异均有显著(P<0.05)(表3)。
表3 ConA诱导上清对肾上腺分泌CORT的影响
Tab 3 Effects of ConA induced supernatants on secretion of adrenal tissue CORT(
±s,μg/L), 百拇医药
Control
ACTH
(5 μg/L)
IL-6
(2000U/L)
Supernatants
(1:40)
CORT(6 h)
0.5±0.03
1.6±0.3*
0.6±0.1
0.7±0.1
, 百拇医药
(16 h)
0.6±0.04
2.0±0.25*
2.9±0.18
2.4±0.3*
*P<0.05， vs control 讨论
神经内分泌系统在感受精神和躯体的刺激下，可导致HPAA的激活，而免疫系统可感受肿瘤，病毒，毒素等抗原刺激，在免疫应答过程中同样存在HPAA的激活[6]，由于该两大系统是机体的两大感觉和调节系统，共同维持机体的生理和病理平衡状态，而二者相互作用的介导物质如何，我们在以往实验基础上作了初步探讨。
, http://www.100md.com
细胞因子在HPAA激活中起到重要的作用，而ConA诱导上清中含有混合细胞因子，在体内可使CRH，ACTH，CORT于2 h分泌达高峰，本实验结果证实了细胞因子对HPAA的影响，与文献报道相符[7]。另外，体外实验亦表明，ConA诱导上清可在不同层次上直接刺激下丘脑，垂体和肾上腺组织分泌神经肽类和皮质酮，当ConA诱导上清刺激下丘脑组织6 h时CRH分泌量，与rIL-6刺激相比结果相近；而上清液刺激垂体，肾上腺组织16 h时，ACTH，CORT分泌量明显增加，与所设的CRH，ACTH及rIL-6阳性对照组结果相似，本实验结果提示细胞因子对不同组织的影响有时程差异。
在以前的实验中我们亦测定过上清液中的细胞因子主要有IL-1，IL-2，IL-6[6]。据文献报道IL-1作为免疫细胞产生的可溶性免疫反应产物，可作用下丘脑，具有CRH样作用，给大鼠腹腔注射IL-1后，下丘脑CRH mRNA增高，IL-1不仅可以作用下丘脑水平，也可以作用垂体，促进ACTH等激素的分泌[8]。除此之外，IL-6作用HPAA的机理与IL-1相似，而IL-2，TNF可直接作用垂体水平使ACTH分泌，当然上清中免疫产物不仅是细胞因子，也可能包含免疫源性神经肽类激素及其他物质，免疫系统除作用HPAA外，体内还存在淋巴-肾上腺轴。本实验中上清液在体内对HPAA的影响并不象体外实验对不同组织作用有时程差异，这可能是上清中含有的混合免疫产物共同作用的结果，在体内HPAA的活化所导致的CRH，ACTH和CORT的连锁变化可在极短时间内完成，当体内糖皮质激素增高后又可反馈调节免疫系统，构成神经内分泌免疫调节网络，总之，网络调节机理相当复杂，本实验只是初步探讨。
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参考文献
1 Blalook JE.The syntax of immune-neuroendocrine communication. Immunol today,1994,15:504.
2 范少光，丁桂风.神经内分泌与免疫系统之间相互作用的介导物质：共用的生物学语言.生理科学进展，1995，26(2)：175.
3 柳忠辉，杨贵贞.CRF放射免疫测定法的建立.中国免疫学杂志，1991，7：4.
4 黄兆坚，汪寅章，陆思珍，等.人血浆ACTH放射免疫分析及临床应用.中华内分泌代谢杂志，1986，2：209.
5 张铭，李风兰.一种方便适用的皮质酮测定法.白求恩医科大学学报，1986；12：340.
6 张萃，杨贵贞.HRBC免疫应答所致下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活.中国免疫学杂志，1992，6：347.
7 井村裕夫.内分泌系にぉけゐサィトカィンの役割.ホルモンと临床，1992，40(2)：(103)1.
8 深田顺一.ィンタ-ロィキンによゐ下垂体-副肾系ヘの刺激作用.医学のぁゅみ，1992，3：599.
1997年8月18日收稿，1998年3月3日修回, 百拇医药