右甲吗喃对脑缺血的实验治疗研究*
作者：庞懿 李麟仙 王子灿
单位：昆明医学院病理生理教研室(昆明650031)
关键词：神经元；死亡；脑缺血；鼠科
右甲吗喃对脑缺血的实验治疗研究 摘 要 目的和方法：在沙土鼠通过夹闭双侧颈总动脉复制短暂性脑缺血神经元迟发性坏死，以海马CA1区神经元坏死为指标；在大鼠采用凝闭大脑中动脉复制局部脑缺血，以缺血区脑组织钠、水、钙含量及梗塞面积为指标；观察非竞争性、低亲和力兴奋性氨基酸拮抗剂右甲吗喃对抗脑缺血的作用。结果：右甲吗喃能提高沙土鼠脑缺血后海马CA1区神经元存活数；能降低大鼠大脑中动脉闭塞后缺血区水、钠及钙含量，缩小梗塞面积。结论：右甲吗喃能减轻脑缺血后神经元死亡(即凋亡)；并通过减轻脑水肿，缩小梗塞面积，改善大鼠局部脑缺血时缺血性脑损伤。
The neuroprotective effects of dextromethorphan on experimental cerebral ischemia
, http://www.100md.com
PANG Yi, LI Lin-Xian, WANG Zi-Can
Department of Pathophysiology, Kunming Medical College, Kunming (650031)
Abstract AIM：The present study explores the neuroprotective action of a noncompetitive low affnity excitatory amino acid antagonist,dextromethorphan(DM) in cerebral ischemia.METHODS:The neuroprotective effect of dextromethorphan was assessed by measuring the density of hippocampal neuron in CA1 sector in delayed neuronal death after bilateral carotid artery occlusion in gerbils and by determing the sodium, calcium and water contents, measuring of infarct area in rat brain after middle cerebral artery occlusion (MCAO).RESULTS:Compared with saline group the neuronal death (apoptosis) in CA1 sector of hippocampus was significantly reduced in transient cerebral ischemia of gerbils. The contents of sodium, calcium and water of ischemic area and infarct size was reduced in focal cerebral ischemia of rats.CONCLUSION: DM had neuroprotective effect on delayed neuronal death (apoptosis) in transient cerebral ischemia of gerbils and it also reduced cerebral edema and infarct size in focal cerebral ischemia of rats.
, 百拇医药
MeSH Neurons; Death; Cerebral ischemia; Muridae
兴奋性氨基酸(excitatory amino acid, EAA)在短暂性脑缺血迟发性神经元死亡及局部脑缺血发病中的作用，已为大量实验研究证实[1]。应用大脑微透析法已证实短暂性脑缺血及局部脑缺血时大脑细胞外液谷氨酸、天门冬氨酸含量明显增高[2]，根据兴奋性氨基酸兴奋毒性理论也证实：一些EAA受体拮抗剂对脑缺血、脑外伤有保护神经元免受损伤的作用，其中对N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体拮抗剂对缺血性脑损伤时神经元的保护作用，受到极大关注[3]。
右吗喃(dextrophan)及右甲吗喃(dextromethorphan，DM)已证明均为非竞争性NMDA受体拮抗剂，关于右吗喃应用于脑缺血实验治疗已有不少报道，而对右甲吗喃应用于脑缺血实验治疗报道不多。右甲吗喃毒性较右吗喃为低。体外实验证明右甲吗喃能减轻缺血、缺氧性神经元损伤，体内对家兔左颈总动脉及大脑前动脉夹闭局部脑缺血，能减轻神经元损伤和缩小梗塞范围。但对短暂性脑缺血神经元迟发性死亡(delayed neuronal death, DND)及大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局部脑缺血是否有改善作用，未见文献报道。本研究探讨右甲吗喃对短暂性脑缺血DND的作用以及对MCAO局部脑缺血的防治效应，为临床应用右甲吗喃提供实验依据。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料：
实验动物：健康沙土鼠，雌雄不拘，体重(65±14) g (
±s)，由本室供给；Wistar大鼠，雄性，体重(355±24)g (
±s)，由本院动物科供给。药品和给药法：右甲吗喃(DM)为Sigma公司出品，给药剂量和方法为沙土鼠40 mg/kg,ip于术前30 min,术后24 h，72 h再各给药一次。大鼠于手术前后30 min各给药40 mg/kg一次。
, 百拇医药
二、脑缺血动物模型的复制及检测指标：
(一)沙土鼠短暂性脑缺血迟发性神经元死亡：
1、模型复制：沙土鼠乙醚吸入麻醉，颈前正中切口，分离双侧颈总动脉，用动脉微型夹夹闭双侧颈总动脉10 min，松夹后直视血管再通，缝合皮肤切口，放回原条件下继续饲养4 d，复制DND模型，手术过程中保持动物直肠温度在36.5～37.5℃。
2.检测指标：海马CAI区神经元密度计数，参照Kirino[4]方法。
(二)大鼠局部脑缺血：
1.模型复制：大鼠以10%水合氯醛(400 mg/kg ip)麻醉，参照Coyle[5]方法，分离大脑中动脉，并以电灼凝闭。
, 百拇医药 2.检测指标：(1)梗塞面积的测定：动物手术后48h，再次用水合氯醛麻醉，立即断头取脑，将脑置-50℃快速冷冻，10 min取出，作脑组织冠状连续切片，第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，然后每隔2 mm作一切面，并置入2.5%的红四氮唑(TTC)溶液染色30 min后取出照像。选择最大梗塞平面，用Q781型求积仪求出梗塞区占整个半球的百分比。(2)梗塞区钠、钙，水的测定：参照Young等[6]的方法测脑组织含水量。
把干重脑组织用硝酸消化法消化，95℃下烘干，再置500℃ Muffle炉中灰化，加10% SrCl2 0.1 mL作释放剂，用10%硝酸定容到5 mL，AA-670型原子吸收分光光度计测钠、钙(μmol/g)，每克干重组织的含量，并对结果作统计学处理。
结果
一、DM对沙土鼠DND的治疗作用见表1。
, 百拇医药
表1 DM对沙土鼠短暂性脑缺血海马CA1区神经元密度的影响
Tab 1 Effect of dextromethorphan on neuronal density of CA1 sectors in hippocampus of gerbils subjected to 10 min ischemia following by 4 days reperfusion (
±s,n=10)
Group
The number of cells
Saline
245.41±9.18
, 百拇医药
I-R+NS
28.98±20.24△
I-R+DM
166.84±35.62*
△P<0.01，vs saline；*P<0.01，vs I-R-NS
I-R+NS:Ischemia-reperfusion with normal saline ; I-R+DM:Ischemia-reperfusion with dextromethorphan
由表1可以看出，生理盐水对照组海马CA1区神经元大部分死亡，DM能使CA1区神经元存活数增加。说明兴奋性氨基酸受体拮抗剂DM对沙土鼠短暂性脑缺血，能减轻海马CA1区神经元迟发性死亡。
, 百拇医药
二、对大鼠局部脑缺血的治疗作用：
1.对梗塞面积的影响：大鼠凝闭左侧MCA 48 h后，生理盐水对照组(I+NS)最大梗塞面积占同侧大脑的(38.83±2.43)%,而给DM治疗组(I+DM)梗塞面积明显减小为(16.54±1.47)%,P<0.01。表明DM可减小脑缺血梗塞面积。
2.对缺血脑组织含水量及钠、钙的影响：见表2。
表2 DM对大鼠MCA凝闭后48小时梗塞区脑组织钠、钙、水含量的影响
Tab 2 Effect of dextromethorphan on water sodium and calcium contents in rats subjected to MCA occlusion for 48 hours(
±s, n=10)
, http://www.100md.com
Group
Water
(%)
Sodium
(μmol/g dry weight)
Calcium
(μmol/g dry weight)
Sham
81.97±1.11
287.99±21.16
11.00±1.00
I+NS
, http://www.100md.com
84.72±0.75**
568.16±56.30**
27.12±2.77**
I+DM
82.87±0.41*
273.42±54.73△
15.15±4.68△
△P<0.01 vs I+NS; **P<0.01，vs,Sham
I+NS:Ischemia with normal saline; I+DM:Ischemia with dextromethorphan 讨论
, 百拇医药
我们在沙土鼠短暂性脑缺血模型发现右甲吗喃(DM)40 mg/kg四次给药，能使海马CA1区神经元数从(28.98±20.24)/mm提高到(166.84±35.62)/mm，表明DM明显减少缺血后海马CA1区迟发性神经元死亡数。根据Natatori等[7]证实：沙土鼠短暂性脑缺血海马CA1元神经元迟发性死亡，具有凋亡的形态学特点，细胞DNA链断裂，DNA呈梯带(laddering),Tunel染色阳性。也即神经元迟发性死亡不是坏死而是细胞凋亡。因此DM减少短暂性脑缺血CA1区神经元死亡，也就是表明DM能阻止缺血后神经元凋亡。在大鼠MCAO局部脑缺血模型也证明按40 mg/kg ip于缺血前、后给药，能减轻缺血脑组织(额顶区皮层)钠、钙及水含量，缩小梗塞面积。表明DM减轻MCAO局部脑缺血时的缺血损伤，其作用机制可能通过减轻脑水肿，减少钙在缺血组织细胞内聚集，阻止缺血半暗区的扩展，达到缩小梗塞范围，减轻缺血损伤。
DM系一镇咳药物，近年来研究证明：右吗喃(dextrophan)和DM均为NMDA离子通道受体拮抗剂，但前者为高亲合性，后者为低亲和性；前者与受体结合快，结合牢固，毒性也大，后者与受体结合慢，离解也快，特别对生理性兴奋性氨基酸信息传导影响也小，毒副作用也小。由于右吗喃毒副作用大，临床已放弃使用。虽然DM在体内一部分可转化为右吗喃，但Alber等研究证明[8]：DM对脑的作用，不介导于代谢过程中形成的右吗喃，而系DM的直接作用，DM易通过血脑屏障进入脑组织。Steinberg等体外实验也表明[9]：DM达10～30 μmol即可保护培养的皮层细胞不受NMDA受体介导的损害。体内实验也表明家兔左颈总动脉及大脑前动脉闭塞性局部脑缺血，当DM在血浆浓度达500～1500 mg/L，可使神经元损伤减轻64%，而毒性作用，只有当血浆药物浓度>2500 mg/L时才发生。
, 百拇医药
DM目前已用以临床治疗Huntingon氏病、脑外伤病人。DM为有希望成为有应用前景的临床防治脑血管病药物，因而深入进行DM对多种脑缺血模型实验治疗的研究，有重要实践意义。
*云南省应用基础研究基金资助
参考文献
1 李麟仙.钙离子兴奋性氨基酸与缺血性脑损伤.生理科学进展，1992，23(2)：131.
2 Benveniste H, Drjer J, Schousboe A, et al. Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis. J Neurochem, 1984, 43:1396.
, 百拇医药
3 Muir KW, Lees KR. Clinical experience with exitatory amino acid antagonist durgs. Stroke, 1995, 26(3):503.
4 Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Res, 1982, 339:57.
5 Peter Coyle. Middle cerebral artery occlusion in the young rat, Stroke, 1982, 13(6):855.
6 Young W, Rappaport H, Chalif DJ, et al. Regional brain sodium, potassium, and water changes in the rat middle cerebral artery occlusion model of ischemia. Stroke, 1987, 18:751.
, http://www.100md.com
7 Nitatori T, Sato N, Waguri S, et al. Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis. J Neurosci, 1995,15:1001.
8 Albers GW, Saenz RE, Mosee JA, et al. Safety and tolerance of oral dextromethorphan in patients at risk for brain ischemia. Stroke, 1991, 22:1075.
9 Steinberg GK, Kunis D, Delapaz R, et al. Neuroprotection following focal cerebral ischemia with the NMDA antagonist dextromethorphan has a favourable dose response profile. Neurol Res, 1993,15:174.
1997年8月25日收稿，1998年11月6日修回, 百拇医药
单位：昆明医学院病理生理教研室(昆明650031)
关键词：神经元；死亡；脑缺血；鼠科
右甲吗喃对脑缺血的实验治疗研究 摘 要 目的和方法：在沙土鼠通过夹闭双侧颈总动脉复制短暂性脑缺血神经元迟发性坏死，以海马CA1区神经元坏死为指标；在大鼠采用凝闭大脑中动脉复制局部脑缺血，以缺血区脑组织钠、水、钙含量及梗塞面积为指标；观察非竞争性、低亲和力兴奋性氨基酸拮抗剂右甲吗喃对抗脑缺血的作用。结果：右甲吗喃能提高沙土鼠脑缺血后海马CA1区神经元存活数；能降低大鼠大脑中动脉闭塞后缺血区水、钠及钙含量，缩小梗塞面积。结论：右甲吗喃能减轻脑缺血后神经元死亡(即凋亡)；并通过减轻脑水肿，缩小梗塞面积，改善大鼠局部脑缺血时缺血性脑损伤。
The neuroprotective effects of dextromethorphan on experimental cerebral ischemia
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PANG Yi, LI Lin-Xian, WANG Zi-Can
Department of Pathophysiology, Kunming Medical College, Kunming (650031)
Abstract AIM：The present study explores the neuroprotective action of a noncompetitive low affnity excitatory amino acid antagonist,dextromethorphan(DM) in cerebral ischemia.METHODS:The neuroprotective effect of dextromethorphan was assessed by measuring the density of hippocampal neuron in CA1 sector in delayed neuronal death after bilateral carotid artery occlusion in gerbils and by determing the sodium, calcium and water contents, measuring of infarct area in rat brain after middle cerebral artery occlusion (MCAO).RESULTS:Compared with saline group the neuronal death (apoptosis) in CA1 sector of hippocampus was significantly reduced in transient cerebral ischemia of gerbils. The contents of sodium, calcium and water of ischemic area and infarct size was reduced in focal cerebral ischemia of rats.CONCLUSION: DM had neuroprotective effect on delayed neuronal death (apoptosis) in transient cerebral ischemia of gerbils and it also reduced cerebral edema and infarct size in focal cerebral ischemia of rats.
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MeSH Neurons; Death; Cerebral ischemia; Muridae
兴奋性氨基酸(excitatory amino acid, EAA)在短暂性脑缺血迟发性神经元死亡及局部脑缺血发病中的作用，已为大量实验研究证实[1]。应用大脑微透析法已证实短暂性脑缺血及局部脑缺血时大脑细胞外液谷氨酸、天门冬氨酸含量明显增高[2]，根据兴奋性氨基酸兴奋毒性理论也证实：一些EAA受体拮抗剂对脑缺血、脑外伤有保护神经元免受损伤的作用，其中对N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体拮抗剂对缺血性脑损伤时神经元的保护作用，受到极大关注[3]。
右吗喃(dextrophan)及右甲吗喃(dextromethorphan，DM)已证明均为非竞争性NMDA受体拮抗剂，关于右吗喃应用于脑缺血实验治疗已有不少报道，而对右甲吗喃应用于脑缺血实验治疗报道不多。右甲吗喃毒性较右吗喃为低。体外实验证明右甲吗喃能减轻缺血、缺氧性神经元损伤，体内对家兔左颈总动脉及大脑前动脉夹闭局部脑缺血，能减轻神经元损伤和缩小梗塞范围。但对短暂性脑缺血神经元迟发性死亡(delayed neuronal death, DND)及大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局部脑缺血是否有改善作用，未见文献报道。本研究探讨右甲吗喃对短暂性脑缺血DND的作用以及对MCAO局部脑缺血的防治效应，为临床应用右甲吗喃提供实验依据。
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材料与方法
一、材料：
实验动物：健康沙土鼠，雌雄不拘，体重(65±14) g (
±s)，由本室供给；Wistar大鼠，雄性，体重(355±24)g (±s)，由本院动物科供给。药品和给药法：右甲吗喃(DM)为Sigma公司出品，给药剂量和方法为沙土鼠40 mg/kg,ip于术前30 min,术后24 h，72 h再各给药一次。大鼠于手术前后30 min各给药40 mg/kg一次。, 百拇医药
二、脑缺血动物模型的复制及检测指标：
(一)沙土鼠短暂性脑缺血迟发性神经元死亡：
1、模型复制：沙土鼠乙醚吸入麻醉，颈前正中切口，分离双侧颈总动脉，用动脉微型夹夹闭双侧颈总动脉10 min，松夹后直视血管再通，缝合皮肤切口，放回原条件下继续饲养4 d，复制DND模型，手术过程中保持动物直肠温度在36.5～37.5℃。
2.检测指标：海马CAI区神经元密度计数，参照Kirino[4]方法。
(二)大鼠局部脑缺血：
1.模型复制：大鼠以10%水合氯醛(400 mg/kg ip)麻醉，参照Coyle[5]方法，分离大脑中动脉，并以电灼凝闭。
, 百拇医药 2.检测指标：(1)梗塞面积的测定：动物手术后48h，再次用水合氯醛麻醉，立即断头取脑，将脑置-50℃快速冷冻，10 min取出，作脑组织冠状连续切片，第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，然后每隔2 mm作一切面，并置入2.5%的红四氮唑(TTC)溶液染色30 min后取出照像。选择最大梗塞平面，用Q781型求积仪求出梗塞区占整个半球的百分比。(2)梗塞区钠、钙，水的测定：参照Young等[6]的方法测脑组织含水量。
把干重脑组织用硝酸消化法消化，95℃下烘干，再置500℃ Muffle炉中灰化，加10% SrCl2 0.1 mL作释放剂，用10%硝酸定容到5 mL，AA-670型原子吸收分光光度计测钠、钙(μmol/g)，每克干重组织的含量，并对结果作统计学处理。
结果
一、DM对沙土鼠DND的治疗作用见表1。
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表1 DM对沙土鼠短暂性脑缺血海马CA1区神经元密度的影响
Tab 1 Effect of dextromethorphan on neuronal density of CA1 sectors in hippocampus of gerbils subjected to 10 min ischemia following by 4 days reperfusion (
±s,n=10)Group
The number of cells
Saline
245.41±9.18
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I-R+NS
28.98±20.24△
I-R+DM
166.84±35.62*
△P<0.01，vs saline；*P<0.01，vs I-R-NS
I-R+NS:Ischemia-reperfusion with normal saline ; I-R+DM:Ischemia-reperfusion with dextromethorphan
由表1可以看出，生理盐水对照组海马CA1区神经元大部分死亡，DM能使CA1区神经元存活数增加。说明兴奋性氨基酸受体拮抗剂DM对沙土鼠短暂性脑缺血，能减轻海马CA1区神经元迟发性死亡。
, 百拇医药
二、对大鼠局部脑缺血的治疗作用：
1.对梗塞面积的影响：大鼠凝闭左侧MCA 48 h后，生理盐水对照组(I+NS)最大梗塞面积占同侧大脑的(38.83±2.43)%,而给DM治疗组(I+DM)梗塞面积明显减小为(16.54±1.47)%,P<0.01。表明DM可减小脑缺血梗塞面积。
2.对缺血脑组织含水量及钠、钙的影响：见表2。
表2 DM对大鼠MCA凝闭后48小时梗塞区脑组织钠、钙、水含量的影响
Tab 2 Effect of dextromethorphan on water sodium and calcium contents in rats subjected to MCA occlusion for 48 hours(
±s, n=10), http://www.100md.com
Group
Water
(%)
Sodium
(μmol/g dry weight)
Calcium
(μmol/g dry weight)
Sham
81.97±1.11
287.99±21.16
11.00±1.00
I+NS
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84.72±0.75**
568.16±56.30**
27.12±2.77**
I+DM
82.87±0.41*
273.42±54.73△
15.15±4.68△
△P<0.01 vs I+NS; **P<0.01，vs,Sham
I+NS:Ischemia with normal saline; I+DM:Ischemia with dextromethorphan 讨论
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我们在沙土鼠短暂性脑缺血模型发现右甲吗喃(DM)40 mg/kg四次给药，能使海马CA1区神经元数从(28.98±20.24)/mm提高到(166.84±35.62)/mm，表明DM明显减少缺血后海马CA1区迟发性神经元死亡数。根据Natatori等[7]证实：沙土鼠短暂性脑缺血海马CA1元神经元迟发性死亡，具有凋亡的形态学特点，细胞DNA链断裂，DNA呈梯带(laddering),Tunel染色阳性。也即神经元迟发性死亡不是坏死而是细胞凋亡。因此DM减少短暂性脑缺血CA1区神经元死亡，也就是表明DM能阻止缺血后神经元凋亡。在大鼠MCAO局部脑缺血模型也证明按40 mg/kg ip于缺血前、后给药，能减轻缺血脑组织(额顶区皮层)钠、钙及水含量，缩小梗塞面积。表明DM减轻MCAO局部脑缺血时的缺血损伤，其作用机制可能通过减轻脑水肿，减少钙在缺血组织细胞内聚集，阻止缺血半暗区的扩展，达到缩小梗塞范围，减轻缺血损伤。
DM系一镇咳药物，近年来研究证明：右吗喃(dextrophan)和DM均为NMDA离子通道受体拮抗剂，但前者为高亲合性，后者为低亲和性；前者与受体结合快，结合牢固，毒性也大，后者与受体结合慢，离解也快，特别对生理性兴奋性氨基酸信息传导影响也小，毒副作用也小。由于右吗喃毒副作用大，临床已放弃使用。虽然DM在体内一部分可转化为右吗喃，但Alber等研究证明[8]：DM对脑的作用，不介导于代谢过程中形成的右吗喃，而系DM的直接作用，DM易通过血脑屏障进入脑组织。Steinberg等体外实验也表明[9]：DM达10～30 μmol即可保护培养的皮层细胞不受NMDA受体介导的损害。体内实验也表明家兔左颈总动脉及大脑前动脉闭塞性局部脑缺血，当DM在血浆浓度达500～1500 mg/L，可使神经元损伤减轻64%，而毒性作用，只有当血浆药物浓度>2500 mg/L时才发生。
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DM目前已用以临床治疗Huntingon氏病、脑外伤病人。DM为有希望成为有应用前景的临床防治脑血管病药物，因而深入进行DM对多种脑缺血模型实验治疗的研究，有重要实践意义。
*云南省应用基础研究基金资助
参考文献
1 李麟仙.钙离子兴奋性氨基酸与缺血性脑损伤.生理科学进展，1992，23(2)：131.
2 Benveniste H, Drjer J, Schousboe A, et al. Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis. J Neurochem, 1984, 43:1396.
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3 Muir KW, Lees KR. Clinical experience with exitatory amino acid antagonist durgs. Stroke, 1995, 26(3):503.
4 Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Res, 1982, 339:57.
5 Peter Coyle. Middle cerebral artery occlusion in the young rat, Stroke, 1982, 13(6):855.
6 Young W, Rappaport H, Chalif DJ, et al. Regional brain sodium, potassium, and water changes in the rat middle cerebral artery occlusion model of ischemia. Stroke, 1987, 18:751.
, http://www.100md.com
7 Nitatori T, Sato N, Waguri S, et al. Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis. J Neurosci, 1995,15:1001.
8 Albers GW, Saenz RE, Mosee JA, et al. Safety and tolerance of oral dextromethorphan in patients at risk for brain ischemia. Stroke, 1991, 22:1075.
9 Steinberg GK, Kunis D, Delapaz R, et al. Neuroprotection following focal cerebral ischemia with the NMDA antagonist dextromethorphan has a favourable dose response profile. Neurol Res, 1993,15:174.
1997年8月25日收稿，1998年11月6日修回, 百拇医药