缺血预处置及磷酸肌酸对心肌缺血/再灌注羟自由基生成的影响
作者：毛东伟 赵玉娟 朱世军 王孝铭
单位：毛东伟 赵玉娟 中国人民解放军第211医院(哈尔滨 150080)；朱世军 王孝铭 哈尔滨医科大学病理生理教研室
关键词：局部缺血；再灌注；自由基；磷酸肌酸
中国病理生理杂志990419 摘 要 目的：探讨缺血预处置及磷酸肌酸对.OH的影响。方法：以离体大鼠心脏为模型，以水杨酸为捕捉剂，利用其与再灌注产生的羟自由基(.OH)反应生成的二羟苯甲酸(DHBA)为指标，用高效液相色谱(HPLC)法检测缺血心肌再灌注冠脉流出液和心肌组织中DHBA含量。结果：缺血再灌注冠脉流出液和心肌DHBA生成增多，与对照组相比差异非常显著，缺血预处置组与非处置组相比DHBA生成明显降低，而且四次预处置组低于一次预处置组；缺血前给予磷酸肌酸使DHBA生成明显减低，但与缺血预处置并用组无明显差异。结论：缺血预处置与磷酸肌酸可以通过减少缺血再灌注心肌.OH的生成保护心肌，但二者无协同作用，且缺血预处置有累加作用。
, 百拇医药
The effect of ischemia preconditioning and phosphocreatine on the.OH formation of ischemia/reperfusion hearts
MAO Dong-Wei, ZHAO Yu-Juan,ZHU Shi-Jun, WANG Xiao-Ming
The 211 Hospital of PLA, Harbin (150086)
Abstract AIM:To study the effect of ischemia preconditioning and phosphocreatine on the .OH formation. METHOD：Langendorff perfusion technique of rat heart with Krebs-Henseleit buffer (KHB) and HPLC with ultraviolet detector were used to detect the DHBAs formed in myocardium and released into the coronary effluent after reaction of .OH with sailicylic acid as a trapper.RESULTS：Formation of DHBAs in ischemia 40 min in reperfusion group increased very significantly as compared with control. The formation of DHBAs after one and four cycles of ischemia preconditioning decreased very signifi cantly while compared with untreated group (I40R), and four cycles of ischemia precondtioning was superior to one cycle (P<0.01). Phosphocreatine could significantly decrease the DHBAs but had no difference with the effect of phosphocreatine between preconditioning group and PC1 group statistically. CONCLUSIONS：Ischemia preconditioning can reduce*OH production by preserving energy reserve and the multiple treatment is more effective than a single one. Phosphocreatine can also reduce .OH formation by unknown mechanisms. But ischemia preconditioning plus PCr have not shown more effective results than the single preconditioning and the single PC1 treatment.
, 百拇医药
MeSH Ischemia; Reperfusion; Free radicals; Phosphocreatine
预处置是在长时间缺血前给予短期缺血再灌注的一种措施。目前对缺血预处置[1，2]及外源性磷酸肌酸[8，9]对心肌的保护作用已有部分研究。但其作用机制尚不完全清楚。自由基是造成缺血再灌注损伤的重要原因，本文旨在观察缺血预处置及磷酸肌酸对心肌缺血/再灌注羟自由基生成的影响。
材料与方法
(一)、模型制备及分组；雄性Wistar大鼠体重200～250 g(黑龙江省肿瘤研究所提供)，采用Langendorff离体心脏灌流模型，预灌20 min后随机分组，Control组：继续灌注40 min；I40R组：缺血40 min后再灌120 s;PC1(preconditioning)组：一次预处置(缺血5 min再灌10 min)后缺血40 min再灌120 s；PC4组：四次预处置后同I40R；PCr组：用含PCr 10 mmol/L的灌流液灌注5 min后同I40R组；PCr+PC1组：一次预处置后进行PCr组的处理。
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(二)灌流液及灌流条件：灌流液为Krebs-Hensleit缓冲液，组成为(mmol/L):NaCl 118.0，KCl 14.7，MgSO4 1.2，CaCl2 2.5，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25.0， Glucose 5.5，用超纯水配制。灌流前用体积分数为95%O2与5% CO2混合气按1.5 L/min向储液瓶内的灌流液中通气30 min，灌注压为8.8 kPa，灌流液维持在37℃。
(三)样品制备(参考Ondera等的方法[3])：
1.冠脉流出液样品制备：由文献得知再灌注1～3 min自由基生成达高峰。因此于再灌注90 s开始接取冠脉流出液至再灌120 s。取1 mL流出液置于10 mL试管内，加入40 μL 100 μmol/L 2，4-DHBA作为内标，同时加入50 μL 0.5 mol/L HCl，10 mL乙醚。充分混匀120 s，然后静止分层，将乙醚层移至另一试管中。置于45℃水浴中使乙醚完全蒸发后，向试管内加入50 μL 0.5 mol/L HCl和32.5 μL流动相(80% 0.03 mol/L柠檬酸，0.03 mol/L醋酸；20%甲醇，经超纯水配制过滤脱气后使用，pH3.6)，将试管壁上的结晶状物彻底洗到试管底部，使其充分溶解并摇匀后取20μL注入，HPLC分析(色谱条件：色谱柱Licrosorb C18，检测敏度0.02 AVFS,检测波长315 nm,流速0.6 mL/min，检测数据用C-R3AID文件内部标准法定量计算)。
, 百拇医药
2.心肌样品制备：剪取心尖部心室肌200 mg,用0.42 mol/L HCLO4制成匀浆，再用1 mol/L KOH中和，6000×g离心15 min,取上清1 mL。
结果
DHBA(dihydroxybenzoic acid,二羟苯甲酸)含量值为测得2，3-DHBA与2，5-DHBA值之和。
(一) I40R组冠脉流出液及心肌中DHBA含量非常显著地高于对照组(见表1)。
(二) 预处置组DHBA生成非常显著低于I40R组，但非常显著高于对照组；PC1组DHBA含量非常显著高于PC4组(见表1)。
, 百拇医药 (三) PG、PC4、PCr及PCr+PC1组DHBA含量均非常显著低于I40组，非常显著地高于对照组，但PCr+PC1组与PCr组及PC1组间无显著差别(见表1)。
表1 心肌及冠脉搏流出液中DHBAs含量
Tab 1 Amount of DHBAs in coronary effluent and myocardium (nmol/g wet weight，
±s，n=7) Group
Myocardium
Coronary effluent
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Contro
l0.625±0.015
0.0618±0.0020
I40R
10.904±0.245*
1.3986±0.0141*
PC1
5.954±0.104*▲
0.6013±0.0114*▲
PC4
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3.508±0.210*▲■
0.2811±0.0162*▲■
PCr
5.160±0.254*▲
0.5904±0.0336*▲
PCr+PC1
5.032±0.320*▲
0.5648±0.0644*▲
*P<0.01，vs control; ▲P<0.01 vs I40R；■P<0.01，vs PC1讨论
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研究表明氧自由基形成可能是再灌注损伤中最重要的触发因子。本实验用更为简便有效的HPLC法探讨缺血预处置及磷酸肌酸对缺血再灌注心肌.OH生成的影响。
缺血40 min再灌注，心肌组织及冠脉流出液中DHBA明显增加，说明.OH生成显著增加，其可能的机制是：1、由于缺氧，线粒体呼吸链电子传递、质子泵出偶联障碍，O2还原障碍产生.O2进而转变产.OH。2、缺血缺氧时大量ATP降解产生次黄嘌呤、黄嘌呤，黄嘌呤脱氢酶转变成氧化酶，在再灌注有大量氧分子进入时产生大量.O2，在过渡金属存在下转变成.OH。
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结果显示，预处置组DHBA量非常明显地低于未处置I40R组，且四次预处置组DHBA量非常明显低于一次预处置组，可见预处置可以减少缺血再灌注.OH的生成，且有累加效应，提示缺血预处置可以减弱自由基所介导的再灌注损伤。其作用机制可能是腺苷等内源性保护因子的参与[4]、心肌代谢的改善和线粒体H+-ATP酶水解活性的下降[5]，也有可能是心肌抗氧化能力的增强[6]，或是几种机制协同作用共同完成。
资料表明，磷酸肌酸(PCr)可通过改善能量代谢[7]、增强心肌收缩力[8]及稳定细胞膜[9]参与心肌的保护。本实验发现，PCr还具有清除.OH的作用，作用机制可能与能量代谢有关。而且，本实验亦可反证缺血再灌注时自由基的生成与能量代谢障碍有密切关系。
, 百拇医药
1 Tosaki A, Cordis G, Szerdahlyi P, et al. Effect of preconditioning on repefusion arrhythmias, myocardial functions, formation of free radicals and ion shifts in isolated ischemic/reperfusion rat hearts. Cardiovasc Pharmacol, 1994, 23:365.
2 Yellen DM, Alkhuaifi HM, Pugsley WB, et al. Preconditioning the human myocardium. Lancet, 1993, 342:276.
3 Onodera T, Ashref M. Detection of hydroxyl radicals in the postischemic reperfused heart using salicylate as a trapping agent. J Mol Cell Cardiol, 1991, 23:265.
, http://www.100md.com
4 Downey JM, Liu GS, Thorton JD. Adenosine and the anti-infarct effects of preconditioning. Cardiovasc Res, 1993, 27:9.
5 Murry CE, Rechard VJ, Reimer KA, et al. lschemic preconditioning slows energy metabolism and deleys ultrastructural damage during a sustained ischemic episode. Circ Res, 1990, 66(4):913.
6 Hoshida S, Kuzuya T, Fuji H, et al. Ischemic preconditioning affects free radical generating and scavenging systems in canine myocardial infarction. Circulation, 1991, 84(Supp Ⅱ):192.
, 百拇医药
7 Cuningham TM. Text book of clinical cardioplegia mount kisco. New York: Future Publishing Company, 1982. 241～264.
8 Semenovsky ML, Shumakov V, Sharov VG, et al. Protection of ischemic myocardium by exogenous phosphocreatine. Thorac Cardiovasc Surg, 1987, 94:762.
9 Rosenstraukh LV, Saks VA, Anyukhovsky EP, et al. The Antiarrhythmic of phosphocreatine in acute myocardial ischemia. Biochem Med, 1985, 34:120.
1997年12月8日收稿，1998年10月14日修回, 百拇医药
单位：毛东伟 赵玉娟 中国人民解放军第211医院(哈尔滨 150080)；朱世军 王孝铭 哈尔滨医科大学病理生理教研室
关键词：局部缺血；再灌注；自由基；磷酸肌酸
中国病理生理杂志990419 摘 要 目的：探讨缺血预处置及磷酸肌酸对.OH的影响。方法：以离体大鼠心脏为模型，以水杨酸为捕捉剂，利用其与再灌注产生的羟自由基(.OH)反应生成的二羟苯甲酸(DHBA)为指标，用高效液相色谱(HPLC)法检测缺血心肌再灌注冠脉流出液和心肌组织中DHBA含量。结果：缺血再灌注冠脉流出液和心肌DHBA生成增多，与对照组相比差异非常显著，缺血预处置组与非处置组相比DHBA生成明显降低，而且四次预处置组低于一次预处置组；缺血前给予磷酸肌酸使DHBA生成明显减低，但与缺血预处置并用组无明显差异。结论：缺血预处置与磷酸肌酸可以通过减少缺血再灌注心肌.OH的生成保护心肌，但二者无协同作用，且缺血预处置有累加作用。
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The effect of ischemia preconditioning and phosphocreatine on the.OH formation of ischemia/reperfusion hearts
MAO Dong-Wei, ZHAO Yu-Juan,ZHU Shi-Jun, WANG Xiao-Ming
The 211 Hospital of PLA, Harbin (150086)
Abstract AIM:To study the effect of ischemia preconditioning and phosphocreatine on the .OH formation. METHOD：Langendorff perfusion technique of rat heart with Krebs-Henseleit buffer (KHB) and HPLC with ultraviolet detector were used to detect the DHBAs formed in myocardium and released into the coronary effluent after reaction of .OH with sailicylic acid as a trapper.RESULTS：Formation of DHBAs in ischemia 40 min in reperfusion group increased very significantly as compared with control. The formation of DHBAs after one and four cycles of ischemia preconditioning decreased very signifi cantly while compared with untreated group (I40R), and four cycles of ischemia precondtioning was superior to one cycle (P<0.01). Phosphocreatine could significantly decrease the DHBAs but had no difference with the effect of phosphocreatine between preconditioning group and PC1 group statistically. CONCLUSIONS：Ischemia preconditioning can reduce*OH production by preserving energy reserve and the multiple treatment is more effective than a single one. Phosphocreatine can also reduce .OH formation by unknown mechanisms. But ischemia preconditioning plus PCr have not shown more effective results than the single preconditioning and the single PC1 treatment.
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MeSH Ischemia; Reperfusion; Free radicals; Phosphocreatine
预处置是在长时间缺血前给予短期缺血再灌注的一种措施。目前对缺血预处置[1，2]及外源性磷酸肌酸[8，9]对心肌的保护作用已有部分研究。但其作用机制尚不完全清楚。自由基是造成缺血再灌注损伤的重要原因，本文旨在观察缺血预处置及磷酸肌酸对心肌缺血/再灌注羟自由基生成的影响。
材料与方法
(一)、模型制备及分组；雄性Wistar大鼠体重200～250 g(黑龙江省肿瘤研究所提供)，采用Langendorff离体心脏灌流模型，预灌20 min后随机分组，Control组：继续灌注40 min；I40R组：缺血40 min后再灌120 s;PC1(preconditioning)组：一次预处置(缺血5 min再灌10 min)后缺血40 min再灌120 s；PC4组：四次预处置后同I40R；PCr组：用含PCr 10 mmol/L的灌流液灌注5 min后同I40R组；PCr+PC1组：一次预处置后进行PCr组的处理。
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(二)灌流液及灌流条件：灌流液为Krebs-Hensleit缓冲液，组成为(mmol/L):NaCl 118.0，KCl 14.7，MgSO4 1.2，CaCl2 2.5，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25.0， Glucose 5.5，用超纯水配制。灌流前用体积分数为95%O2与5% CO2混合气按1.5 L/min向储液瓶内的灌流液中通气30 min，灌注压为8.8 kPa，灌流液维持在37℃。
(三)样品制备(参考Ondera等的方法[3])：
1.冠脉流出液样品制备：由文献得知再灌注1～3 min自由基生成达高峰。因此于再灌注90 s开始接取冠脉流出液至再灌120 s。取1 mL流出液置于10 mL试管内，加入40 μL 100 μmol/L 2，4-DHBA作为内标，同时加入50 μL 0.5 mol/L HCl，10 mL乙醚。充分混匀120 s，然后静止分层，将乙醚层移至另一试管中。置于45℃水浴中使乙醚完全蒸发后，向试管内加入50 μL 0.5 mol/L HCl和32.5 μL流动相(80% 0.03 mol/L柠檬酸，0.03 mol/L醋酸；20%甲醇，经超纯水配制过滤脱气后使用，pH3.6)，将试管壁上的结晶状物彻底洗到试管底部，使其充分溶解并摇匀后取20μL注入，HPLC分析(色谱条件：色谱柱Licrosorb C18，检测敏度0.02 AVFS,检测波长315 nm,流速0.6 mL/min，检测数据用C-R3AID文件内部标准法定量计算)。
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2.心肌样品制备：剪取心尖部心室肌200 mg,用0.42 mol/L HCLO4制成匀浆，再用1 mol/L KOH中和，6000×g离心15 min,取上清1 mL。
结果
DHBA(dihydroxybenzoic acid,二羟苯甲酸)含量值为测得2，3-DHBA与2，5-DHBA值之和。
(一) I40R组冠脉流出液及心肌中DHBA含量非常显著地高于对照组(见表1)。
(二) 预处置组DHBA生成非常显著低于I40R组，但非常显著高于对照组；PC1组DHBA含量非常显著高于PC4组(见表1)。
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表1 心肌及冠脉搏流出液中DHBAs含量
Tab 1 Amount of DHBAs in coronary effluent and myocardium (nmol/g wet weight，
±s，n=7) GroupMyocardium
Coronary effluent
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Contro
l0.625±0.015
0.0618±0.0020
I40R
10.904±0.245*
1.3986±0.0141*
PC1
5.954±0.104*▲
0.6013±0.0114*▲
PC4
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3.508±0.210*▲■
0.2811±0.0162*▲■
PCr
5.160±0.254*▲
0.5904±0.0336*▲
PCr+PC1
5.032±0.320*▲
0.5648±0.0644*▲
*P<0.01，vs control; ▲P<0.01 vs I40R；■P<0.01，vs PC1讨论
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研究表明氧自由基形成可能是再灌注损伤中最重要的触发因子。本实验用更为简便有效的HPLC法探讨缺血预处置及磷酸肌酸对缺血再灌注心肌.OH生成的影响。
缺血40 min再灌注，心肌组织及冠脉流出液中DHBA明显增加，说明.OH生成显著增加，其可能的机制是：1、由于缺氧，线粒体呼吸链电子传递、质子泵出偶联障碍，O2还原障碍产生.O2进而转变产.OH。2、缺血缺氧时大量ATP降解产生次黄嘌呤、黄嘌呤，黄嘌呤脱氢酶转变成氧化酶，在再灌注有大量氧分子进入时产生大量.O2，在过渡金属存在下转变成.OH。
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结果显示，预处置组DHBA量非常明显地低于未处置I40R组，且四次预处置组DHBA量非常明显低于一次预处置组，可见预处置可以减少缺血再灌注.OH的生成，且有累加效应，提示缺血预处置可以减弱自由基所介导的再灌注损伤。其作用机制可能是腺苷等内源性保护因子的参与[4]、心肌代谢的改善和线粒体H+-ATP酶水解活性的下降[5]，也有可能是心肌抗氧化能力的增强[6]，或是几种机制协同作用共同完成。
资料表明，磷酸肌酸(PCr)可通过改善能量代谢[7]、增强心肌收缩力[8]及稳定细胞膜[9]参与心肌的保护。本实验发现，PCr还具有清除.OH的作用，作用机制可能与能量代谢有关。而且，本实验亦可反证缺血再灌注时自由基的生成与能量代谢障碍有密切关系。
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1 Tosaki A, Cordis G, Szerdahlyi P, et al. Effect of preconditioning on repefusion arrhythmias, myocardial functions, formation of free radicals and ion shifts in isolated ischemic/reperfusion rat hearts. Cardiovasc Pharmacol, 1994, 23:365.
2 Yellen DM, Alkhuaifi HM, Pugsley WB, et al. Preconditioning the human myocardium. Lancet, 1993, 342:276.
3 Onodera T, Ashref M. Detection of hydroxyl radicals in the postischemic reperfused heart using salicylate as a trapping agent. J Mol Cell Cardiol, 1991, 23:265.
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4 Downey JM, Liu GS, Thorton JD. Adenosine and the anti-infarct effects of preconditioning. Cardiovasc Res, 1993, 27:9.
5 Murry CE, Rechard VJ, Reimer KA, et al. lschemic preconditioning slows energy metabolism and deleys ultrastructural damage during a sustained ischemic episode. Circ Res, 1990, 66(4):913.
6 Hoshida S, Kuzuya T, Fuji H, et al. Ischemic preconditioning affects free radical generating and scavenging systems in canine myocardial infarction. Circulation, 1991, 84(Supp Ⅱ):192.
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7 Cuningham TM. Text book of clinical cardioplegia mount kisco. New York: Future Publishing Company, 1982. 241～264.
8 Semenovsky ML, Shumakov V, Sharov VG, et al. Protection of ischemic myocardium by exogenous phosphocreatine. Thorac Cardiovasc Surg, 1987, 94:762.
9 Rosenstraukh LV, Saks VA, Anyukhovsky EP, et al. The Antiarrhythmic of phosphocreatine in acute myocardial ischemia. Biochem Med, 1985, 34:120.
1997年12月8日收稿，1998年10月14日修回, 百拇医药