脓毒血症时大鼠心脏Gαq/11的变化*
作者：王岩眉△ 吴立玲 克拉拉 王 瑶
单位：北京医科大学病理生理学教研室(北京 100083)
关键词：
G蛋白是连接多种细胞膜受体与效应器之间信号转导的重要蛋白质
G蛋白是连接多种细胞膜受体与效应器之间信号转导的重要蛋白质。其中Gαq/11是调节肌醇磷脂信号转导途径的关键物质。脓毒血症往往导致不同程度的心功能障碍，其发生又可促进脓毒血症的进展与恶化。有研究表明，内毒素休克大鼠心肌细胞蛋白激酶(protein kinase C,PKC)活性升高。但对肌醇磷脂信号转导系统的上游信号分子Gαq/11 蛋白的研究尚未见报道。本实验以大鼠腹膜炎脓毒血症为模型，观察心脏Gαq/11蛋白的变化，以探讨脓毒血症时肌醇磷脂信号转导系统的功能变化及其在心功能障碍中的发病学意义。
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材料和方法
(一)动物模型：健康雄性Wistar大鼠，体重200～250 g(本校实验动物中心提供)。参照Wichterman等的盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)复制大鼠腹膜炎脓毒血症模型。动物随机分为3组：(1)假手术(sham operation，S)组(n=6)：除不进行盲肠结扎穿孔外，余同脓毒血症组；(2)早期脓毒血症(early sepsis,ES)组(n=6): CLP术后9 h，20%乌拉坦(0.5 mL/100 g体重)ip麻醉，经右颈动脉插管,记录平均动脉压(MAP)，心室压力最大上升和下降速率(±dp/dt max)。 测量后速取心脏, 4℃生理盐水洗去血液，滤纸吸干后-20℃保存；(3)晚期脓毒血症 (late sepsis, LS)组(n=6)：CLP术后18 h，测定上述指标并取出心脏。
(二)差速离心法制备大鼠心肌细胞膜：将心脏剪碎，加10倍体积Buffer A (10 mmo1/L Tris-HCl, l mmo1/L EDTA, 250 mmol/L蔗糖，pH7.4)。用内切式匀浆器(ZS83-1型)20 s×3制备心肌匀浆液，1 000×g,4℃离心10 min，收集上清平衡后20 000×g，4℃离心40 min，弃上清，沉淀悬浮于Buffer A中，分装后-20℃保存。
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(三)丙二醛(MDA)含量的测定：Lowry氏法测定心肌细胞膜蛋白含量。硫代巴比妥酸比色法测量MDA含量。
(四)免疫印迹法测定心脏Gαq/11含量：10% SDS-PAGE分离膜蛋白，25 V，10 h将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉/PBS进行非特异性封闭。加入1∶125抗Gαq/11抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc产品，购自北京中山生物制品有限公司)4℃过夜，PBS冲洗后，加入1∶2500辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，25℃孵育1h。冲洗后加入化学发光剂(购自Amersham公司)进行曝光。应用LEICA Q550 IW图像分析系统对所得区带进行扫描 。以假手术组动物Gαq/11积分光密度为100%，与脓毒血症组进行比较。
(五)统计处理：全部数据用均数±标准差(x±s)表示，采用One-way ANOVA计算机软件进行统计分析。
结果
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(一)血液动力学变化：ES、LS时MAP没有明显变化。±dp/dtmax在ES时变化不明显，而LS时明显降低(见表1)。
表1 脓毒血症大鼠血液动力学、心脏 MDA含量和Gαq/11的变化
Tab 1 Changes of hemodynamic parameter and heart MDA levels and Gαq/11 during rat sepsis (x±s ，n=6)
S
ES
LS
MAP(kPa)
14±2
15±1
, 百拇医药
15±1
+dp/dtmax(kPa/s)
991±238
914±138
587±380*
-dp/dtmax(kPa/s)
993±178
976±248
614±328*
MDA(nmol/mg pr)
7.9±2.4
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13.9±3.4*
19.3±3.4**
Gαq/11
100
116±13
151±7***
*P<0.05,** P<0.01，vs S group
S=sham operation；ES=early sepsis；LS=late sepsis
MAP=mean arterial pressure; MDA=malondialdehyde
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(二)MDA含量的变化：ES、LS时MDA含量明显高于假手术组(见表1)。
(三)心脏Gαq/11的变化：脓毒血症时心脏Gαq/11蛋白的免疫印迹测定结果见图1表1。
图1 免疫印迹法测定大鼠心脏Gαq/11蛋白
Fig 1 Western blot analysis of Gαq/11 protein in rat hearts
讨论
脓毒血症过程中常常伴有不同程度的心功能障碍,其发病机制至今尚未阐明。近年来发现，肌醇磷脂信号转导系统参与调节细胞内的钙离子浓度，进而影响心脏的舒缩功能。有文献报道，脓毒血症时心肌肌浆网摄钙初速率以及最大摄钙量降低。这可能是引起心肌细胞钙超载的原因之一。另有研究发现，内毒素休克时心肌蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性升高。PKC是细胞内肌醇磷脂信号传递中的关键环节之一。其主要与心肌负性肌力效应有关。钙离子可以激活PKC，反过来PKC可以通过电压依赖性钙通道刺激钙离子的内流。
, 百拇医药
有研究者发现，脓毒血症时大鼠心肌组织以及血浆中肾上腺素、血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)、内皮素和血栓素A2(TXA2) 含量明显升高。 它们通过激活各自相应的受体而发挥生物学效应。有文献报道，肾上腺素能α1受体、AngⅡ的AT1受体、内皮素受体以及TXA2受体等与百日咳毒素不敏感的Gαq/11蛋白偶联。脓毒血症时这些受体的激活是否导致Gαq/11的变化，尚未见报道。我们的工作表明，ES时心脏Gαq/11表达有增加的趋势，LS 时明显升高。这表明脓毒血症确可引起心脏Gαq/11的表达增加。而心脏Gαq/11增加时相与心肌舒缩能力降低时相密切相关，提示肌醇磷脂信号转导系统的功能异常可能是导致心功能障碍发生的重要原因。
已有研究发现感染性休克时氧自由基升高。我们亦观察到ES、LS时 MDA含量明显升高，提示心肌已受到脂质过氧化损伤。而脂质过氧化产物的增加是否通过激活Gαq/11导致心功能障碍，目前尚不明确，有待于进一步研究。
* 美国中华医学基金(CMB)和国家自然科学基金资助(No.39570301)
△ 北京医学高等专科学校 (北京101300)
1998年7月17日收稿，1999年元月11日修回, 百拇医药
单位：北京医科大学病理生理学教研室(北京 100083)
关键词：
G蛋白是连接多种细胞膜受体与效应器之间信号转导的重要蛋白质
G蛋白是连接多种细胞膜受体与效应器之间信号转导的重要蛋白质。其中Gαq/11是调节肌醇磷脂信号转导途径的关键物质。脓毒血症往往导致不同程度的心功能障碍，其发生又可促进脓毒血症的进展与恶化。有研究表明，内毒素休克大鼠心肌细胞蛋白激酶(protein kinase C,PKC)活性升高。但对肌醇磷脂信号转导系统的上游信号分子Gαq/11 蛋白的研究尚未见报道。本实验以大鼠腹膜炎脓毒血症为模型，观察心脏Gαq/11蛋白的变化，以探讨脓毒血症时肌醇磷脂信号转导系统的功能变化及其在心功能障碍中的发病学意义。
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材料和方法
(一)动物模型：健康雄性Wistar大鼠，体重200～250 g(本校实验动物中心提供)。参照Wichterman等的盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)复制大鼠腹膜炎脓毒血症模型。动物随机分为3组：(1)假手术(sham operation，S)组(n=6)：除不进行盲肠结扎穿孔外，余同脓毒血症组；(2)早期脓毒血症(early sepsis,ES)组(n=6): CLP术后9 h，20%乌拉坦(0.5 mL/100 g体重)ip麻醉，经右颈动脉插管,记录平均动脉压(MAP)，心室压力最大上升和下降速率(±dp/dt max)。 测量后速取心脏, 4℃生理盐水洗去血液，滤纸吸干后-20℃保存；(3)晚期脓毒血症 (late sepsis, LS)组(n=6)：CLP术后18 h，测定上述指标并取出心脏。
(二)差速离心法制备大鼠心肌细胞膜：将心脏剪碎，加10倍体积Buffer A (10 mmo1/L Tris-HCl, l mmo1/L EDTA, 250 mmol/L蔗糖，pH7.4)。用内切式匀浆器(ZS83-1型)20 s×3制备心肌匀浆液，1 000×g,4℃离心10 min，收集上清平衡后20 000×g，4℃离心40 min，弃上清，沉淀悬浮于Buffer A中，分装后-20℃保存。
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(三)丙二醛(MDA)含量的测定：Lowry氏法测定心肌细胞膜蛋白含量。硫代巴比妥酸比色法测量MDA含量。
(四)免疫印迹法测定心脏Gαq/11含量：10% SDS-PAGE分离膜蛋白，25 V，10 h将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉/PBS进行非特异性封闭。加入1∶125抗Gαq/11抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc产品，购自北京中山生物制品有限公司)4℃过夜，PBS冲洗后，加入1∶2500辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，25℃孵育1h。冲洗后加入化学发光剂(购自Amersham公司)进行曝光。应用LEICA Q550 IW图像分析系统对所得区带进行扫描 。以假手术组动物Gαq/11积分光密度为100%，与脓毒血症组进行比较。
(五)统计处理：全部数据用均数±标准差(x±s)表示，采用One-way ANOVA计算机软件进行统计分析。
结果
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(一)血液动力学变化：ES、LS时MAP没有明显变化。±dp/dtmax在ES时变化不明显，而LS时明显降低(见表1)。
表1 脓毒血症大鼠血液动力学、心脏 MDA含量和Gαq/11的变化
Tab 1 Changes of hemodynamic parameter and heart MDA levels and Gαq/11 during rat sepsis (x±s ，n=6)
S
ES
LS
MAP(kPa)
14±2
15±1
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15±1
+dp/dtmax(kPa/s)
991±238
914±138
587±380*
-dp/dtmax(kPa/s)
993±178
976±248
614±328*
MDA(nmol/mg pr)
7.9±2.4
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13.9±3.4*
19.3±3.4**
Gαq/11
100
116±13
151±7***
*P<0.05,** P<0.01，vs S group
S=sham operation；ES=early sepsis；LS=late sepsis
MAP=mean arterial pressure; MDA=malondialdehyde
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(二)MDA含量的变化：ES、LS时MDA含量明显高于假手术组(见表1)。
(三)心脏Gαq/11的变化：脓毒血症时心脏Gαq/11蛋白的免疫印迹测定结果见图1表1。
图1 免疫印迹法测定大鼠心脏Gαq/11蛋白
Fig 1 Western blot analysis of Gαq/11 protein in rat hearts
讨论
脓毒血症过程中常常伴有不同程度的心功能障碍,其发病机制至今尚未阐明。近年来发现，肌醇磷脂信号转导系统参与调节细胞内的钙离子浓度，进而影响心脏的舒缩功能。有文献报道，脓毒血症时心肌肌浆网摄钙初速率以及最大摄钙量降低。这可能是引起心肌细胞钙超载的原因之一。另有研究发现，内毒素休克时心肌蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性升高。PKC是细胞内肌醇磷脂信号传递中的关键环节之一。其主要与心肌负性肌力效应有关。钙离子可以激活PKC，反过来PKC可以通过电压依赖性钙通道刺激钙离子的内流。
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有研究者发现，脓毒血症时大鼠心肌组织以及血浆中肾上腺素、血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)、内皮素和血栓素A2(TXA2) 含量明显升高。 它们通过激活各自相应的受体而发挥生物学效应。有文献报道，肾上腺素能α1受体、AngⅡ的AT1受体、内皮素受体以及TXA2受体等与百日咳毒素不敏感的Gαq/11蛋白偶联。脓毒血症时这些受体的激活是否导致Gαq/11的变化，尚未见报道。我们的工作表明，ES时心脏Gαq/11表达有增加的趋势，LS 时明显升高。这表明脓毒血症确可引起心脏Gαq/11的表达增加。而心脏Gαq/11增加时相与心肌舒缩能力降低时相密切相关，提示肌醇磷脂信号转导系统的功能异常可能是导致心功能障碍发生的重要原因。
已有研究发现感染性休克时氧自由基升高。我们亦观察到ES、LS时 MDA含量明显升高，提示心肌已受到脂质过氧化损伤。而脂质过氧化产物的增加是否通过激活Gαq/11导致心功能障碍，目前尚不明确，有待于进一步研究。
* 美国中华医学基金(CMB)和国家自然科学基金资助(No.39570301)
△ 北京医学高等专科学校 (北京101300)
1998年7月17日收稿，1999年元月11日修回, 百拇医药