缺氧及烧伤大鼠血清对培养的乳鼠细胞间隙连接通讯的影响*
作者：王旭 迟路湘 吴军 杨宗城
单位：第三军医大学西南医院烧伤研究所 (重庆 400038)
关键词：
细胞间隙连接通讯 细胞间隙连接通讯(GJIC)是一种近距离的细胞间通讯方式，主要传递组织或细胞群体内基因信号，对细胞的正常增殖、分化和代谢功能以及组织自身稳定等起着重要调节作用。我们利用划痕标记染料示踪技术和扫描电镜，观察培养乳鼠心肌细胞在缺氧、烧伤血清刺激下的早期动态变化。
材料与方法
1.乳鼠心肌细胞培养及实验分组：出生48 h以内的乳鼠，剥离心包膜，留心尖部剪碎，加入常规消化液37 ℃ 10 min，以1×108/L的密度种植，5% CO2培养箱常规培养。
, 百拇医药
心肌细胞培养1周，待单层细胞覆盖密度趋于饱和时进行致伤。(1)对照组：心肌细胞常规培养7 d，于1 h\,3 h\,6 h收集标本；(2)单纯缺氧组：细胞培养7 d，将5% CO2改换成92%
国家自然科学基金重大项目(39290700-03)
N2，4% O2，4% CO2混合气体充入培养皿中，模拟缺氧环境，致伤后1 h\,3h\,6 h收集标本；(3)单纯烧伤血清组：细胞培养7 d，吸除培养液，改加含10%大鼠烧伤血清DMEM培养液(30%体表面积Ⅲ度烧伤后48 h内血清)，致伤后1 h\,3 h\,6 h收集标本；(4)双因素致伤组：将常规培养至第7 d的心肌细胞，改换含10%大鼠烧伤血清DMEM培养液，充入混合气取代有氧培养，于伤后1 h\,3 h\,6 h收集标本进行检测。
2.划痕标记染料示踪技术(SLDT)检测DJIC：致伤结束时吸除培养液，PBS液(pH 7.2)冲洗3次，用手术刀在盖玻片上轻轻划痕数条，相距约2 mm，将含有0.05 % Lucifer-yellow(LY, Sigma产品)的PBS溶液2 mL加入平皿3 min。吸净荧光染料，PBS漂洗2次，欧林巴斯荧光显微镜下观察，照像。
, 百拇医药
3.扫描电镜：将致伤后的心肌细胞用2.5%戊二醛固定24 h，1%锇酸后固定1 h，乙醇系列脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，离子喷镀后在JSM-T 300型扫描电镜下观察并摄片。
结果
1.心肌细胞培养：单细胞种植20 h，部分细胞贴壁伸展，有多个细而长的触突，博动明显但频率不一，5～7 d后单层细胞覆盖整个玻片，相近细胞博动频率逐渐一致。
2.致伤后心肌细胞GJIC功能的变化：正常乳鼠心肌细胞培养后具有细胞间隙连接通讯功能，LY荧光染料传递划痕标记附近5例细胞。由划痕处即染料传输前沿，荧光染料浓度由近及远逐渐因消耗而降低，荧光强度逐渐减弱。未划痕区细胞无荧光标记现象。
实验组心肌细胞在致伤后1 h，即表现出GJIC功能传导阻滞，着色细胞与划痕线之间距离缩短，呈点状横向排列。随致伤时间延长，荧光染料停滞在划痕边沿不再扩展，提示心肌GJIC功能受到抑制(表1)。
, 百拇医药
表1 心肌细胞致伤后GJIC功能的变化
Tab 1 Effect of hypoxia, burnt serum on gap junctional intercellular communication in cultured cardiomyocytes
Time
(postburn)
Control
Hypoxia
Burnt
serum
Hypoxia and
, http://www.100md.com burnt serum
1 h
+++
++
+++
+
3 h
+++
+
++
-
6 h
+++
, 百拇医药 -
+
-
“-”:The LY fluorescence was limited to the primary loades cell
“+～+++”：Transfer of LY fluorescence reached some rows of cells from the scraped line;LY=Lucifer-yellow
3.扫描电镜下心肌细胞的形态学改变：正常心肌细胞呈梭形、柱状或多角形，多伪足，彼此连接紧密。细胞边缘微绒毛丰富，细胞表面微嵴分布均一，密度中等。致伤后，心肌细胞表面微嵴分布紊乱，有嵴消失小区或微嵴致密。细胞膜边缘变厚，细胞伪足和微绒毛减少或断裂，细胞间彼此分离，呈脱落前征象，尤以缺氧复合烧伤血清组最为明显。
, 百拇医药
讨论
GJIC的结构基础是间隙连接，彼此相邻的微孔对接构成细胞内质的通道，其驱动力依赖于不同电荷分子化学浓度的级差。LY染料的传输现象代表细胞间隙连接通讯的功能。
GJIC功能下降常通过细胞功能下降或细胞膜连接通道的直接损伤表现出来。扫描电镜结果提示，损伤后心肌细胞的间隙连接通道可能只有少部分相连甚至完全不连，导致连接通讯传导阻滞。该结果提供了心肌细胞间GJIC功能抑制的直接证据。
单纯缺氧或单纯烧伤血清刺激均可直接损伤培养的心肌细胞。当两种作用叠加在一起时，细胞损伤程度更加明显，并随时间延长而加重。缺氧及烧伤血清直接损伤心肌细胞的机制尚不十分清楚，可能的原因有：(1)细胞缺氧导致能量饥饿、水肿、骨架断裂。(2)烧伤血清是含有多种毒性成分的混合液，如组织毒或细菌毒，干扰细胞膜的正常功能引起细胞肿胀坏死。心肌细胞间隙连接的存在，可保证心肌组织同步有序地收缩。
因此，作者认为烧伤后心肌细胞GJIC功能降低，心肌电机械代谢耦合功能障碍是心肌非均一性行为增强的病理基础。
此外，在细胞受损完全分离的情况下，显微镜下仍可见到少许阳性LY荧光标记细胞，提示细胞间除直接通讯外，可能还有光通讯或细胞体液中被释放的特殊多肽物质，行使着传递信息的特定语言，GJIC只是其中的一种主要通讯方式。
1998年5月18日收稿，1998年10月26日修回, 百拇医药
单位：第三军医大学西南医院烧伤研究所 (重庆 400038)
关键词：
细胞间隙连接通讯 细胞间隙连接通讯(GJIC)是一种近距离的细胞间通讯方式，主要传递组织或细胞群体内基因信号，对细胞的正常增殖、分化和代谢功能以及组织自身稳定等起着重要调节作用。我们利用划痕标记染料示踪技术和扫描电镜，观察培养乳鼠心肌细胞在缺氧、烧伤血清刺激下的早期动态变化。
材料与方法
1.乳鼠心肌细胞培养及实验分组：出生48 h以内的乳鼠，剥离心包膜，留心尖部剪碎，加入常规消化液37 ℃ 10 min，以1×108/L的密度种植，5% CO2培养箱常规培养。
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心肌细胞培养1周，待单层细胞覆盖密度趋于饱和时进行致伤。(1)对照组：心肌细胞常规培养7 d，于1 h\,3 h\,6 h收集标本；(2)单纯缺氧组：细胞培养7 d，将5% CO2改换成92%
国家自然科学基金重大项目(39290700-03)
N2，4% O2，4% CO2混合气体充入培养皿中，模拟缺氧环境，致伤后1 h\,3h\,6 h收集标本；(3)单纯烧伤血清组：细胞培养7 d，吸除培养液，改加含10%大鼠烧伤血清DMEM培养液(30%体表面积Ⅲ度烧伤后48 h内血清)，致伤后1 h\,3 h\,6 h收集标本；(4)双因素致伤组：将常规培养至第7 d的心肌细胞，改换含10%大鼠烧伤血清DMEM培养液，充入混合气取代有氧培养，于伤后1 h\,3 h\,6 h收集标本进行检测。
2.划痕标记染料示踪技术(SLDT)检测DJIC：致伤结束时吸除培养液，PBS液(pH 7.2)冲洗3次，用手术刀在盖玻片上轻轻划痕数条，相距约2 mm，将含有0.05 % Lucifer-yellow(LY, Sigma产品)的PBS溶液2 mL加入平皿3 min。吸净荧光染料，PBS漂洗2次，欧林巴斯荧光显微镜下观察，照像。
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3.扫描电镜：将致伤后的心肌细胞用2.5%戊二醛固定24 h，1%锇酸后固定1 h，乙醇系列脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，离子喷镀后在JSM-T 300型扫描电镜下观察并摄片。
结果
1.心肌细胞培养：单细胞种植20 h，部分细胞贴壁伸展，有多个细而长的触突，博动明显但频率不一，5～7 d后单层细胞覆盖整个玻片，相近细胞博动频率逐渐一致。
2.致伤后心肌细胞GJIC功能的变化：正常乳鼠心肌细胞培养后具有细胞间隙连接通讯功能，LY荧光染料传递划痕标记附近5例细胞。由划痕处即染料传输前沿，荧光染料浓度由近及远逐渐因消耗而降低，荧光强度逐渐减弱。未划痕区细胞无荧光标记现象。
实验组心肌细胞在致伤后1 h，即表现出GJIC功能传导阻滞，着色细胞与划痕线之间距离缩短，呈点状横向排列。随致伤时间延长，荧光染料停滞在划痕边沿不再扩展，提示心肌GJIC功能受到抑制(表1)。
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表1 心肌细胞致伤后GJIC功能的变化
Tab 1 Effect of hypoxia, burnt serum on gap junctional intercellular communication in cultured cardiomyocytes
Time
(postburn)
Control
Hypoxia
Burnt
serum
Hypoxia and
, http://www.100md.com burnt serum
1 h
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“-”:The LY fluorescence was limited to the primary loades cell
“+～+++”：Transfer of LY fluorescence reached some rows of cells from the scraped line;LY=Lucifer-yellow
3.扫描电镜下心肌细胞的形态学改变：正常心肌细胞呈梭形、柱状或多角形，多伪足，彼此连接紧密。细胞边缘微绒毛丰富，细胞表面微嵴分布均一，密度中等。致伤后，心肌细胞表面微嵴分布紊乱，有嵴消失小区或微嵴致密。细胞膜边缘变厚，细胞伪足和微绒毛减少或断裂，细胞间彼此分离，呈脱落前征象，尤以缺氧复合烧伤血清组最为明显。
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讨论
GJIC的结构基础是间隙连接，彼此相邻的微孔对接构成细胞内质的通道，其驱动力依赖于不同电荷分子化学浓度的级差。LY染料的传输现象代表细胞间隙连接通讯的功能。
GJIC功能下降常通过细胞功能下降或细胞膜连接通道的直接损伤表现出来。扫描电镜结果提示，损伤后心肌细胞的间隙连接通道可能只有少部分相连甚至完全不连，导致连接通讯传导阻滞。该结果提供了心肌细胞间GJIC功能抑制的直接证据。
单纯缺氧或单纯烧伤血清刺激均可直接损伤培养的心肌细胞。当两种作用叠加在一起时，细胞损伤程度更加明显，并随时间延长而加重。缺氧及烧伤血清直接损伤心肌细胞的机制尚不十分清楚，可能的原因有：(1)细胞缺氧导致能量饥饿、水肿、骨架断裂。(2)烧伤血清是含有多种毒性成分的混合液，如组织毒或细菌毒，干扰细胞膜的正常功能引起细胞肿胀坏死。心肌细胞间隙连接的存在，可保证心肌组织同步有序地收缩。
因此，作者认为烧伤后心肌细胞GJIC功能降低，心肌电机械代谢耦合功能障碍是心肌非均一性行为增强的病理基础。
此外，在细胞受损完全分离的情况下，显微镜下仍可见到少许阳性LY荧光标记细胞，提示细胞间除直接通讯外，可能还有光通讯或细胞体液中被释放的特殊多肽物质，行使着传递信息的特定语言，GJIC只是其中的一种主要通讯方式。
1998年5月18日收稿，1998年10月26日修回, 百拇医药