心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因在大肠杆菌中的表达*
作者：李 芳 朱世军 于康振 王孝铭 陈化南 孙明智
单位：李 芳 朱世军 王孝铭 孙明智 哈尔滨医科大学病理生理教研室(哈尔滨150086)；于康振 陈化南 兽医生物技术国家重点实验室
关键词：
心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因 在大肠杆菌中的表达 随着临床冠状动脉旁路术、经皮冠状动脉成形术以及溶栓术的应用，虽然挽救了许多心肌缺血性疾病患者的生命，但是也应运而出现了“再灌注损伤”问题。目前，人们认识到能量代谢障碍是造成心肌再灌注后细胞及亚细胞损伤的重要始动因素[1]，而心肌线粒体肌酸激酶与能量代谢密切相关，它位于线粒体内外膜之间，内膜外表面上，是线粒体ATP的产生、利用、转换和贮存的关键酶[2]。其中线粒体肌酸激酶肌膜型亚基(sMiMi-CK)只存在于心肌线粒体中，并能高效表达[3]。故我们以此为重点在体外表达sMiMi-CK，从而为缺血性心脏病的治疗开辟一条基因治疗的新途径。
, 百拇医药
材料与方法
1.质粒和菌株：受体菌DH5α和表达载体PBV220均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家生物技术重点实验室提供。
2.试剂：限制性内切酶系购自华美公司，T4DNA Ligase购自Promega公司。
3.重组表达质粒PBV 220的构建：用组建的已测序的PUC 19重组子，经EcoRⅠ、Hind Ⅲ酶切后，获得sMiMi-CK cDNA片段，将该片段补平，经T4DNA Ligase连接构建重组子PBV 220，转化入感受态大肠杆菌DH5α中，提取重组质粒用限制性内切酶图谱分析筛选获得方向插入正确的重组菌。
4.目的基因的诱导表达：将重组质粒sMiMi-CK及质粒载体PBV 220分别转化到感受态的DH5α中，经37℃活化过夜后，1∶100稀释到LB培养液中，继续在37℃摇床培养至OD=0.2～0.6，迅速转到42℃摇床培养4～6 h，收集菌体，进行SDS-PAGE和凝胶密度扫描分析测定蛋白含量。
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5.表达产物活性的测定：收集的菌体用7 mol/L盐酸胍-50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解，然后以17 000 r/min离心15 min，弃沉淀，用NADPH紫外分光光度法在生化自动分析仪上检测sMiMi-CK活性。
结果
1.重组表达质粒的构建：将已鉴定测序的sMiMi-CK基因与表达载体PBV 220进行平端连接，得到重组质粒，电泳大小见图1，用EcoRⅠ、Sal Ⅰ进行酶切，得到外源基因1.33 kb和表达载体3.69 kb的片段，见图2。再用BaH Ⅰ酶切，得到3.7 kb，1.1 kb及0.2 kb左右的带，证明sMiMi-CK基因在重组质粒中为正向连接，见图3。
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Fig 1 Analysis of recombinant plasmid by single enzyme digestion
A. λDNA/Hind Ⅲ Marker；B. PBV 220-sMiMi-CK/EcoR Ⅰ；C. PBV 220-sMiMi-CK/Sal Ⅰ；D. PBV 220-sMiMi-CK/Cla Ⅰ
图1 重组质粒的单酶切鉴定
Fig 2 Analysis of recombinant plasmid by double enzyme digestion；A. λDNA/Hind Ⅲ Marker；B.PBV 220-sMiMi-CK/EcoRⅠ+Sal Ⅰ
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图2 重组质粒的双酶切鉴定
Fig 3 Identification of pBV 220-sMiMi-CK insert direction by BamH Ⅰ digestion
A.λDNA/Hind Ⅲ Marker；B.PBV 220-sMiMi-CK/BamH Ⅰ
图3 sMiMi-CK基因插入方向的判定
2.sMiMi-CK基因蛋白的诱导：将含有sMiMi-CK基因的表达载体PBV 220，经温度诱导后培养，收集菌体裂解，进行SDS-PAGE电泳，结果见图4，未诱导的菌体中没有sMiMi-CK的表达，而诱导的菌体中有明显的sMiMi-CK的蛋白带，分子量约为45.8×103左右。
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Fig 4 Analysis of expression products by SDS-PAGE
A. molecular weight standards；B.plasmid PBV220；C.before temperature induction；D， E. 4 hours after temperature induction
图4 sMiMi-CK基因表达产物的SDS-PAGE分析
3.诱导蛋白表达量的测定：诱导的sMiMi-CK蛋白得到了高效表达，其电泳凝胶经密度扫描仪分析，sMiMi-CK蛋白表达量占大肠杆菌总蛋白的10.7%。
4.表达蛋白质的活性测定：用含7 mol/L盐酸胍50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)裂解细胞，在生化自动分析仪上测活性，得到活性为2.74×105 IU/L菌液。
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讨论
利用大肠杆菌(E.coli)来合成某些生物分子，具有低成本、高效率、周期短等特点，已越来越成为人们研究的热门领域。但是，在利用E.coli表达外源基因的过程中，往往会遇到许多困难，使表达效率难以得到最大限度的提高，因而影响了产率[4]。
我们采用DNA重组技术构建了PBV 220-sMiMi-CK表达质粒，表达了sMiMi-CK非融合蛋白，扫描分析结果证明表达量占大肠杆菌总蛋白的10.7%，并测得其活性为2.74×105 IU/L菌液，表明真正获得了sMiMi-CK蛋白质。
随着生物技术的发展，基因工程已经开始与医药生产、疾病的治疗有了紧密的结合，基因治疗则是近几年刚刚起步，比较吸引人的课题。有文献报道[5]，心功能衰竭，心肌肥大时，肌酸激酶活性下降，我们以前的实验结果为缺血/再灌注时，sMiMi-CK表达减少，从而推测其活性下降，这为能量代谢障碍，如心衰、心肌肥大，尤其是缺血性心脏病的基因治疗开辟了一条新路，前景为：(1)可以直接应用廉价的sMiMi-CK基因在体外的表达产物来增加体内sMiMi-CK的量，进而改善线粒体内能量代谢障碍，保护心肌细胞减轻或避免心肌缺血/再灌注损伤；(2)可将重组该基因的真核表达载体经纯化后，输入体内，使其在体内产生sMiMi-CK，以补充sMiMi-CK的数量，从而改善心肌缺血/再灌注损伤。
, 百拇医药
* 黑龙江省自然科学基金资助：D09613
参考文献
1 张 桦，王孝铭，刘树森.能量转换障碍与心肌缺血再灌注损伤——呼吸链电子传递与质子的变化.中国病理生理杂志，1991，7：157.
2 Robert C, Cllfford K, Zhifang Z, et al. Isolation and characterization of the gene and cDNA encoding human mitochondrial creatine kinase. J Biol Chem, 1989, 264:2890.
3 Mark R, Robert C, Arnold W, et al. Structural characterization and tissue-specific expression of the mRNA encoding isoenzymes from two rat mitochondrial creatine kinase gene. Biochim Biphys Acta, 1991, 1089:352.
, 百拇医药
4 张智清，姚立江，候云德.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用.病毒学报，1990，6：11.
5 Rong T, Luigino N, Rimai K, et al. Depletion of energy reserve via the creatine kinase reaction during the evolution of heart failure in cardiomyopathic hamsters. J Moll Cell Cardial, 1996, 28:755.
(1998年9月10日收稿，1998年12月25日修回), 百拇医药
单位：李 芳 朱世军 王孝铭 孙明智 哈尔滨医科大学病理生理教研室(哈尔滨150086)；于康振 陈化南 兽医生物技术国家重点实验室
关键词：
心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因 在大肠杆菌中的表达 随着临床冠状动脉旁路术、经皮冠状动脉成形术以及溶栓术的应用，虽然挽救了许多心肌缺血性疾病患者的生命，但是也应运而出现了“再灌注损伤”问题。目前，人们认识到能量代谢障碍是造成心肌再灌注后细胞及亚细胞损伤的重要始动因素[1]，而心肌线粒体肌酸激酶与能量代谢密切相关，它位于线粒体内外膜之间，内膜外表面上，是线粒体ATP的产生、利用、转换和贮存的关键酶[2]。其中线粒体肌酸激酶肌膜型亚基(sMiMi-CK)只存在于心肌线粒体中，并能高效表达[3]。故我们以此为重点在体外表达sMiMi-CK，从而为缺血性心脏病的治疗开辟一条基因治疗的新途径。
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材料与方法
1.质粒和菌株：受体菌DH5α和表达载体PBV220均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家生物技术重点实验室提供。
2.试剂：限制性内切酶系购自华美公司，T4DNA Ligase购自Promega公司。
3.重组表达质粒PBV 220的构建：用组建的已测序的PUC 19重组子，经EcoRⅠ、Hind Ⅲ酶切后，获得sMiMi-CK cDNA片段，将该片段补平，经T4DNA Ligase连接构建重组子PBV 220，转化入感受态大肠杆菌DH5α中，提取重组质粒用限制性内切酶图谱分析筛选获得方向插入正确的重组菌。
4.目的基因的诱导表达：将重组质粒sMiMi-CK及质粒载体PBV 220分别转化到感受态的DH5α中，经37℃活化过夜后，1∶100稀释到LB培养液中，继续在37℃摇床培养至OD=0.2～0.6，迅速转到42℃摇床培养4～6 h，收集菌体，进行SDS-PAGE和凝胶密度扫描分析测定蛋白含量。
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5.表达产物活性的测定：收集的菌体用7 mol/L盐酸胍-50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解，然后以17 000 r/min离心15 min，弃沉淀，用NADPH紫外分光光度法在生化自动分析仪上检测sMiMi-CK活性。
结果
1.重组表达质粒的构建：将已鉴定测序的sMiMi-CK基因与表达载体PBV 220进行平端连接，得到重组质粒，电泳大小见图1，用EcoRⅠ、Sal Ⅰ进行酶切，得到外源基因1.33 kb和表达载体3.69 kb的片段，见图2。再用BaH Ⅰ酶切，得到3.7 kb，1.1 kb及0.2 kb左右的带，证明sMiMi-CK基因在重组质粒中为正向连接，见图3。
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Fig 1 Analysis of recombinant plasmid by single enzyme digestion
A. λDNA/Hind Ⅲ Marker；B. PBV 220-sMiMi-CK/EcoR Ⅰ；C. PBV 220-sMiMi-CK/Sal Ⅰ；D. PBV 220-sMiMi-CK/Cla Ⅰ
图1 重组质粒的单酶切鉴定
Fig 2 Analysis of recombinant plasmid by double enzyme digestion；A. λDNA/Hind Ⅲ Marker；B.PBV 220-sMiMi-CK/EcoRⅠ+Sal Ⅰ
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图2 重组质粒的双酶切鉴定
Fig 3 Identification of pBV 220-sMiMi-CK insert direction by BamH Ⅰ digestion
A.λDNA/Hind Ⅲ Marker；B.PBV 220-sMiMi-CK/BamH Ⅰ
图3 sMiMi-CK基因插入方向的判定
2.sMiMi-CK基因蛋白的诱导：将含有sMiMi-CK基因的表达载体PBV 220，经温度诱导后培养，收集菌体裂解，进行SDS-PAGE电泳，结果见图4，未诱导的菌体中没有sMiMi-CK的表达，而诱导的菌体中有明显的sMiMi-CK的蛋白带，分子量约为45.8×103左右。
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Fig 4 Analysis of expression products by SDS-PAGE
A. molecular weight standards；B.plasmid PBV220；C.before temperature induction；D， E. 4 hours after temperature induction
图4 sMiMi-CK基因表达产物的SDS-PAGE分析
3.诱导蛋白表达量的测定：诱导的sMiMi-CK蛋白得到了高效表达，其电泳凝胶经密度扫描仪分析，sMiMi-CK蛋白表达量占大肠杆菌总蛋白的10.7%。
4.表达蛋白质的活性测定：用含7 mol/L盐酸胍50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)裂解细胞，在生化自动分析仪上测活性，得到活性为2.74×105 IU/L菌液。
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讨论
利用大肠杆菌(E.coli)来合成某些生物分子，具有低成本、高效率、周期短等特点，已越来越成为人们研究的热门领域。但是，在利用E.coli表达外源基因的过程中，往往会遇到许多困难，使表达效率难以得到最大限度的提高，因而影响了产率[4]。
我们采用DNA重组技术构建了PBV 220-sMiMi-CK表达质粒，表达了sMiMi-CK非融合蛋白，扫描分析结果证明表达量占大肠杆菌总蛋白的10.7%，并测得其活性为2.74×105 IU/L菌液，表明真正获得了sMiMi-CK蛋白质。
随着生物技术的发展，基因工程已经开始与医药生产、疾病的治疗有了紧密的结合，基因治疗则是近几年刚刚起步，比较吸引人的课题。有文献报道[5]，心功能衰竭，心肌肥大时，肌酸激酶活性下降，我们以前的实验结果为缺血/再灌注时，sMiMi-CK表达减少，从而推测其活性下降，这为能量代谢障碍，如心衰、心肌肥大，尤其是缺血性心脏病的基因治疗开辟了一条新路，前景为：(1)可以直接应用廉价的sMiMi-CK基因在体外的表达产物来增加体内sMiMi-CK的量，进而改善线粒体内能量代谢障碍，保护心肌细胞减轻或避免心肌缺血/再灌注损伤；(2)可将重组该基因的真核表达载体经纯化后，输入体内，使其在体内产生sMiMi-CK，以补充sMiMi-CK的数量，从而改善心肌缺血/再灌注损伤。
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* 黑龙江省自然科学基金资助：D09613
参考文献
1 张 桦，王孝铭，刘树森.能量转换障碍与心肌缺血再灌注损伤——呼吸链电子传递与质子的变化.中国病理生理杂志，1991，7：157.
2 Robert C, Cllfford K, Zhifang Z, et al. Isolation and characterization of the gene and cDNA encoding human mitochondrial creatine kinase. J Biol Chem, 1989, 264:2890.
3 Mark R, Robert C, Arnold W, et al. Structural characterization and tissue-specific expression of the mRNA encoding isoenzymes from two rat mitochondrial creatine kinase gene. Biochim Biphys Acta, 1991, 1089:352.
, 百拇医药
4 张智清，姚立江，候云德.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用.病毒学报，1990，6：11.
5 Rong T, Luigino N, Rimai K, et al. Depletion of energy reserve via the creatine kinase reaction during the evolution of heart failure in cardiomyopathic hamsters. J Moll Cell Cardial, 1996, 28:755.
(1998年9月10日收稿，1998年12月25日修回), 百拇医药