心肌细胞分离术*
作者：陈吉球
单位：桂林医学院病理生理学教研室, (桂林 541001)
关键词：
心肌细胞分离术 心肌细胞分离方法在不断得到改进。根据实验目的的不同，不断调整分离程序及方法[1～3]。但要得到高产量，有持久(>2 h)兴奋性和收缩功能的心肌细胞，仍不是一件容易的事[3]，尤其是我们在整体或离体心脏复制各种疾病模型(缺血，心肌肥大等)，要在单心肌细胞功能方面研究其病理生理机制时。胶原 酶消化分离出的心肌细胞在产量及活力方面受胶原酶, 缓冲液成分,pH,温度,灌流量及消化时间的影响[3，4]。 胶原酶液对心肌组织的灌流量及时间比较不易掌握, 从而影响心肌细胞的产量及收缩功能。胶原酶液灌流量及消化时间视动物种属，心脏大小而不同。用什么来比较客观地反映灌注及消化的度量，从而得到功能稳定，重复性好的心肌细胞，这方面的报道不多。本人根据在美国Allegheny大学Dr. Vatner实验室工作的经验,总结分离小鼠,大鼠,兔子,狗，羊及人心肌细胞的方法, 供读者参考。
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一、成年小鼠心肌细胞的分离[3]：
1. Langendorff 装置的改进(图1)。 如图1所示，用灌流泵将缓冲液泵入保温杯中，通过三通 2 调节保温杯内液面，过高浪费酶液，过低则易进入空气。在流出道外口装压力换能器，经显示器监测压力变化。通过灌流泵的流速，调节基础压力的大小。
Fig 1 Amelioration of Langendorff perfution system.
1.Glass jacked container;2.stopcut; 3.transducer; 4.manometer; 5.heart; 6.95%O2+5%CO2;7. thermostat; 8.thermostatic water bath; 9.buffer solution; 10.pump
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图1 Langendorff装置的改进
2. 小鼠 (2～6 月. 25～35 g), 肝素5 000 U/kg ip 。 20 min 后颈关节脱位处死。开胸取出心脏,于无Ca2+台氏液(mmol/L) NaCl 132, KCl 4.8, Glucose 5, MgCl2 6， H2O 1.2, HEPEs 10,pH=7.4)中清洗两次。剪去肺残叶及脂肪。主动脉逆行插管，用 37℃无Ca2+台氏液灌5 min,流量2～3 mL/min, 压力应为3.990～5.054 kPa。通过台氏液连续给95% O2+5% CO2混合气体。
3. 用胶原酶液[collagenase Ⅰ 0.5 mg/mL(148 U/mg),collagenase Ⅱ 0.27 mg/mL(273 U/mg, Worthington)],牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA 0.1%), 小牛血清(calf serum 0.015%) 40 mL灌流17～19 min(慢性缺氧小鼠约13～15 min, 年老或转基因心衰鼠19～21 min)。 若灌流得好, 心脏鲜红稍带黄， 若有黄白斑点,说明有栓塞。酶液进入心脏2 min后压力开始上升,5～7 min渐升至6.650～7.980 kPa。然后渐下降，约18 min降至3.72 kPa，此时心脏松软鲜红，即取下心脏。若压力尚高于3.990 kPa，表示消化不足，产量会较低。若时间过长，压力低于3.325 kPa,细胞将明显受损，出现不规则自律收缩，功能下降。
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4.取下心脏于含0.1% BSA,0.015%小牛血清的台氏液中剪去心房及右心室。用针头将左心室肌划碎,移于10 mL试管中。先吸悬液移至另一试管。再加上液,用吸管轻轻冲吸, 使小块组织变为细胞悬液,移至另一试管。再洗1次得第3管。剩下少量网状结缔组织,弃之。10 min 后细胞自然沉降,去上清。用5 mL含0.4 mmol/L Ca2+的台氏液轻轻冲洗。再隔10 min去上清,加入5 mL含0.8 mmol/L Ca2+的台氏液。第2管细胞最好。杆形有收缩功能细胞可达60%～75%。室温(22～23℃)下记录细胞收缩功能。此细胞可连续跳动2～4 h 。
二、成年大鼠心肌细胞分离术[5]：
大鼠经苯巴比妥钠30 mg/kg ip麻醉,1 000 U/mL肝素0.3～0.4 mL iv。开胸取心脏,用37 ℃无Ca2+K-H液(mmol/L)NaCl 130, KCl 4.8,MgSO4 1.2,NaHCO3 2.5, NaH2PO4- H2O 1.2, Glucose 12.5, HEPEs 12, pH=7.4)洗2次。再以4.656～5.320 kPa压力(7～8 mL/min)经主动脉 灌注心脏5 min。 用50 mL胶原酶液-1 [collagenase Ⅱ 0.43 mg/mL(273 U/mg), hyaluronidase 0.3 mg/mL,溶于无Ca2+ K-H液中]循环灌注心脏20 min。3 min后压力渐升至7.980～9.310 kPa,然后又降至5.985 kPa左右。用酶液-2(trypsin 2 mg/mL,DNase 0.2 mg/mL溶于酶液-1 中)20 mL循环灌流 10 min。取下心脏, 在含0.2% BSA, 0.3 mmoL/L Ca2+的K-H液中剪去心房及右心室。将左心室剪成数片，用针头轻轻划碎后洗3次。10～15 min后,弃上清,用5 mL含0.6 mmol/L Ca2+的K-H液洗沉降之细胞。10 min后再用含1.0 mmol/L Ca2+的K-H液洗细胞, 此时细胞鲜红。第2管细胞收缩功能最好，杆形细胞率在90%以上。此细胞可连续跳动4～8 h 。
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三、狗心肌细胞分离术[2]：
1. 狗经苯巴比妥钠 30 mg/kg iv麻醉,1 000 U/mL肝素10 mL iv。气管插管，人工呼吸，开胸取出心脏。置于4℃无钙K-H液中，剪去心房及右心室。 在左右心交界右侧旁开 1 cm 纵行剪开室间隔及主动脉。在主动脉根部找到冠状动脉入口。沿冠状动脉前降支或左旋支两侧剪下宽长3 cm×6 cm心肌组织。用16 G针头外套胶管连三通及60 mL注射器插入冠状动脉 1.5 cm。用2号针线缝扎固定胶管。用温无Ca2+ K-H液经三通冲洗心肌组织。用3号针线缝扎心肌周边血管， 使组织各部位毛细血管灌流充分,此步关键。
2.用无Ca2+ K-H液灌注(12～15 mL/min) 5 min。此时压力在1.995～2.349 kPa。 用酶液-1(collagenase Ⅱ 0.57 mg/mL,溶于无Ca2+ K-H液中)240 mL循环消化20～ 22 min。消化开始后3 min 压力渐上升至6.650～7.980 kPa, 有时可达10.64～13.30 kPa。如果压力上升不超过 2.660 kPa,说明缝扎有误,毛细血管灌流很差,多导致失败。22 min后压力不一定能降到3.990～5.320 kPa，此时心肌肿胀,触之有紧张感。于心肌块中部靠远端由内膜向取组织2 cm×2 cm×2 cm。在酶液-2中剪碎。于50 mL试管中, 用20 mL酶液-2( 2.5 % BSA, 0.3 mmol/L Ca2+, Collagenase Ⅱ 0.23 mg/mL, 溶于无Ca2+ K-H液),于37 ℃, 温浴消化5 min,充95% O2+5% CO2。取上层悬液,于另一试管中, 1 000 r/min离心1 min。弃上清,用 20 mL含1%BSA,0.6 mmol/L Ca2+的K-H液洗细胞。酶液2消化洗脱细胞重复4次。 10 min后,各管弃上清,加入15 mL含1.0 mmol/L Ca2+的K-H液。
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四、羊及人心肌细胞的分离：
分离程序与狗的基本相同。用酶液-1(collagenase Ⅰ 0.5 mg/mL, collagenase Ⅱ 0.27 mg/mL, BSA 0.1%, 小牛血清 0.015%)消化时间为28～30 min。压力可从开始的 1.995～2.660 kPa上升至6.650～7.890 kPa, 然后下降至3.990～4.655 kPa。再用酶液-2(collagenaseⅠ0.2 mg/mL,collagenase Ⅱ 0.11 mg/mL, BSA 2.5%, CaCl2 0.3 mmol/L) 消化10 min。羊或人的心肌组织较狗的脆弱，缝扎及消化的度不易掌握,尤其在缺血梗塞较重或取材后滞留较久的组织。
五、兔心肌细胞分离术：
用大鼠的配方。可经主动脉逆行灌注,也可剪开主动脉,经冠状动脉插管直接灌注,后者与狗的相似。
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讨论
1.在恒流灌注时,压力变化是一个反映灌流和消化程度的重要指标, 尤其在小鼠,狗,羊和人心肌。小鼠主动脉较细,插管有一定难度，可把针头横断面磨斜15度角。注意防止插管入左心室。如果插管通过主动脉瓣, 用台氏液灌流时, 压力会大于5.985 kPa,加入酶液后会超过10.640 kPa。此时由于室内压高,使心内膜无法得到良好的灌注,细胞产量会很低。 如果开始灌注压力低于 3.325 kPa, 而流量已达 3 mL/min, 说明有漏洞,应再结扎或重挂。大鼠插管比较容易,个体间压力变化的差异不大,注意排出气泡就行。狗,羊,人心肌块灌流后压力低于2.995 kPa,说明仍有较大的血管漏。用注射器推注看清后再缝扎。有时得不到完整的冠状动脉入口,心肌块动脉又较细,可从静脉插管灌注。
2.胶原酶collagenases是分离心肌细胞的最主要成份。厂家,活性,批号都对实验有较大影响[2，3]。用一种新批号,要经过一段预试,才能确定最佳浓度。一旦确定下来,不宜轻意改动。CollagenaseⅡ比Ⅰ的消化力强得多。各动物种属的敏感性也不一样,可根据条件及经验调整配方。Collagenase需要Ca2+的激活[1]。文献上常在酶溶液中加入微量的Ca2+(30～200 μmol/L)[4，5]。但在我们的经验中，不用加Ca2+也能得到形态功能很好的细胞。这是由于内源性的Ca2+也足以激活Collegenase。白蛋白具有保护细胞膜的作用，可减轻酶对细胞的损伤。另一方面,通过悬浮作用,使细胞较易与细胞膜碎片分离开来,得到清晰的细胞。白蛋白浓度过大,会抑制细胞的兴奋性。
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3. Ca2+：心肌细胞是在无Ca2+或微Ca2+条件下分离的。要使心肌细胞具有收缩功能,应在心肌细胞分离出来后半小时内,逐渐增加钙离子至生理浓度。若得到细胞后不及时复钙,随着时间的延长,细胞的兴奋性和收缩性会下降,尤其是兴奋性。溶液：水的质量很重要[3]，应用双蒸去离子水。台氏液可用于小鼠,也可用于大鼠[1，2]。K-H液可用于大鼠,兔，狗,羊,也可用于小鼠，对细胞产量无太大影响，但一旦确定,不宜随便更改。温度：小鼠心脏从胸腔取出后,应用温(33℃)台氏液洗两次。此时若用4℃台氏液洗,由于主动脉收缩,会使插管变得很困难。用温台氏液,心脏仍有些搏动,易于分辨主动脉并插管。狗,羊及人心脏标本可在0～4℃营养液中保存12 h,仍能分离到有收缩功能的细胞。已分离的细胞在室温(22～23℃)比在37℃,具有更稳定的兴奋性和收缩性。
* 国家自然科学基金资助 No 39460029
, 百拇医药
参考文献
1 Bkaily G, Sperelakis N, Doane J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes.Am J Physiol, 1984, 247:H1018.
2 Tytgat J.How to isolate cardiac myocytes.Cardiovasc Res，1994,28:280.
3 Wolska BM，Solaro RJ.Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.Am J Physiol, 1996, 271:H1250.
4 Spanier AM, Weglicki WB. Ca2+ tolerant adult canine myocytes:preparation and response to anoxia/acidosis.Am J Physiol, 1982, 243:H448.
5 Sakai M,Danziger RS,Xiao RP,et al.Contractile response of individual cardiac myocytes to norepinephrine declines with senescence. Am J Physiol, 1992，262:H184.
(1998年7月13日收稿，1998年12月15日修回), 百拇医药
单位：桂林医学院病理生理学教研室, (桂林 541001)
关键词：
心肌细胞分离术 心肌细胞分离方法在不断得到改进。根据实验目的的不同，不断调整分离程序及方法[1～3]。但要得到高产量，有持久(>2 h)兴奋性和收缩功能的心肌细胞，仍不是一件容易的事[3]，尤其是我们在整体或离体心脏复制各种疾病模型(缺血，心肌肥大等)，要在单心肌细胞功能方面研究其病理生理机制时。胶原 酶消化分离出的心肌细胞在产量及活力方面受胶原酶, 缓冲液成分,pH,温度,灌流量及消化时间的影响[3，4]。 胶原酶液对心肌组织的灌流量及时间比较不易掌握, 从而影响心肌细胞的产量及收缩功能。胶原酶液灌流量及消化时间视动物种属，心脏大小而不同。用什么来比较客观地反映灌注及消化的度量，从而得到功能稳定，重复性好的心肌细胞，这方面的报道不多。本人根据在美国Allegheny大学Dr. Vatner实验室工作的经验,总结分离小鼠,大鼠,兔子,狗，羊及人心肌细胞的方法, 供读者参考。
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一、成年小鼠心肌细胞的分离[3]：
1. Langendorff 装置的改进(图1)。 如图1所示，用灌流泵将缓冲液泵入保温杯中，通过三通 2 调节保温杯内液面，过高浪费酶液，过低则易进入空气。在流出道外口装压力换能器，经显示器监测压力变化。通过灌流泵的流速，调节基础压力的大小。
Fig 1 Amelioration of Langendorff perfution system.
1.Glass jacked container;2.stopcut; 3.transducer; 4.manometer; 5.heart; 6.95%O2+5%CO2;7. thermostat; 8.thermostatic water bath; 9.buffer solution; 10.pump
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图1 Langendorff装置的改进
2. 小鼠 (2～6 月. 25～35 g), 肝素5 000 U/kg ip 。 20 min 后颈关节脱位处死。开胸取出心脏,于无Ca2+台氏液(mmol/L) NaCl 132, KCl 4.8, Glucose 5, MgCl2 6， H2O 1.2, HEPEs 10,pH=7.4)中清洗两次。剪去肺残叶及脂肪。主动脉逆行插管，用 37℃无Ca2+台氏液灌5 min,流量2～3 mL/min, 压力应为3.990～5.054 kPa。通过台氏液连续给95% O2+5% CO2混合气体。
3. 用胶原酶液[collagenase Ⅰ 0.5 mg/mL(148 U/mg),collagenase Ⅱ 0.27 mg/mL(273 U/mg, Worthington)],牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA 0.1%), 小牛血清(calf serum 0.015%) 40 mL灌流17～19 min(慢性缺氧小鼠约13～15 min, 年老或转基因心衰鼠19～21 min)。 若灌流得好, 心脏鲜红稍带黄， 若有黄白斑点,说明有栓塞。酶液进入心脏2 min后压力开始上升,5～7 min渐升至6.650～7.980 kPa。然后渐下降，约18 min降至3.72 kPa，此时心脏松软鲜红，即取下心脏。若压力尚高于3.990 kPa，表示消化不足，产量会较低。若时间过长，压力低于3.325 kPa,细胞将明显受损，出现不规则自律收缩，功能下降。
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4.取下心脏于含0.1% BSA,0.015%小牛血清的台氏液中剪去心房及右心室。用针头将左心室肌划碎,移于10 mL试管中。先吸悬液移至另一试管。再加上液,用吸管轻轻冲吸, 使小块组织变为细胞悬液,移至另一试管。再洗1次得第3管。剩下少量网状结缔组织,弃之。10 min 后细胞自然沉降,去上清。用5 mL含0.4 mmol/L Ca2+的台氏液轻轻冲洗。再隔10 min去上清,加入5 mL含0.8 mmol/L Ca2+的台氏液。第2管细胞最好。杆形有收缩功能细胞可达60%～75%。室温(22～23℃)下记录细胞收缩功能。此细胞可连续跳动2～4 h 。
二、成年大鼠心肌细胞分离术[5]：
大鼠经苯巴比妥钠30 mg/kg ip麻醉,1 000 U/mL肝素0.3～0.4 mL iv。开胸取心脏,用37 ℃无Ca2+K-H液(mmol/L)NaCl 130, KCl 4.8,MgSO4 1.2,NaHCO3 2.5, NaH2PO4- H2O 1.2, Glucose 12.5, HEPEs 12, pH=7.4)洗2次。再以4.656～5.320 kPa压力(7～8 mL/min)经主动脉 灌注心脏5 min。 用50 mL胶原酶液-1 [collagenase Ⅱ 0.43 mg/mL(273 U/mg), hyaluronidase 0.3 mg/mL,溶于无Ca2+ K-H液中]循环灌注心脏20 min。3 min后压力渐升至7.980～9.310 kPa,然后又降至5.985 kPa左右。用酶液-2(trypsin 2 mg/mL,DNase 0.2 mg/mL溶于酶液-1 中)20 mL循环灌流 10 min。取下心脏, 在含0.2% BSA, 0.3 mmoL/L Ca2+的K-H液中剪去心房及右心室。将左心室剪成数片，用针头轻轻划碎后洗3次。10～15 min后,弃上清,用5 mL含0.6 mmol/L Ca2+的K-H液洗沉降之细胞。10 min后再用含1.0 mmol/L Ca2+的K-H液洗细胞, 此时细胞鲜红。第2管细胞收缩功能最好，杆形细胞率在90%以上。此细胞可连续跳动4～8 h 。
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三、狗心肌细胞分离术[2]：
1. 狗经苯巴比妥钠 30 mg/kg iv麻醉,1 000 U/mL肝素10 mL iv。气管插管，人工呼吸，开胸取出心脏。置于4℃无钙K-H液中，剪去心房及右心室。 在左右心交界右侧旁开 1 cm 纵行剪开室间隔及主动脉。在主动脉根部找到冠状动脉入口。沿冠状动脉前降支或左旋支两侧剪下宽长3 cm×6 cm心肌组织。用16 G针头外套胶管连三通及60 mL注射器插入冠状动脉 1.5 cm。用2号针线缝扎固定胶管。用温无Ca2+ K-H液经三通冲洗心肌组织。用3号针线缝扎心肌周边血管， 使组织各部位毛细血管灌流充分,此步关键。
2.用无Ca2+ K-H液灌注(12～15 mL/min) 5 min。此时压力在1.995～2.349 kPa。 用酶液-1(collagenase Ⅱ 0.57 mg/mL,溶于无Ca2+ K-H液中)240 mL循环消化20～ 22 min。消化开始后3 min 压力渐上升至6.650～7.980 kPa, 有时可达10.64～13.30 kPa。如果压力上升不超过 2.660 kPa,说明缝扎有误,毛细血管灌流很差,多导致失败。22 min后压力不一定能降到3.990～5.320 kPa，此时心肌肿胀,触之有紧张感。于心肌块中部靠远端由内膜向取组织2 cm×2 cm×2 cm。在酶液-2中剪碎。于50 mL试管中, 用20 mL酶液-2( 2.5 % BSA, 0.3 mmol/L Ca2+, Collagenase Ⅱ 0.23 mg/mL, 溶于无Ca2+ K-H液),于37 ℃, 温浴消化5 min,充95% O2+5% CO2。取上层悬液,于另一试管中, 1 000 r/min离心1 min。弃上清,用 20 mL含1%BSA,0.6 mmol/L Ca2+的K-H液洗细胞。酶液2消化洗脱细胞重复4次。 10 min后,各管弃上清,加入15 mL含1.0 mmol/L Ca2+的K-H液。
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四、羊及人心肌细胞的分离：
分离程序与狗的基本相同。用酶液-1(collagenase Ⅰ 0.5 mg/mL, collagenase Ⅱ 0.27 mg/mL, BSA 0.1%, 小牛血清 0.015%)消化时间为28～30 min。压力可从开始的 1.995～2.660 kPa上升至6.650～7.890 kPa, 然后下降至3.990～4.655 kPa。再用酶液-2(collagenaseⅠ0.2 mg/mL,collagenase Ⅱ 0.11 mg/mL, BSA 2.5%, CaCl2 0.3 mmol/L) 消化10 min。羊或人的心肌组织较狗的脆弱，缝扎及消化的度不易掌握,尤其在缺血梗塞较重或取材后滞留较久的组织。
五、兔心肌细胞分离术：
用大鼠的配方。可经主动脉逆行灌注,也可剪开主动脉,经冠状动脉插管直接灌注,后者与狗的相似。
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讨论
1.在恒流灌注时,压力变化是一个反映灌流和消化程度的重要指标, 尤其在小鼠,狗,羊和人心肌。小鼠主动脉较细,插管有一定难度，可把针头横断面磨斜15度角。注意防止插管入左心室。如果插管通过主动脉瓣, 用台氏液灌流时, 压力会大于5.985 kPa,加入酶液后会超过10.640 kPa。此时由于室内压高,使心内膜无法得到良好的灌注,细胞产量会很低。 如果开始灌注压力低于 3.325 kPa, 而流量已达 3 mL/min, 说明有漏洞,应再结扎或重挂。大鼠插管比较容易,个体间压力变化的差异不大,注意排出气泡就行。狗,羊,人心肌块灌流后压力低于2.995 kPa,说明仍有较大的血管漏。用注射器推注看清后再缝扎。有时得不到完整的冠状动脉入口,心肌块动脉又较细,可从静脉插管灌注。
2.胶原酶collagenases是分离心肌细胞的最主要成份。厂家,活性,批号都对实验有较大影响[2，3]。用一种新批号,要经过一段预试,才能确定最佳浓度。一旦确定下来,不宜轻意改动。CollagenaseⅡ比Ⅰ的消化力强得多。各动物种属的敏感性也不一样,可根据条件及经验调整配方。Collagenase需要Ca2+的激活[1]。文献上常在酶溶液中加入微量的Ca2+(30～200 μmol/L)[4，5]。但在我们的经验中，不用加Ca2+也能得到形态功能很好的细胞。这是由于内源性的Ca2+也足以激活Collegenase。白蛋白具有保护细胞膜的作用，可减轻酶对细胞的损伤。另一方面,通过悬浮作用,使细胞较易与细胞膜碎片分离开来,得到清晰的细胞。白蛋白浓度过大,会抑制细胞的兴奋性。
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3. Ca2+：心肌细胞是在无Ca2+或微Ca2+条件下分离的。要使心肌细胞具有收缩功能,应在心肌细胞分离出来后半小时内,逐渐增加钙离子至生理浓度。若得到细胞后不及时复钙,随着时间的延长,细胞的兴奋性和收缩性会下降,尤其是兴奋性。溶液：水的质量很重要[3]，应用双蒸去离子水。台氏液可用于小鼠,也可用于大鼠[1，2]。K-H液可用于大鼠,兔，狗,羊,也可用于小鼠，对细胞产量无太大影响，但一旦确定,不宜随便更改。温度：小鼠心脏从胸腔取出后,应用温(33℃)台氏液洗两次。此时若用4℃台氏液洗,由于主动脉收缩,会使插管变得很困难。用温台氏液,心脏仍有些搏动,易于分辨主动脉并插管。狗,羊及人心脏标本可在0～4℃营养液中保存12 h,仍能分离到有收缩功能的细胞。已分离的细胞在室温(22～23℃)比在37℃,具有更稳定的兴奋性和收缩性。
* 国家自然科学基金资助 No 39460029
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参考文献
1 Bkaily G, Sperelakis N, Doane J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes.Am J Physiol, 1984, 247:H1018.
2 Tytgat J.How to isolate cardiac myocytes.Cardiovasc Res，1994,28:280.
3 Wolska BM，Solaro RJ.Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.Am J Physiol, 1996, 271:H1250.
4 Spanier AM, Weglicki WB. Ca2+ tolerant adult canine myocytes:preparation and response to anoxia/acidosis.Am J Physiol, 1982, 243:H448.
5 Sakai M,Danziger RS,Xiao RP,et al.Contractile response of individual cardiac myocytes to norepinephrine declines with senescence. Am J Physiol, 1992，262:H184.
(1998年7月13日收稿，1998年12月15日修回), 百拇医药