NF-κB在热休克预处理减轻TNF-α所致内皮细胞凋亡中的作用
作者：钟 林 尢家马 录 肖献忠 孙去病
单位：湖南医科大学病理生理学教研室(长沙410078)
关键词：NF-κB；热休克蛋白质类；内皮；一氧化氮；肿瘤坏死因子
NF 摘 要 目的：探讨核转录因子-κB(NF-κB)在热休克预处理减轻肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所致内皮细胞凋亡中的作用。方法：将培养牛肺动脉内皮细胞(BPAEC)于42℃孵育1 h，37℃再培养16 h后，用TNF-α(2 500 U/mL)损伤24 h，观察BPAEC形态学变化、DNA断裂百分率，抽提DNA作琼脂糖电泳，以确定细胞凋亡情况。Western blot分析70 KD-热休克蛋白(HSP70)合成、NF-κB抑制蛋白I-κBα量的改变以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的生成。凝胶滞留法检测NFkB活性，免疫组织化学染色法分析NFkB的移位。结果：热休克预处理可明显减轻TNF-α所致BPAEC凋亡，表现为与TNF-α损伤组相比，凋亡细胞减少，DNA电泳未出现明显“梯状”条带，DNA断裂百分率降低。进一步实验发现热休克预处理可诱导BPAEC合成HSP70，并可抑制TNF-α引起的BPAEC的I-κBα的降解、NF-κB向细胞核的移位、NF-κB与DNA的结合活性，以及iNOS的生成。结论：热休克预处理可减轻TNF-α所致BPAEC凋亡，其机制与HSP70阻断I-κBα降解，从而抑制NF-κB活化，抑制iNOS转隶合成有关。
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Role of NF-κB in protection of heat shock
pretreatment against TNF-α-induced endothelial cell apoptosis
ZHONG Lin, YOU Jia-Lu XIAO Xian-Zhong, SUN Qu-Bing
Department of Pathophysiology, Hunan Medical University, Changsha (410078)
Abstract AIM:To explore the role of nuclear factor kappa B (NF-κB) in protection of heat shock pretreatment against TNF-α induced endothelial cell apoptosis.METHODS： Cultured bovine pulmonary artery endothelial cells (BPAECs) were exposed to TNF-α(2 500 U/mL, 24 h) 16h after heat shock pretreatment(43℃,1h). The apoptotic morphological changes, DNA ladder pattern on agarose gel electrophoresis, and percentage of DNA fragmentation of BPAEC were analyzed. Inducible heat shock protein-70 kD(HSP70), inhibitor κBα(I-κBα) levels, expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS) and NF-κB activity, NF-κB translocation to nuclei were detected using Western blot analysis, electrophoretic mobility shift assays (EMSA), and immunohistochemical analysis respectively.RESULTS：Heat shock pretreatment significantly attenuated TNF-α induced apoptosis in BPAEC. To compared with TNF-α treated BPAEC, heat shocked cells showed less apoptotic cells, no specific DNA ladder pattern agarose gel electrophoresis, and less increase of percentage of DNA fragmentation. Further, it was found that heat shock pretreatment induced expression of HSP70, and inhibited TNF-αmediated I-κBα degradation, NF-κB translocation, NF-κB binding activity, and iNOS expression.CONCLUSION： Heat shock pretreatment could protect BPAEC against TNF-α induced apoptosis, and its mechanism might involve HSP70 inhibition of TNF-α mediated NF-κB activity and iNOS expression.
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MeSH NF-KAPPA B; Heat-shock proteins; Endothelium; Nitric oxide; Tumor necrosis factor
近年来，血管内皮细胞(endothelial cell)作为机体调节心血管系统稳态最大的内分泌器官越来越受到重视。在病理情况下，由于内皮细胞处于血液与组织间的独特位置，诸多因素如激活的白细胞、活性氧、细胞炎性因子等都可损伤内皮细胞，造成内皮细胞功能障碍。目前认为，内皮细胞损伤在创伤、休克、成人呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭、动脉粥样硬化等疾病过程中起着重要作用[1]。近年来的文献报道，内皮细胞损伤除以“坏死”形式出现外，更为重要的是可发生“凋亡”。我室最近的工作亦表明，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)可致牛肺动脉内皮细胞(bovine pulmonary artery endothelial cell, BPAEC)凋亡，其机制与TNF-α激活核转录因子-κΒ(nuclear factor-kappa B, NF-κB)，促进诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)生成，从而生成的大量一氧化氮(nitric oxide, NO)有关。
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内皮细胞保护措施的研究以往主要集中在药物如抗氧化剂、蛋白酶及脂酶抑制剂、锌、硒以及某些中药对内皮细胞的保护作用[2]。通过增强机体自身的抗损伤能力以达到防治疾病的目的日益受到医学家们的重视。我室以往的工作证实，热休克反应能诱导70 kD-热休克蛋白(heat shock protein-70 kD，HSP70)合成从而增强肺动脉内皮细胞抗损伤能力[3，4]。近来的文献报道热休克反应可抑制NF-κB活化，阻断促炎因子的表达，Wong等对肺上皮细胞株MLE-15的研究发现，热休克反应能阻断I-κBα降解，抑制NF-κB的转位，从而抑制iNOS的基因表达[9]。因此我们推测热休克预处理能通过抑制NF-κB的活化，阻断iNOS的转录合成，最终减轻TNF-α所致的内皮细胞凋亡。
材料与方法
一、材料：
DMEM培养基，Gibco产；无支原体小牛血清，杭州四季青生物工程公司产；重组肿瘤坏死因子-α(recombined tumor necrosis factor-α,rTNF-α)，军事医学科学院产；十二烷基磺酸钠(SDS)，琼脂糖、Hoechst 33258,辣根过氧化物酶标记(HRP)的兔抗鼠IgG或羊抗兔IgG，Sigma产；蛋白酶K、RNA酶，生命技术公司产；丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，Fluka产 ；鼠抗HSP70单克隆抗体，Upwards Biosystem 产；鼠抗iNOS单克隆抗体，Transduction Laboratories产；兔抗I-κBα多克隆抗体，兔抗NF-κB多克隆抗体，Pharmingen产；凝胶滞留分析试剂盒(gel shift assay system),二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸胺、TEMED、硝酸纤维膜，Promega产 ；[γ-32P]ATP，北京市亚辉生物医学工程公司产；SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒，博士德生物工程有限公司产。
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二、方法：
1.培养：小牛BPAEC的培养参照Ryan等的方法[6]并稍加改进。鉴定为内皮细胞后，采用第5～10代用于实验。
2.细胞热休克预处理将细胞置43℃水浴中1 h，37℃，5%CO2细胞培养箱中恢复16 h后用于实验。
3.Hoechst 33258染色荧光显微镜观察：常规细胞涂片、固定，Hoechst 33258染色后封片，荧光显微镜下，正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋亡细胞则表现为浓染致密的颗粒块状荧光。观察后进行显微照相。
4.细胞DNA抽提及琼脂糖电泳：收集细胞并计数后，低张细胞裂解液裂解细胞，离心取上清，抽提上清DNA，以来自6×106个细胞的DNA量/每孔的上样量进行1%琼脂糖电泳，观察是否出现DNA“梯状”条带。
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5.细胞DNA断裂百分率的测定：收集细胞，低张细胞裂解液裂解细胞，离心分离上清和沉淀，采用二苯胺法分别测定上清液及沉淀物中DNA的含量，计算细胞DNA断裂百分率。
6.Western blot分析：按《分子克隆实验指南》所载方法进行。用1×SDS加样缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，采用福林一酚试剂法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。以60μg蛋白/每泳道上样，经SDS-PAGE电泳后，电转膜至硝酸纤维膜，先后加入鼠抗HSP70单抗，或鼠抗iNOS单抗，或兔抗I-κBα多克隆抗体，及HRP标记的兔抗鼠或羊抗兔IgG孵育，DAB显色试剂盒进行显色，拍摄照片，记录实验结果。
7.凝胶滞留法(electrophoretic mobility shift assays，EMSA)检测NF-κB活性：细胞核蛋白的提取参照Ichikawa等的方法[7]稍加改进，收集细胞，冷PBS洗1次，约108个细胞用2 mL SMTD-PMSF(0.25 mol/L蔗糖， 1 mmol/L MgCl2， 20 mmol/L Tris-HCl pH7.85， 1 mmol/L DTT, 0.1 mmol/L PMSF)重悬细胞，玻璃匀浆器匀浆4次，加入Triton X-100至终浓度1%，再匀浆2次，离心(1 000×g,10 min)，弃上清，2 mL含0.5% Triton X-100的SMTD-PMSF重悬沉淀，玻璃匀浆器再匀浆2次，离心(1 000×g，10 min)，沉淀再用1 mL含1 mmol/L CaCl2的SMTD-PMSF洗1次，离心(1 000×g，10 min)所得沉淀即为纯净的细胞核。核蛋白的提取，用与细胞核等体积的KMTD(0.3 mol/L,1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L Tris-HCl pH8.0, 1 mmol/L DTT)孵育1 h，每隔15 min剧烈振动1次，离心(15 000×g, 15 min)，上清即为核蛋白提出取液，福林-酚试剂法测定蛋白浓度后，于-80℃保存备用。NF-κB的凝胶滞留分析按“Gel shift assay system”的操作说明书进行，简述之，采用末端标记法将NF-κB的DNA结合位点(5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’，3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’)标记上[γ-32P]-ATP，将提取的核蛋白(15 μg)与同位素标记的寡聚核苷酸(1.75 pmol)室温下共同孵育30 min，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶以100 V恒压电泳约3 h，剥离凝胶，于-70℃放射自显影约48 h，冲洗X光片，记录结果。
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8.HSP70及NF-κB免疫组织化学染色法检测：根据博士德生物工程公司提供的SABC免疫组化染色试剂盒说明书进行。细胞用4℃预冷的4%多聚甲醛固定，新鲜配制的3%H2O2灭活细胞内源性过氧化物酶，血清封闭后，分别先后滴加抗HSP70或NF-κB的抗体及相应生物素化二抗，DAB显色，封片。显微镜下观察，照相记录结果。
9.统计处理：数据以均数±标准差(
)表示，多组间比较用单因素方差分析，组间比较用q检验。
结果
(一)热休克预处理对TNF-α诱导BPAEC凋亡的影响：实验发现，热休克预处理(43℃，1 h，恢复16 h)能明显减轻TNF-α(2500 U/mL， 24 h)所致的BPAEC凋亡。表现为：(1)形态学变化：Hoechst 33258染色，正常对照组细胞核呈弥散均匀荧光，TNF-α损伤组细胞则出现许多凋亡细胞，即出现许多浓染致密的颗粒块状荧光，而经热休克预处理再用TNF-α损伤的细胞镜下见凋亡细胞比TNF-α损伤组少。(2)生化学改变：TNF-α损伤组细胞DNA电泳出现典型的“梯状”条带，而经热休克预处理再用TNF-α损伤的细胞则未见明显“梯状”条带(图1)。(3)DNA断裂百分率：经热休克预处理再用TNF-α损伤的细胞DNA断裂百分率也比TNF-α损伤组明显降低。
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Fig 1 Photograph of a 1% agarose gel electrophoresis of DNA extracted from normal or heat-shocked BPAEC treated with TNF-α,Lane M: DNA molecular weight marker (pBR 322/BstN 1 marker); Lane A: Untreated BPAEC; Lane B: BPAEC treated with 2 500 U/mL TNF-α for 24 h; Lane C: Heat-shocked BPAECs treated with 2 500 U/mL TNF-α for 24 h after 16 h recovery at 37℃. Lane D: BPAEC heat shocked for 1 h at 43℃ and allowed to recovered for 16 h.
图1 琼脂糖电泳示热休克预处理对TNF-α所致BPAEC DNA“梯状”条带的影响
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(二)BPAEC表达HSP70的Western blot 分析：动力学观察表明BPAEC经热休克预处理(43℃，1 h)后，2 h即可检测到HSP70的表达，且一直持续至24 h(图2)。
Fig 2 Western blot analysis demonstrating the effect of heat shock pretreatment on HSP70 expression in BPAEC. A: Cells were incubated at 37℃ as control; B, C, D,E:Cells were incubated at 43℃ for 1 h and harvested for analysis after 4 h, 8 h, 16 h, 24 h respectively.
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图2 Western blot示热休克预处理对BPAEC HSP70合成的影响
(三)BPAEC的I-κBα量的Western blot分析：动力学观察表明TNF-α(2 500 U/mL)处理BPAEC后，5 min可见I-κBα减少，15 min降到最低，而后逐渐恢复，至2 h可恢复至正常水平。单纯热休克预处理却并不引起BPAEC I-κBα的下降。而热休克预处理可抑制TNF-α所致I-κBα量的下降(图3)。
Fig 3 Western blot analysis demonstrating the effect of heat shock pretreatment on TNF-α mediated I-κBα degradation in BPAEC.①INF-α induced I-κBα degradation in BPAEC. A: Normal cells; B, C, D,E,F,G,H,I,J: Cells were exposed to TNF-α(2 500 U/mL)for 5 min, 15 min, 30 min, 1h, 2h, 4h, 8h,16h, 24h respectively.② Heat shock pretreatment inhibited TNF-α mediated I-κBα degradation in BPAEC. A:Normal cells; B, C,D,E,F,G,H,I,J: Heat-shocked cells were exposed to TNF-α(2 500 U/mL) for 5 min ,15min, 30 min, 1h,2h,4h, 8h, 16h,24h respectively.③Heat shock pretreatment didn't induce I-κBα degradation in BPAECs. A: Normal cells; B,C,D,E,F,G,H,I,J: Cells were incubated at 43℃ for 1h and harvested for analysis after 5 min, 15 min, 30 min, 1h,2h,4h,8h, 16h, 24h respectively
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图3 Western blot 示热休克预处理对TNF-α所致BPAEC I-κBα降解的影响
(四)BPAEC表达iNOS的Western blot 分析：动力学观察表明TNF-α(2 500 U/mL)处理BPAEC后，2 h即可检测到iNOS的表达，4～6 h表达最多，12 h则减少。若BPAEC先经热休克预处理，再用TNF-α刺激，则其iNOS的表达明显降低(图4)。
Fig 4 Western blot analysis demonstrating the effect of heat shock pretreatment on TNF-α mediated iNOS expression in BPAEC. A:Normal cells; B,C,D,E,:Cells were exposed to TNF-α(2 500 U/mL) for 2h,4h,8h,12h respectively.F,G,H,I: Heat-shocked cells were exposed to TNF-α(2 500 U/mL) for 2h, 4h, 8h, 12h respectively.
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图4 Western blot示热休克预处理对TNF-α所致BPAEC iNOS合成的影响
(五)BPAEC核内NF-κB DNA结合活性的EMSA检测：BPAEC经TNF-α(2 500 U/mL)处理后5 min即可检测到核内有NF-κB的活性，15 min NF-κB活性达到最高，而后逐渐恢复，至2 h可恢复至正常水平。而热休克预处理可抑制TNF-α所致NF-κB的活化(图5)。
Fig 5 EMSA demonstrating the effect of heat shock pretreatment on TNF-α-mediated NF-κB activity in BPAEC. A: Normal cells; B, C, D, E, F: Cells were exposed to TNF-α(2500 U/mL) for 5 min, 15 min, 30 min, 1h,2h,respectively. G, H, I, J, K:heat-shocked cells were exposed to TNF-α(2500 U/mL) for 5min, 15 min, 30 min, 1h, 2 h respectively
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图5 EMSA示热休克预处理对TNF-α所致BPAEC NF-κB活性的影响
(六)免疫组织化学染色法检测BPAEC中NF-κB、HSP70的移位：BPAEC经TNF-α(2500 U/mL)处理30 min后，NF-κB明显从胞浆移位于胞核。热休克预处理可抑制TNF-α所致NF-κB从胞浆向胞核的移位。免疫组化检测还显示，热休克预处理所诱导合成的HSP70主要移位集中于BPAEC细胞核。
讨论
实验中发现，BPAEC先经热休克预处理，再用TNF-α损伤，形态学变化较轻，DNA电泳未见明显“梯状”条带，DNA断裂百分率显著下降，说明热休克预处理能减轻TNF-α所致BPAEC凋亡。
HSP能增强机体组织器官、细胞的抗损伤能力已获公认，但HSP的作用机制却不甚明了。我室以往的工作证实热休克预处理对内皮细胞的保护与HSP70增强细胞抗氧自由基能力有关[3，4]。近来，有文献报道热休克反应还能抑制NF-κB的活化进而阻断促炎因子的表达[5]。NF-κB广泛存在于真核细胞内，是将信息从胞浆传至胞核引起相应基因表达的重要的转录因子。静息情况下，NF-κB位于胞浆内，与κB抑制蛋白(inhibitor κB,I-κB)结合成复合物处于失活状态。I-κB有多种构成形式，I-κBα/MAD3是最能表现其分子生物学功能的形式。细胞受到刺激后，I-κBα磷酸化，并被降解，从NF-κB/I-κBα复合物上解离下来，NF-κB随即通过核膜上的受体进入细胞核，与靶基因κB位点结合，迅速诱导靶基因的转录。NF-κB调控着诸多参与免疫、炎症反应因子如细胞粘附分子、细胞因子和iNOS等的表达，因此可以通过抑制NF-κB的活化而达到抗感染的目的[8]。本实验发现，BPAEC经热休克预处理后，2 h即可检测到HSP70的表达，并持续至24 h。与TNF-α损伤组BPAEC相比，热休克预处理明显抑制了TNF-α所引起的I-κBα量的降低、NF-κB从胞浆向胞核的移位和NF-κB的DNA结合活性，以及iNOS的表达。这与Wong等在肺上皮细胞株MLE-15的发现[5]相似。NF-κB活化的关键是I-kBα的磷酸化并降解以及NF-kB进入细胞核靶基因kB位点结合。HSP70阻断I-κBα的降解是通过阻止I-kBα的磷酸化、稳定磷酸化的I-kBα抑或是诱导I-kBα合成还不清楚。此外，有文献认为HSP70可与NF-κB结合，阻断NF-κB向胞核的移位，进而抑制NF-κB的转录活性[9]。
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内皮细胞损伤在创伤、休克、成人呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭、动脉粥样硬化等疾病过程中起着重要作用。保护内皮细胞是预防和治疗这些疾病的关键措施之一。本实验证实HSP70可抑制NF-κB活化、抑制iNOS转录生成而减轻TNF-α所致内皮细胞凋亡。NF-kB活化涉及到许多促炎因子的基因调控，HSP70对其的抑制作用显得意义重大，但其机制仍需进一步探讨。
参考文献
1 Rubanyi CM. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and disease. J Cardiovasc Pharmacol, 1993, 22(Suppl 4):S1.
2 王爱忠，徐惠芳. 血管内皮细胞的保护.国外医学麻醉学与复苏分册，1997， 18(1)：22.
3 Wang YR, Xiao XZ, Huang SN, et al. Heat shock pretreatment prevents hydrogen peroxide injury of pulmonary endothelial cell and macrophages in culture. Shock, 1996, 6(2):134.
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4 钟 林，尢家马 录：热休克蛋白对H2O2损伤BPAECs的保护作用及其机制探讨.湖南医科大学学报，1996，21(2)：100.
5 Wong HR, Ryan M, Mestri R. The heat shock response inhibits inducible nitric oxide synthase gene expression by blocking I-κB degradation and NF-κB nuclear translocation. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 231:257.
6 Ryan US. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells. Environ Health Perspect, 1984, 56: 103.
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7 Ichikawa K, DeGroot LJ, Refetoff S, et al. Nuclear thyriod hormone receptors in cultured human fibroblasts: improved method of isolation, partial characterization, and interaction with chromatin. Metabolism, 1986, 35(9):861.
8 Baldin AS Jr. The NF-κB and I-κB proteins: New discoveries and insights. Annu Rev Immunol, 1996, 14:649.
9 Feinstein DL, Galea E, Aquino DA, et al. Heat shock protein 70 suppresses astrogial-inducible nitric oxide synthase expression by decreasing NF-κB activation. J Biol Chem, 1996, 271:17724.
(1998年11月9日收稿，1999年4月19日修回), 百拇医药
单位：湖南医科大学病理生理学教研室(长沙410078)
关键词：NF-κB；热休克蛋白质类；内皮；一氧化氮；肿瘤坏死因子
NF 摘 要 目的：探讨核转录因子-κB(NF-κB)在热休克预处理减轻肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所致内皮细胞凋亡中的作用。方法：将培养牛肺动脉内皮细胞(BPAEC)于42℃孵育1 h，37℃再培养16 h后，用TNF-α(2 500 U/mL)损伤24 h，观察BPAEC形态学变化、DNA断裂百分率，抽提DNA作琼脂糖电泳，以确定细胞凋亡情况。Western blot分析70 KD-热休克蛋白(HSP70)合成、NF-κB抑制蛋白I-κBα量的改变以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的生成。凝胶滞留法检测NFkB活性，免疫组织化学染色法分析NFkB的移位。结果：热休克预处理可明显减轻TNF-α所致BPAEC凋亡，表现为与TNF-α损伤组相比，凋亡细胞减少，DNA电泳未出现明显“梯状”条带，DNA断裂百分率降低。进一步实验发现热休克预处理可诱导BPAEC合成HSP70，并可抑制TNF-α引起的BPAEC的I-κBα的降解、NF-κB向细胞核的移位、NF-κB与DNA的结合活性，以及iNOS的生成。结论：热休克预处理可减轻TNF-α所致BPAEC凋亡，其机制与HSP70阻断I-κBα降解，从而抑制NF-κB活化，抑制iNOS转隶合成有关。
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ZHONG Lin, YOU Jia-Lu XIAO Xian-Zhong, SUN Qu-Bing
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Abstract AIM:To explore the role of nuclear factor kappa B (NF-κB) in protection of heat shock pretreatment against TNF-α induced endothelial cell apoptosis.METHODS： Cultured bovine pulmonary artery endothelial cells (BPAECs) were exposed to TNF-α(2 500 U/mL, 24 h) 16h after heat shock pretreatment(43℃,1h). The apoptotic morphological changes, DNA ladder pattern on agarose gel electrophoresis, and percentage of DNA fragmentation of BPAEC were analyzed. Inducible heat shock protein-70 kD(HSP70), inhibitor κBα(I-κBα) levels, expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS) and NF-κB activity, NF-κB translocation to nuclei were detected using Western blot analysis, electrophoretic mobility shift assays (EMSA), and immunohistochemical analysis respectively.RESULTS：Heat shock pretreatment significantly attenuated TNF-α induced apoptosis in BPAEC. To compared with TNF-α treated BPAEC, heat shocked cells showed less apoptotic cells, no specific DNA ladder pattern agarose gel electrophoresis, and less increase of percentage of DNA fragmentation. Further, it was found that heat shock pretreatment induced expression of HSP70, and inhibited TNF-αmediated I-κBα degradation, NF-κB translocation, NF-κB binding activity, and iNOS expression.CONCLUSION： Heat shock pretreatment could protect BPAEC against TNF-α induced apoptosis, and its mechanism might involve HSP70 inhibition of TNF-α mediated NF-κB activity and iNOS expression.
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MeSH NF-KAPPA B; Heat-shock proteins; Endothelium; Nitric oxide; Tumor necrosis factor
近年来，血管内皮细胞(endothelial cell)作为机体调节心血管系统稳态最大的内分泌器官越来越受到重视。在病理情况下，由于内皮细胞处于血液与组织间的独特位置，诸多因素如激活的白细胞、活性氧、细胞炎性因子等都可损伤内皮细胞，造成内皮细胞功能障碍。目前认为，内皮细胞损伤在创伤、休克、成人呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭、动脉粥样硬化等疾病过程中起着重要作用[1]。近年来的文献报道，内皮细胞损伤除以“坏死”形式出现外，更为重要的是可发生“凋亡”。我室最近的工作亦表明，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)可致牛肺动脉内皮细胞(bovine pulmonary artery endothelial cell, BPAEC)凋亡，其机制与TNF-α激活核转录因子-κΒ(nuclear factor-kappa B, NF-κB)，促进诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)生成，从而生成的大量一氧化氮(nitric oxide, NO)有关。
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内皮细胞保护措施的研究以往主要集中在药物如抗氧化剂、蛋白酶及脂酶抑制剂、锌、硒以及某些中药对内皮细胞的保护作用[2]。通过增强机体自身的抗损伤能力以达到防治疾病的目的日益受到医学家们的重视。我室以往的工作证实，热休克反应能诱导70 kD-热休克蛋白(heat shock protein-70 kD，HSP70)合成从而增强肺动脉内皮细胞抗损伤能力[3，4]。近来的文献报道热休克反应可抑制NF-κB活化，阻断促炎因子的表达，Wong等对肺上皮细胞株MLE-15的研究发现，热休克反应能阻断I-κBα降解，抑制NF-κB的转位，从而抑制iNOS的基因表达[9]。因此我们推测热休克预处理能通过抑制NF-κB的活化，阻断iNOS的转录合成，最终减轻TNF-α所致的内皮细胞凋亡。
材料与方法
一、材料：
DMEM培养基，Gibco产；无支原体小牛血清，杭州四季青生物工程公司产；重组肿瘤坏死因子-α(recombined tumor necrosis factor-α,rTNF-α)，军事医学科学院产；十二烷基磺酸钠(SDS)，琼脂糖、Hoechst 33258,辣根过氧化物酶标记(HRP)的兔抗鼠IgG或羊抗兔IgG，Sigma产；蛋白酶K、RNA酶，生命技术公司产；丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，Fluka产 ；鼠抗HSP70单克隆抗体，Upwards Biosystem 产；鼠抗iNOS单克隆抗体，Transduction Laboratories产；兔抗I-κBα多克隆抗体，兔抗NF-κB多克隆抗体，Pharmingen产；凝胶滞留分析试剂盒(gel shift assay system),二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸胺、TEMED、硝酸纤维膜，Promega产 ；[γ-32P]ATP，北京市亚辉生物医学工程公司产；SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒，博士德生物工程有限公司产。
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二、方法：
1.培养：小牛BPAEC的培养参照Ryan等的方法[6]并稍加改进。鉴定为内皮细胞后，采用第5～10代用于实验。
2.细胞热休克预处理将细胞置43℃水浴中1 h，37℃，5%CO2细胞培养箱中恢复16 h后用于实验。
3.Hoechst 33258染色荧光显微镜观察：常规细胞涂片、固定，Hoechst 33258染色后封片，荧光显微镜下，正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋亡细胞则表现为浓染致密的颗粒块状荧光。观察后进行显微照相。
4.细胞DNA抽提及琼脂糖电泳：收集细胞并计数后，低张细胞裂解液裂解细胞，离心取上清，抽提上清DNA，以来自6×106个细胞的DNA量/每孔的上样量进行1%琼脂糖电泳，观察是否出现DNA“梯状”条带。
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5.细胞DNA断裂百分率的测定：收集细胞，低张细胞裂解液裂解细胞，离心分离上清和沉淀，采用二苯胺法分别测定上清液及沉淀物中DNA的含量，计算细胞DNA断裂百分率。
6.Western blot分析：按《分子克隆实验指南》所载方法进行。用1×SDS加样缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，采用福林一酚试剂法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。以60μg蛋白/每泳道上样，经SDS-PAGE电泳后，电转膜至硝酸纤维膜，先后加入鼠抗HSP70单抗，或鼠抗iNOS单抗，或兔抗I-κBα多克隆抗体，及HRP标记的兔抗鼠或羊抗兔IgG孵育，DAB显色试剂盒进行显色，拍摄照片，记录实验结果。
7.凝胶滞留法(electrophoretic mobility shift assays，EMSA)检测NF-κB活性：细胞核蛋白的提取参照Ichikawa等的方法[7]稍加改进，收集细胞，冷PBS洗1次，约108个细胞用2 mL SMTD-PMSF(0.25 mol/L蔗糖， 1 mmol/L MgCl2， 20 mmol/L Tris-HCl pH7.85， 1 mmol/L DTT, 0.1 mmol/L PMSF)重悬细胞，玻璃匀浆器匀浆4次，加入Triton X-100至终浓度1%，再匀浆2次，离心(1 000×g,10 min)，弃上清，2 mL含0.5% Triton X-100的SMTD-PMSF重悬沉淀，玻璃匀浆器再匀浆2次，离心(1 000×g，10 min)，沉淀再用1 mL含1 mmol/L CaCl2的SMTD-PMSF洗1次，离心(1 000×g，10 min)所得沉淀即为纯净的细胞核。核蛋白的提取，用与细胞核等体积的KMTD(0.3 mol/L,1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L Tris-HCl pH8.0, 1 mmol/L DTT)孵育1 h，每隔15 min剧烈振动1次，离心(15 000×g, 15 min)，上清即为核蛋白提出取液，福林-酚试剂法测定蛋白浓度后，于-80℃保存备用。NF-κB的凝胶滞留分析按“Gel shift assay system”的操作说明书进行，简述之，采用末端标记法将NF-κB的DNA结合位点(5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’，3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’)标记上[γ-32P]-ATP，将提取的核蛋白(15 μg)与同位素标记的寡聚核苷酸(1.75 pmol)室温下共同孵育30 min，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶以100 V恒压电泳约3 h，剥离凝胶，于-70℃放射自显影约48 h，冲洗X光片，记录结果。
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8.HSP70及NF-κB免疫组织化学染色法检测：根据博士德生物工程公司提供的SABC免疫组化染色试剂盒说明书进行。细胞用4℃预冷的4%多聚甲醛固定，新鲜配制的3%H2O2灭活细胞内源性过氧化物酶，血清封闭后，分别先后滴加抗HSP70或NF-κB的抗体及相应生物素化二抗，DAB显色，封片。显微镜下观察，照相记录结果。
9.统计处理：数据以均数±标准差(
)表示，多组间比较用单因素方差分析，组间比较用q检验。结果
(一)热休克预处理对TNF-α诱导BPAEC凋亡的影响：实验发现，热休克预处理(43℃，1 h，恢复16 h)能明显减轻TNF-α(2500 U/mL， 24 h)所致的BPAEC凋亡。表现为：(1)形态学变化：Hoechst 33258染色，正常对照组细胞核呈弥散均匀荧光，TNF-α损伤组细胞则出现许多凋亡细胞，即出现许多浓染致密的颗粒块状荧光，而经热休克预处理再用TNF-α损伤的细胞镜下见凋亡细胞比TNF-α损伤组少。(2)生化学改变：TNF-α损伤组细胞DNA电泳出现典型的“梯状”条带，而经热休克预处理再用TNF-α损伤的细胞则未见明显“梯状”条带(图1)。(3)DNA断裂百分率：经热休克预处理再用TNF-α损伤的细胞DNA断裂百分率也比TNF-α损伤组明显降低。
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Fig 1 Photograph of a 1% agarose gel electrophoresis of DNA extracted from normal or heat-shocked BPAEC treated with TNF-α,Lane M: DNA molecular weight marker (pBR 322/BstN 1 marker); Lane A: Untreated BPAEC; Lane B: BPAEC treated with 2 500 U/mL TNF-α for 24 h; Lane C: Heat-shocked BPAECs treated with 2 500 U/mL TNF-α for 24 h after 16 h recovery at 37℃. Lane D: BPAEC heat shocked for 1 h at 43℃ and allowed to recovered for 16 h.
图1 琼脂糖电泳示热休克预处理对TNF-α所致BPAEC DNA“梯状”条带的影响
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(二)BPAEC表达HSP70的Western blot 分析：动力学观察表明BPAEC经热休克预处理(43℃，1 h)后，2 h即可检测到HSP70的表达，且一直持续至24 h(图2)。
Fig 2 Western blot analysis demonstrating the effect of heat shock pretreatment on HSP70 expression in BPAEC. A: Cells were incubated at 37℃ as control; B, C, D,E:Cells were incubated at 43℃ for 1 h and harvested for analysis after 4 h, 8 h, 16 h, 24 h respectively.
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图2 Western blot示热休克预处理对BPAEC HSP70合成的影响
(三)BPAEC的I-κBα量的Western blot分析：动力学观察表明TNF-α(2 500 U/mL)处理BPAEC后，5 min可见I-κBα减少，15 min降到最低，而后逐渐恢复，至2 h可恢复至正常水平。单纯热休克预处理却并不引起BPAEC I-κBα的下降。而热休克预处理可抑制TNF-α所致I-κBα量的下降(图3)。
Fig 3 Western blot analysis demonstrating the effect of heat shock pretreatment on TNF-α mediated I-κBα degradation in BPAEC.①INF-α induced I-κBα degradation in BPAEC. A: Normal cells; B, C, D,E,F,G,H,I,J: Cells were exposed to TNF-α(2 500 U/mL)for 5 min, 15 min, 30 min, 1h, 2h, 4h, 8h,16h, 24h respectively.② Heat shock pretreatment inhibited TNF-α mediated I-κBα degradation in BPAEC. A:Normal cells; B, C,D,E,F,G,H,I,J: Heat-shocked cells were exposed to TNF-α(2 500 U/mL) for 5 min ,15min, 30 min, 1h,2h,4h, 8h, 16h,24h respectively.③Heat shock pretreatment didn't induce I-κBα degradation in BPAECs. A: Normal cells; B,C,D,E,F,G,H,I,J: Cells were incubated at 43℃ for 1h and harvested for analysis after 5 min, 15 min, 30 min, 1h,2h,4h,8h, 16h, 24h respectively
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图3 Western blot 示热休克预处理对TNF-α所致BPAEC I-κBα降解的影响
(四)BPAEC表达iNOS的Western blot 分析：动力学观察表明TNF-α(2 500 U/mL)处理BPAEC后，2 h即可检测到iNOS的表达，4～6 h表达最多，12 h则减少。若BPAEC先经热休克预处理，再用TNF-α刺激，则其iNOS的表达明显降低(图4)。
Fig 4 Western blot analysis demonstrating the effect of heat shock pretreatment on TNF-α mediated iNOS expression in BPAEC. A:Normal cells; B,C,D,E,:Cells were exposed to TNF-α(2 500 U/mL) for 2h,4h,8h,12h respectively.F,G,H,I: Heat-shocked cells were exposed to TNF-α(2 500 U/mL) for 2h, 4h, 8h, 12h respectively.
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图4 Western blot示热休克预处理对TNF-α所致BPAEC iNOS合成的影响
(五)BPAEC核内NF-κB DNA结合活性的EMSA检测：BPAEC经TNF-α(2 500 U/mL)处理后5 min即可检测到核内有NF-κB的活性，15 min NF-κB活性达到最高，而后逐渐恢复，至2 h可恢复至正常水平。而热休克预处理可抑制TNF-α所致NF-κB的活化(图5)。
Fig 5 EMSA demonstrating the effect of heat shock pretreatment on TNF-α-mediated NF-κB activity in BPAEC. A: Normal cells; B, C, D, E, F: Cells were exposed to TNF-α(2500 U/mL) for 5 min, 15 min, 30 min, 1h,2h,respectively. G, H, I, J, K:heat-shocked cells were exposed to TNF-α(2500 U/mL) for 5min, 15 min, 30 min, 1h, 2 h respectively
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图5 EMSA示热休克预处理对TNF-α所致BPAEC NF-κB活性的影响
(六)免疫组织化学染色法检测BPAEC中NF-κB、HSP70的移位：BPAEC经TNF-α(2500 U/mL)处理30 min后，NF-κB明显从胞浆移位于胞核。热休克预处理可抑制TNF-α所致NF-κB从胞浆向胞核的移位。免疫组化检测还显示，热休克预处理所诱导合成的HSP70主要移位集中于BPAEC细胞核。
讨论
实验中发现，BPAEC先经热休克预处理，再用TNF-α损伤，形态学变化较轻，DNA电泳未见明显“梯状”条带，DNA断裂百分率显著下降，说明热休克预处理能减轻TNF-α所致BPAEC凋亡。
HSP能增强机体组织器官、细胞的抗损伤能力已获公认，但HSP的作用机制却不甚明了。我室以往的工作证实热休克预处理对内皮细胞的保护与HSP70增强细胞抗氧自由基能力有关[3，4]。近来，有文献报道热休克反应还能抑制NF-κB的活化进而阻断促炎因子的表达[5]。NF-κB广泛存在于真核细胞内，是将信息从胞浆传至胞核引起相应基因表达的重要的转录因子。静息情况下，NF-κB位于胞浆内，与κB抑制蛋白(inhibitor κB,I-κB)结合成复合物处于失活状态。I-κB有多种构成形式，I-κBα/MAD3是最能表现其分子生物学功能的形式。细胞受到刺激后，I-κBα磷酸化，并被降解，从NF-κB/I-κBα复合物上解离下来，NF-κB随即通过核膜上的受体进入细胞核，与靶基因κB位点结合，迅速诱导靶基因的转录。NF-κB调控着诸多参与免疫、炎症反应因子如细胞粘附分子、细胞因子和iNOS等的表达，因此可以通过抑制NF-κB的活化而达到抗感染的目的[8]。本实验发现，BPAEC经热休克预处理后，2 h即可检测到HSP70的表达，并持续至24 h。与TNF-α损伤组BPAEC相比，热休克预处理明显抑制了TNF-α所引起的I-κBα量的降低、NF-κB从胞浆向胞核的移位和NF-κB的DNA结合活性，以及iNOS的表达。这与Wong等在肺上皮细胞株MLE-15的发现[5]相似。NF-κB活化的关键是I-kBα的磷酸化并降解以及NF-kB进入细胞核靶基因kB位点结合。HSP70阻断I-κBα的降解是通过阻止I-kBα的磷酸化、稳定磷酸化的I-kBα抑或是诱导I-kBα合成还不清楚。此外，有文献认为HSP70可与NF-κB结合，阻断NF-κB向胞核的移位，进而抑制NF-κB的转录活性[9]。
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内皮细胞损伤在创伤、休克、成人呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭、动脉粥样硬化等疾病过程中起着重要作用。保护内皮细胞是预防和治疗这些疾病的关键措施之一。本实验证实HSP70可抑制NF-κB活化、抑制iNOS转录生成而减轻TNF-α所致内皮细胞凋亡。NF-kB活化涉及到许多促炎因子的基因调控，HSP70对其的抑制作用显得意义重大，但其机制仍需进一步探讨。
参考文献
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2 王爱忠，徐惠芳. 血管内皮细胞的保护.国外医学麻醉学与复苏分册，1997， 18(1)：22.
3 Wang YR, Xiao XZ, Huang SN, et al. Heat shock pretreatment prevents hydrogen peroxide injury of pulmonary endothelial cell and macrophages in culture. Shock, 1996, 6(2):134.
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4 钟 林，尢家马 录：热休克蛋白对H2O2损伤BPAECs的保护作用及其机制探讨.湖南医科大学学报，1996，21(2)：100.
5 Wong HR, Ryan M, Mestri R. The heat shock response inhibits inducible nitric oxide synthase gene expression by blocking I-κB degradation and NF-κB nuclear translocation. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 231:257.
6 Ryan US. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells. Environ Health Perspect, 1984, 56: 103.
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7 Ichikawa K, DeGroot LJ, Refetoff S, et al. Nuclear thyriod hormone receptors in cultured human fibroblasts: improved method of isolation, partial characterization, and interaction with chromatin. Metabolism, 1986, 35(9):861.
8 Baldin AS Jr. The NF-κB and I-κB proteins: New discoveries and insights. Annu Rev Immunol, 1996, 14:649.
9 Feinstein DL, Galea E, Aquino DA, et al. Heat shock protein 70 suppresses astrogial-inducible nitric oxide synthase expression by decreasing NF-κB activation. J Biol Chem, 1996, 271:17724.
(1998年11月9日收稿，1999年4月19日修回), 百拇医药