沙土鼠及大鼠局部脑缺血时血小板活化因子的变化*
作者：方思伟 李麟仙 王子灿
单位：李麟仙 王子灿 昆明医学院病理生理教研室(昆明650031)；方思伟 中山市博爱医院内科
关键词：血小板活化因子；局部脑缺血；沙鼠亚科；大鼠
中国病理生理杂志990503 摘 要 目的：血小板活化因子(PAF)拮抗剂能改善局部脑缺血所致功能和组织损伤，本文在沙土鼠单侧脑缺血及大鼠大脑中动脉凝闭的局部脑缺血观察了缺血后大脑组织PAF的变化。方法：PAF的测定采用薄层层析进行PAF分离提取，用生物法测定PAF含量的变化。结果：1.沙土鼠右侧颈总动脉结扎3 h再灌2 h，右侧大脑组织PAF含量明显高于左侧。2.大鼠左侧脑中动脉凝闭后48 h，左侧大脑组织PAF含量明显高于右侧。结论：PAF在局部脑缺血继发神经元损伤中可能有一定作用。
Platelet-activating factor in brain after regional ischemia in gerbils and rats
, 百拇医药
FANG Si-Wei, LI Lin-Xian, WANG Zi-Can
Department of Pathophysiolog, Kunming Medical College, Kunming(650031)
Abstract AIM:Platelet-activating factor(PAF) bas been reported to be an active mediator of neuronal damage in regional cerebral ischemia on the basis of indirect pharmacological data from PAF antagonists. The direct measurement of PAF has not been reported previously in regional cerebral ischemia. It prompted us to investigate the change of PAF in unilateral ischemia in gerbils and regional ischemia in rats.METHODS：Thin layer chromatography was combined with biological methods for the determination of PAF in brain after cerebral ischemia.RESULTS：(1) The PAF content of ischemic brain was increaesd significantly in gerbils subjected to 3 h unilateral cerebral ischemia followed by 2h reperfusion respectively(4.40±0.90) and (1.30±0.40) pg/g, P<0.05. (2)The PAF content of ischemic brain was increased significantly also in rats subjected to 48 h regional ischemia respectively(5.74±0.75) and (0.76±0.05)pg/g, P<0.05. CONCLUSION：PAF could contribute to secondary neuronal damage after regional cerebral ischemia.
, 百拇医药
MeSH Platelet activating factor; Cerebral ischemia; Gerbillinae; Rats
血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)为一很强的非特异性磷脂介质，参与多种病理过程。PAF可诱导血小板聚集，引起脑血管收缩，减少大脑局部血流量，增加血脑屏障通透性，激活中性白细胞，形成脂质过氧化物[1]。近年对PAF在脑缺血继发神经元损伤中的作用，引起了关注[2]。但关于局部脑缺血时大脑组织PAF的变化，文献中尚未见报道，PAF在局部脑缺血发病中的作用系来自间接证明，即应用PAF拮抗剂可减轻局部脑缺血后机能和组织损伤[3]。本实验目的在于观察沙土鼠单侧脑缺血及大鼠局部脑缺血时大脑组织PAF含量的变化，进一步证明PAF在局部脑缺血继发神经元损伤发病中的作用。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、实验动物：
健康沙土鼠，雌雄不拘，体重(67±4) g(
)；Wistar大鼠，雄性，体重(355±24) g，由本院动物科供给。
二、脑缺血动物模型的复制：
1.沙土鼠单侧脑缺血及再灌模型：首先参照Masayasu方法[4]对实验动物进行筛选：由于只有30%沙土鼠两侧大脑前动脉间缺乏交通支，因而只有这部分动物在结扎一侧颈总动脉后，才有可能复制单侧脑缺血。预选方法为：沙土鼠以100 mg/kg氨胺酮(ip)麻醉，颈前正中切口，分离左侧颈总动脉，将小橡皮条贴附于该动脉上，然后用丝线一并结扎，60 s后剪断丝线，抽出小条让动脉再通，观察30 min沙土鼠神经症状，参照Masayasu标准计分，最高分为7分，凡计分在2～7之间的选为实验动物。
, 百拇医药
将挑选的沙土鼠用乙醚吸入麻醉，按上述方法分离并结扎右侧颈总动脉，缺血3 h，剪断结扎直视血管再通，再灌2 h后用乙醚再次麻醉，断头取脑。立即将脑组织置于含0.18%甲酸的冰生理盐水中1 min，使乙酰水解酶失活，随即取出大脑迅速分离左右大脑半球并称重量。
2.大鼠局部脑缺血模型：大鼠以12%水含氯醛按400 mg/kg(i p)麻醉。按Peter法在颧弓和鳞状骨融合点侧1 mm暴露左侧大脑中动脉。用高频电刀电灼凝闭该侧大脑中动脉，术后放回原条件下继续饲养48 h后，水合氯醛再次麻醉动物，断头取脑，按前面所述方法处理脑组织。
三、PAF含量测定方法：
参照Tokumura法[6]淬取脑中脂质。用薄层层析法分离PAF，从层析板取与PAF标准品同比移植(RF)部分，用150 μL氯仿再提取，氮气吹干后溶于50 μL台氏缓冲液中待测。
, 百拇医药
用血小板聚集法测脑组织中PAF含量：制备富含血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，将血小板浓度调至35×109/L～40×109/L，测定血小板聚集幅度，根据标准品PAF剂量效应曲线计算出PAF含量。
四、对提取PAF的鉴定(参照Benvensite法[7])：
1.磷脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)处理：将从薄层层析板上刮下的提取物与PLA2在37℃温育15 min观察对PRP聚集的影响。
2.消炎痛及磷酸肌酸/磷酸肌酸激酶处理：在PRP中加入消炎痛(2 mg/mL)、磷酸肌酸(62.5 μg/10 μL)，磷酸肌酸激酶(30.5 μg/10 μL)，观察提取物对血小板聚集的影响。
, http://www.100md.com
结果
一、PAF的剂量-效应曲线：
10 pg的PAF引起的血小板聚集率为10.6%，60 pg为75.0%，在此剂量范围内呈线性量效关系，r=0.999。
二、提取PAF的鉴定：
与PLA2温育过的从薄层层析板上刮下的提取物不能引起血小板聚集。用消炎痛及CP/CPK处理过的血小板，加入从薄层层析板刮下的提取物后，可见典型的聚集反应。
三、PAF测定的结果：
1.沙土鼠单侧脑缺血后左右大脑半球PAF含量的变化，如表1所见。
表1 沙土鼠单侧脑缺血后3 h再灌2 h后PAF含量的变化
, http://www.100md.com
Tab 1 The changes of brain PAF content in gerbils subjected to 3 h
unilateral cerebral ischemia followed by 2 h reperfusion ()
n
PAF(pg/g)
Nonischemic brain
12
1.30±0.42
Ischemic brain
, http://www.100md.com
12
4.40±0.90*
* P<0.05，vs nonischemic brain
由表1可看出，沙土鼠右侧颈总动脉结扎3 h再灌2 h，右侧大脑组织PAF含量明显高于左侧(P<0.05)。
2.大鼠左侧大脑中动脉闭塞后48 h PAF含量的变化，见表2。
表2 大鼠局部脑缺血后大脑半球PAF含量的变化
Tab 2 The change of brain PAF content in rats subjected to
left middle cerebral artery occlusion for 48 h()
, 百拇医药
n
PAF(pg/g)
Nonischemic brain
10
0.76±0.24
Ischemic brain
10
5.74±0.74*
* P<0.05，vs nonischemic brain
由表2可以看出，大鼠左侧大脑中动脉凝闭后48 h，缺血侧大脑半球PAF含量明显高于右侧(P<0.05)。
, http://www.100md.com
讨论
Korneckie等[8]在体外实验发现3.5 μmol/L的PAF可造成神经细胞变性，并出现神经细胞内钙离子增加。便设想PAF在脑缺血继发神经元损伤中有一定作用，以后相继Gerhard等[9]报道PAF拮抗剂Apafant能减小局部脑缺血的梗塞体积。Apafant的作用与阻止钙内流，减轻神经元损伤及降低血管通透性有关。Frerichs报道给PAF拮抗剂银杏苦内酯能使光化学引起的大鼠局部脑缺血的血流量增加，减轻皮层及海马神经元损伤，减少缺血部位白细胞聚集，以上结果均说明PAF与局部脑缺血时缺血损伤有关。Nishida等[10]报道在沙土鼠双侧颈总动脉结扎所致脑缺血10 min后，大脑皮层海马、丘脑组织PAF含量明显增高，但关于局部脑缺血时，大脑组织PAF含量的变化，迄今未见文献中有报道。我们在沙土鼠单侧脑缺血3 h再灌2 h发现缺血侧脑组织PAF含量明显高于对照侧；在大鼠大脑中动脉凝闭所致局部脑缺血侧脑组织缺血后48 h，PAF含量也显著增高，结合PAF拮抗剂可改善局部脑缺血后神经元缺血性损伤，进一步证实PAF与局部脑缺血继发性神经元损伤密切相关。
, 百拇医药
近年来，对PAF的病理生理研究取得了重大进展，已经阐明：1.PAF有很强的血小板积聚诱导作用。2.PAF和花生四烯酸具有共同的前体，PAF形成增加的同时，也引发花生四烯酸代谢通路形成前列腺素和白三烯。3.PAF为一重要炎症介质，可促使肿瘤坏死因子，白细胞介素I的形成。4.PAF还可以直接收缩大脑的小动脉，减少大脑血流局部血液供应。
PAF的上述病理生理作用，可能是PAF引起神经元继发损伤的原因，有待进一步研究证实。
*国家自然科学基金资助
参考文献
1 Baquet P, Touqui L, Shen TS, et al. Perspective in platelet-activating factor reseach. Pharmacol Rev, 1987,39(2):97.
, 百拇医药
2 Liudersherg PJ, Yue TL, Frerich KU, et al. Evidence for platelet-activating factor as a novel mediator in experimental stroke in rabbits. Stroke, 1990,21:1452.
3 Yamamoto M, Tamara A, Kirino T, et al. Behavioral changes after focal cerebral ischemia by left middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res, 1988,452:303.
4 Masayasu Matasumoto. Predication of stroke before and after unilateral occlusion of the common carotid artery in gerbils. Stroke,1988,19(4):490
, http://www.100md.com
5 Peter Coyle. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke, 1982, 13(6):355.
6 Tokumara A. Quantitative analysis of platelet-activating factor in rat brain. Life Sci, 1992,51(4):303.
7 Benvensite J. Leukocyte-dependent histamine release from rabbit platelet: the role of IgE, basophils, and a platelet activating factor. J Exp Med, 1972,136:1356.
8 Kornecki E, Ehrich HY. Neuroregulatory and neuropathological actions of the ether-phospholipid, platelet-activating factor. Science,1988,240:1792.
9 Gerhard WB, Gilbert W, Thomas B. Infarct reduction by the platelet activating factor antagonist Apafant in rats. Stroke,1992,23:98.
10 Keiji Nishida, Markey SP. Platelet-activating factor in brain regions after transient ischemia in gerbils. Stroke, 1996,27:514.
(1997年8月28日收稿，1998年3月17日修回), 百拇医药
单位：李麟仙 王子灿 昆明医学院病理生理教研室(昆明650031)；方思伟 中山市博爱医院内科
关键词：血小板活化因子；局部脑缺血；沙鼠亚科；大鼠
中国病理生理杂志990503 摘 要 目的：血小板活化因子(PAF)拮抗剂能改善局部脑缺血所致功能和组织损伤，本文在沙土鼠单侧脑缺血及大鼠大脑中动脉凝闭的局部脑缺血观察了缺血后大脑组织PAF的变化。方法：PAF的测定采用薄层层析进行PAF分离提取，用生物法测定PAF含量的变化。结果：1.沙土鼠右侧颈总动脉结扎3 h再灌2 h，右侧大脑组织PAF含量明显高于左侧。2.大鼠左侧脑中动脉凝闭后48 h，左侧大脑组织PAF含量明显高于右侧。结论：PAF在局部脑缺血继发神经元损伤中可能有一定作用。
Platelet-activating factor in brain after regional ischemia in gerbils and rats
, 百拇医药
FANG Si-Wei, LI Lin-Xian, WANG Zi-Can
Department of Pathophysiolog, Kunming Medical College, Kunming(650031)
Abstract AIM:Platelet-activating factor(PAF) bas been reported to be an active mediator of neuronal damage in regional cerebral ischemia on the basis of indirect pharmacological data from PAF antagonists. The direct measurement of PAF has not been reported previously in regional cerebral ischemia. It prompted us to investigate the change of PAF in unilateral ischemia in gerbils and regional ischemia in rats.METHODS：Thin layer chromatography was combined with biological methods for the determination of PAF in brain after cerebral ischemia.RESULTS：(1) The PAF content of ischemic brain was increaesd significantly in gerbils subjected to 3 h unilateral cerebral ischemia followed by 2h reperfusion respectively(4.40±0.90) and (1.30±0.40) pg/g, P<0.05. (2)The PAF content of ischemic brain was increased significantly also in rats subjected to 48 h regional ischemia respectively(5.74±0.75) and (0.76±0.05)pg/g, P<0.05. CONCLUSION：PAF could contribute to secondary neuronal damage after regional cerebral ischemia.
, 百拇医药
MeSH Platelet activating factor; Cerebral ischemia; Gerbillinae; Rats
血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)为一很强的非特异性磷脂介质，参与多种病理过程。PAF可诱导血小板聚集，引起脑血管收缩，减少大脑局部血流量，增加血脑屏障通透性，激活中性白细胞，形成脂质过氧化物[1]。近年对PAF在脑缺血继发神经元损伤中的作用，引起了关注[2]。但关于局部脑缺血时大脑组织PAF的变化，文献中尚未见报道，PAF在局部脑缺血发病中的作用系来自间接证明，即应用PAF拮抗剂可减轻局部脑缺血后机能和组织损伤[3]。本实验目的在于观察沙土鼠单侧脑缺血及大鼠局部脑缺血时大脑组织PAF含量的变化，进一步证明PAF在局部脑缺血继发神经元损伤发病中的作用。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、实验动物：
健康沙土鼠，雌雄不拘，体重(67±4) g(
)；Wistar大鼠，雄性，体重(355±24) g，由本院动物科供给。二、脑缺血动物模型的复制：
1.沙土鼠单侧脑缺血及再灌模型：首先参照Masayasu方法[4]对实验动物进行筛选：由于只有30%沙土鼠两侧大脑前动脉间缺乏交通支，因而只有这部分动物在结扎一侧颈总动脉后，才有可能复制单侧脑缺血。预选方法为：沙土鼠以100 mg/kg氨胺酮(ip)麻醉，颈前正中切口，分离左侧颈总动脉，将小橡皮条贴附于该动脉上，然后用丝线一并结扎，60 s后剪断丝线，抽出小条让动脉再通，观察30 min沙土鼠神经症状，参照Masayasu标准计分，最高分为7分，凡计分在2～7之间的选为实验动物。
, 百拇医药
将挑选的沙土鼠用乙醚吸入麻醉，按上述方法分离并结扎右侧颈总动脉，缺血3 h，剪断结扎直视血管再通，再灌2 h后用乙醚再次麻醉，断头取脑。立即将脑组织置于含0.18%甲酸的冰生理盐水中1 min，使乙酰水解酶失活，随即取出大脑迅速分离左右大脑半球并称重量。
2.大鼠局部脑缺血模型：大鼠以12%水含氯醛按400 mg/kg(i p)麻醉。按Peter法在颧弓和鳞状骨融合点侧1 mm暴露左侧大脑中动脉。用高频电刀电灼凝闭该侧大脑中动脉，术后放回原条件下继续饲养48 h后，水合氯醛再次麻醉动物，断头取脑，按前面所述方法处理脑组织。
三、PAF含量测定方法：
参照Tokumura法[6]淬取脑中脂质。用薄层层析法分离PAF，从层析板取与PAF标准品同比移植(RF)部分，用150 μL氯仿再提取，氮气吹干后溶于50 μL台氏缓冲液中待测。
, 百拇医药
用血小板聚集法测脑组织中PAF含量：制备富含血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，将血小板浓度调至35×109/L～40×109/L，测定血小板聚集幅度，根据标准品PAF剂量效应曲线计算出PAF含量。
四、对提取PAF的鉴定(参照Benvensite法[7])：
1.磷脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)处理：将从薄层层析板上刮下的提取物与PLA2在37℃温育15 min观察对PRP聚集的影响。
2.消炎痛及磷酸肌酸/磷酸肌酸激酶处理：在PRP中加入消炎痛(2 mg/mL)、磷酸肌酸(62.5 μg/10 μL)，磷酸肌酸激酶(30.5 μg/10 μL)，观察提取物对血小板聚集的影响。
, http://www.100md.com
结果
一、PAF的剂量-效应曲线：
10 pg的PAF引起的血小板聚集率为10.6%，60 pg为75.0%，在此剂量范围内呈线性量效关系，r=0.999。
二、提取PAF的鉴定：
与PLA2温育过的从薄层层析板上刮下的提取物不能引起血小板聚集。用消炎痛及CP/CPK处理过的血小板，加入从薄层层析板刮下的提取物后，可见典型的聚集反应。
三、PAF测定的结果：
1.沙土鼠单侧脑缺血后左右大脑半球PAF含量的变化，如表1所见。
表1 沙土鼠单侧脑缺血后3 h再灌2 h后PAF含量的变化
, http://www.100md.com
Tab 1 The changes of brain PAF content in gerbils subjected to 3 h
unilateral cerebral ischemia followed by 2 h reperfusion (
)n
PAF(pg/g)
Nonischemic brain
12
1.30±0.42
Ischemic brain
, http://www.100md.com
12
4.40±0.90*
* P<0.05，vs nonischemic brain
由表1可看出，沙土鼠右侧颈总动脉结扎3 h再灌2 h，右侧大脑组织PAF含量明显高于左侧(P<0.05)。
2.大鼠左侧大脑中动脉闭塞后48 h PAF含量的变化，见表2。
表2 大鼠局部脑缺血后大脑半球PAF含量的变化
Tab 2 The change of brain PAF content in rats subjected to
left middle cerebral artery occlusion for 48 h(
), 百拇医药
n
PAF(pg/g)
Nonischemic brain
10
0.76±0.24
Ischemic brain
10
5.74±0.74*
* P<0.05，vs nonischemic brain
由表2可以看出，大鼠左侧大脑中动脉凝闭后48 h，缺血侧大脑半球PAF含量明显高于右侧(P<0.05)。
, http://www.100md.com
讨论
Korneckie等[8]在体外实验发现3.5 μmol/L的PAF可造成神经细胞变性，并出现神经细胞内钙离子增加。便设想PAF在脑缺血继发神经元损伤中有一定作用，以后相继Gerhard等[9]报道PAF拮抗剂Apafant能减小局部脑缺血的梗塞体积。Apafant的作用与阻止钙内流，减轻神经元损伤及降低血管通透性有关。Frerichs报道给PAF拮抗剂银杏苦内酯能使光化学引起的大鼠局部脑缺血的血流量增加，减轻皮层及海马神经元损伤，减少缺血部位白细胞聚集，以上结果均说明PAF与局部脑缺血时缺血损伤有关。Nishida等[10]报道在沙土鼠双侧颈总动脉结扎所致脑缺血10 min后，大脑皮层海马、丘脑组织PAF含量明显增高，但关于局部脑缺血时，大脑组织PAF含量的变化，迄今未见文献中有报道。我们在沙土鼠单侧脑缺血3 h再灌2 h发现缺血侧脑组织PAF含量明显高于对照侧；在大鼠大脑中动脉凝闭所致局部脑缺血侧脑组织缺血后48 h，PAF含量也显著增高，结合PAF拮抗剂可改善局部脑缺血后神经元缺血性损伤，进一步证实PAF与局部脑缺血继发性神经元损伤密切相关。
, 百拇医药
近年来，对PAF的病理生理研究取得了重大进展，已经阐明：1.PAF有很强的血小板积聚诱导作用。2.PAF和花生四烯酸具有共同的前体，PAF形成增加的同时，也引发花生四烯酸代谢通路形成前列腺素和白三烯。3.PAF为一重要炎症介质，可促使肿瘤坏死因子，白细胞介素I的形成。4.PAF还可以直接收缩大脑的小动脉，减少大脑血流局部血液供应。
PAF的上述病理生理作用，可能是PAF引起神经元继发损伤的原因，有待进一步研究证实。
*国家自然科学基金资助
参考文献
1 Baquet P, Touqui L, Shen TS, et al. Perspective in platelet-activating factor reseach. Pharmacol Rev, 1987,39(2):97.
, 百拇医药
2 Liudersherg PJ, Yue TL, Frerich KU, et al. Evidence for platelet-activating factor as a novel mediator in experimental stroke in rabbits. Stroke, 1990,21:1452.
3 Yamamoto M, Tamara A, Kirino T, et al. Behavioral changes after focal cerebral ischemia by left middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res, 1988,452:303.
4 Masayasu Matasumoto. Predication of stroke before and after unilateral occlusion of the common carotid artery in gerbils. Stroke,1988,19(4):490
, http://www.100md.com
5 Peter Coyle. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke, 1982, 13(6):355.
6 Tokumara A. Quantitative analysis of platelet-activating factor in rat brain. Life Sci, 1992,51(4):303.
7 Benvensite J. Leukocyte-dependent histamine release from rabbit platelet: the role of IgE, basophils, and a platelet activating factor. J Exp Med, 1972,136:1356.
8 Kornecki E, Ehrich HY. Neuroregulatory and neuropathological actions of the ether-phospholipid, platelet-activating factor. Science,1988,240:1792.
9 Gerhard WB, Gilbert W, Thomas B. Infarct reduction by the platelet activating factor antagonist Apafant in rats. Stroke,1992,23:98.
10 Keiji Nishida, Markey SP. Platelet-activating factor in brain regions after transient ischemia in gerbils. Stroke, 1996,27:514.
(1997年8月28日收稿，1998年3月17日修回), 百拇医药