5-羟色胺在野百合碱引起大鼠肺动脉高压发病中的作用
作者：张福琴 李志超 赵德 黄威权 孙本韬
单位：第四军医大学；张福琴(病理生理学教研室)；李志超 赵德化(药理学教研室)；黄威权 组织胚胎学教研室(西安710032)；孙本韬(山西医学院电镜室)
关键词：血清素；高血压；肺动脉；野百合碱；大鼠
中国病理生理杂志990525 摘 要 目的：探讨5-HT在MCT性肺动脉高压中的作用。方法：用免疫组化方法和图象分析技术，测定肺组织中5-HT及其受体的变化；采用MTT法和测微网及钙荧光指示剂Fura 2/Am测定培养的肺动脉平滑肌细胞生长情况和收缩功能以及细胞内游离Ca2+浓度。结果：发现MCT引起大鼠肺动脉高压时肺组织中5-HT(127 494±20 736/mm2)及其受体(14 624±3 010/mm2)阳性细胞数目比对照组(3 720±1 018, 3 430±821/mm2)的均显著增加(P<0.01)。5-HT能使培养的肺动脉平滑肌细胞增生和收缩这种作用与其引起的Ca2+内流有关。结论：5-HT的收缩血管作用和促血管平滑肌细胞增殖作用在MCT性肺动脉高压的发病机制中可能具有重要的意义。
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The role of 5-hydroxypytamine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension
ZHANG Fu-Qin1, LI Zhi-Chao2,ZHAO De-Hua2, HUANG Wei-Quan3, SUN Ben-Tao4
Department of Pathophysiology, 2 Pharmacology, 3 Histology and Embrodylogy, Fouth Military Medical University,Xian (710032),4 Department of Electron Microscope, Shanxi Medical College, Taiyuan
, 百拇医药
Abstract AIM and METHODS: To explore the effect of 5-hydroxytryptamine (5-HT) in monocrotaline(MCT)-induced pulmonary hypertension, 5-HT and 5-HT receptor ( 5-HTR) in pulmonary tissue was observed by immohistochemistry and image analysis system. Cellular growth, constrictions function and free Ca2+ in cultured pulmonary artery smooth muscle cells were measured by the methods of MCT, morphometry and calcium fluorescent probe Fura 2-Am. RESULTS：The numbers of 5-HT(127 494±20 736/mm2) and 5-HTR (14 624±3 010/mm2) positive cells in pulmonary tissue induced by MCT were increased compared with control (3720±1018, 3430±821/mm2). 5-HT could induce both cellular growth and contraction of pulmonary arterial smooth muscle cells. Free Ca2+ in cultured pulmonary arterial smooth muscle cells was significantly increased by 5-HT (242±12 nmol/L) compared with control(95±4 nmol/L).CONCLUSION：Cellular hyperplasia and contraction of pulmonary arterial smooth muscle cells induced by 5-HT were an important mechanism of MCT-induced pulmonary hypertensiom.
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MeSH Serotonin; Hypertension; Pulmonary artery; Monocrotaline; Rats
长期以来，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)与肺动脉高压的关系一直未形成明确的概念，随着研究思路和方法的改进及5-HT受体药理学的发展，现在认为5-HT在肺动脉高压的发生发展中起相当重要的作用。肺动脉和体动脉不同，对5-HT的缩血管效应比对去甲肾上腺素的更敏感。对5-HT在不同原因形成的肺动脉高压中的作用要做具体分析。例如5-HT在肺血栓性肺动脉高压中的作用比在缺氧性肺动脉高压中的作用更为重要[1]。Carillo等报道用5-HT合成抑制剂ρ-chlorophenylalanine可部分阻止野百合碱(monocrotaline,MCT)引起的肺动脉压升高和肺血管阻力增加[2]。Kanai等最近报道在MCT皮下注射后12～72 h动脉血中5-HT含量升高[3]，说明5-HT在MCT性肺动脉高压发生中具有一定作用。但是5-HT在动脉血中升高，为什么只引起肺动脉高压而无体循环高压，为什么5-HT增加只在注射MCT早期，而在肺动脉高压发生时却不增高，这种时相难以吻合的现象如何解释，本实验用免疫组化法做了进一步探讨。
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材料与方法
一、动物及分组：
8周龄雄性SD大鼠20只，体重(180±16) g，由第四军医大学实验动物中心提供。随机分为2组，每组10只。对照组背部皮下注射双蒸水3 mL/kg体重；MCT组背部皮下注射2%MCT 3 mL/kg(60 mg/kg体重)。
二、药品：
5-HT抗体和5-HT抗独特型单克隆抗体，由本校组织胚胎学教研室惠赠。5-HT硫酸肌酐，瑞士进口分装，批号：65-02-29，ABC药盒，购自武汉博士德生物制品公司。小牛血清(NBS)，浙江四季青生物制品研究所，批号19951125。MCT，纯度99%，由山西医学院电镜室惠赠。
RPMI 1640培养基，3-(4，5)-二甲基噻唑-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，二甲基亚砜，EGTA，Triton X-100,均为Sigma公司产品。Fura-2/AM 中国医学科学院药物研究所产品。无钙清洗液：成分：(mmol/L) NaCl 145, KCl 5, MgSO4 1, Glucose 10, Hepes 10, pH 7.40。负载液：成分RPMI 1640培养液含有2 g/L牛血清白蛋白，2 mmol/L谷氨酸，Hepes 10 mmol/L pH7.40。
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三、方法：
从各组实验动物的左肺下叶取组织块，中性甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片2张，其中1张组织切片用于5-HT免疫组化染色[4]，另1张用于5-HT受体免疫组化染色[5]，具体方法如下：
(一)肺组织切片5-HT免疫组化染色：肺组织切片→二甲苯脱蜡(10 min)→100%乙醇脱二甲苯(10 min)→0.5% H2O2，80%甲酶(消耗内源性过氧化物酶20 min)→PBS洗2次5 min/次→兔抗5-HT抗体(1∶5000) 24 h，4℃→PBS洗3次，5 min/次→加二抗(生物素标记的羊抗兔1∶200) 1 h，室温→PBS洗3次，5 min/次→ABC复合物(1∶200)30 min室温→显色。
用正常兔血清取代第一抗体孵育作对照实验。
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(二)肺组织切片5-HT受体免疫组化染色：将兔抗5-HT抗体换为5-HT抗独特型抗体(1∶100)进行免疫组化染色，其他步骤步与(一)相同。
(三)5-HT及5-HT受体阳性细胞记数及相对含量测定：经5-HT抗体及5-HT抗独特型抗体进行免疫组化染色的肺组织切片用图象分析仪测定阳性细胞的数量及其光密度值，每组随机取5张切片(来自5只大鼠)，每张切片连续测定10个视野(0.0627 mm2/视野)内阳性细胞的数目，测定其中30个阳性细胞的光密度值以表示其相对含量。
(四)5-HT对培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞生长及功能的影响：
1.大鼠肺动脉平滑肌细胞培养：雄性SD大鼠，体重100～110 g(第四军医大学实验动物中心提供)，腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg体重)麻醉后，无菌操作取出心肺，置于盛有D-Hanks液的培养皿中，分离肺外动脉，按Chamley-Camplell[6]介绍的贴壁法，培养肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)，即仔细剥离血管周围脂肪及外膜组织，纵形剪开血管壁，用刀片刮除内膜，D-Hanks液冲洗2次，将血管条剪成1 mm×1 mm×1 mm小块，贴附于卡氏培养瓶内，加入含20%小牛血清的RPMI 1640培养液，于CO2培养箱内培养，长满后进行传代。
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2.培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞功能实验：第3代PASMC在卡氏培养瓶内长满后，用0.3%胰蛋白酶消化，在倒置显微镜下观察，待80%细胞开始变圆时加入小牛血清终止消化，取细胞悬液均匀地接种于放有小盖玻片的培养皿中，细胞贴壁培养48 h后，吸出培养液，将贴有平滑肌细胞的小盖玻片随机分为2组，每组4张，分别放入2个培养皿内，第一组为正常对照组，加入生理盐水2 mL，第二组为5-HT组，加入含5-HT 10-5 mol/L的生理盐水2 mL。继续温育30 min后，吸出反应液，加2%多聚甲醛固定30 min，各组小盖玻片经95%乙醇5 min，再入1%伊红染色5 min，常规脱水，透明封固。参照王文颖等的方法[7]，在显微镜下观察各组平滑肌细胞形态，用测微网测定细胞的长度，每组随机测50个细胞，计算各组细胞平均长度。
3.培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖反应：将消化配置好的大鼠PASMC悬液移入96孔板，使细胞数为5×103/孔，培养24 h后，换成5% NBS RPMI 1640培养液，分别加入生理盐水或含5-HT 10-5 mol/L的生理盐水，置培养箱继续培养44 h(24 h更换5-HT 1次)，每孔加入MTT(5 mg/mL)溶液20 μL，37℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸出孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)。
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(五)培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i的测定：将消化配置好的大鼠第三代PASMC悬液移入6孔板，培养24 h后，换成5% NBS RPMI 1640培养液，分别加入生理盐水或5-HT(终浓度10-5 mon/L)，24 h补加1次5-HT，48 h后用0.3%胰蛋白酶消化，无钙清洗液清洗2遍，加负载液调细胞数为2×109/L，用台盼蓝排斥反应测细胞存活程度，要求细胞存活率>90%。取1 mL细胞悬液加Fura-2/AM 10 μmol/L(终浓度)，37℃，温育45 min，1000 r/min离心5 min，弃上清后，用清洗液洗2遍。取1 mL温育10 min，用日立MPF-4型荧光分光光度计以发射波长500 nm，激发波长300～400 nm间进行扫描，测定细胞悬液荧光值F，然后在细胞悬液中加入终浓度为18%的Triton X-100 20 μL，测定Fmax，再加入0.6 mol/L EGTA 20 μL，测定Fmin，依据公式：
, 百拇医药
KD取值224。计算平滑肌细胞[Ca2+]i浓度。
四、统计分析：
全部数据以均数±标准差(
)表示，用组间t检验进行均数差异显著性测验。
结果
一、肺组织中5-HT及5-HT受体阳性细胞数目及其相对含量变化：
肺组织经5-HT抗体及5-HT抗独特型抗体进行免疫组化染色后，MCT组的肺组织切片中阳性细胞的数量明显增多，染色显著加深，用图象分析仪测定其结果(表1)。
表1 肺组织中5-羟色胺及其受体阳性细胞的数目和相对含量的变化
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Tab 1 The changes in number and its relativity content of 5-HT and 5-HT receptor positive
cells in pulmonary tissue (, n=5) Group
5-HT positive cells
5-HT receptor positive cells
Number/mm2
Value of OD
Number/mm2
, 百拇医药
Value of OD
Control
3720±1018
0.3785±0.1949
3430±821
0.6325±0.1288
MCT
127 494±20 736**
1.1640±0.2570**
14 624±3010**
, 百拇医药 0.8319±0.1575**
**P<0.01, vs control; MCT=monocrotaline
二、5-HT对大鼠肺动脉平滑肌细胞收缩功能及生长增殖和Ca2+的影响：
5-HT(10-5 mol/L)能够明显地使培养的大鼠PASMC最大直径缩小，表明5-HT能使PASMC收缩；5-HT也能促使PASMC增殖和显著增加肺动脉平滑肌细胞内Ca2+(表2)。
表2 5-HT羟色胺对培养的肺动脉平滑肌细胞收缩
及生长和[Ca2+]i的作用
Tab 2 The effect of 5-HT on constriction and hyperplasia and [Ca2+]i
, 百拇医药
of cultured pulmonary arterial smooth muscle cells (,n=6) Group
Length of
PASMC(μm)
Value of OD
[Ca2+]i
(nmol/L)
Control
184±49
0.098±0.021
, 百拇医药
95±4
5-HT
115±32**
0.135±0.008**
242±12**
**P<0.01,vs control
讨论
早在1965年Furner等[8]就注意到5-HT在MCT性肺动脉高压中的作用，但未引起足够的重视。最近，Kanai等[3]报道，在皮下注射MCT 3 d后，血浆中5-HT含量已恢复到正常水平。本实验结果发现，在注射MCT后4周，肺组织中5-HT阳性细胞数目及相对含量均增多，说明即使在动脉血中5-HT含量不增加的情况下，肺组织局部5-HT含量也是增多的。提示在MCT性肺动脉高压的病程中，肺组织中5-HT含量可能始终是增多的。这一发现为5-HT在MCT性肺动脉高压的发生发展中具有重要作用提供了更为合理的解释。
, 百拇医药
β型抗独特型抗体具有以下3种特性：具有与配体相似的结构和功能；能和配体相竞争与配体的抗体结合；也能和配体竞争与配体的受体结合。因此，本实验用5-HT抗独特型抗体进行免疫组化染色，对5-HT受体进行定位。本实验观察到5-HT受体阳性细胞数目及其相对含量亦显著增加。为进一步探讨5-HT对肺动脉平滑肌细胞的影响，我们用培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，观察5-HT的作用。实验结果显示5-HT能够引起培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞强烈收缩，表现为肺动脉平滑肌细胞最大长度显著缩短。MTT是一种能接收氢原子的染料，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将黄色的MTT还原为蓝紫色结晶物，用二甲基亚砜溶解后，在酶联免疫检测仪上测定光密度值(OD值)，在一定条件下，OD值与活细胞数及细胞活性成正相关[9]。本实验结果表明，5-HT能使培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞OD值明显增高，提示5-HT可能促进肺动脉平滑肌细胞增殖。用钙荧光指示剂Fura-2/Am测定细胞[Ca2+]i浓度，5-HT能够显著升高肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i，这可能与其引起的肺动脉平滑肌细胞收缩和增殖有关。本实验结果说明肺组织中5-HT聚集及其受体增多，在MCT性肺动脉高压的发生发展中可能起重要作用。
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参考文献
1 许澍淮.5-HT与心血管.见吴其夏主编.体液因素和血液循环病理生理学.第1版.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991.13～24.
2 Carillo L, Aviado DM. Monocrotaline-induced pulmonary hypertension and p-chorophenylalanine. Lab Invest, 1969,20(2):243.
3 Kanai Y, Hori S, Tanaka T, et al. Role of 5-hydroxytryptamine in the progression of monocrotaline induced pulmonary hypertension in rats. Cardiovasc Res, 1993, 27(9):1619.
, 百拇医药
4 Huang WQ, Fang YQ, Su HC, et al. Immunohistochemical localization of 5-HT in amphioxus. Chin Sci Bull, 1991, 36(4):329.
5 黄晓峰，黄威权，孙 岚，等.大鼠肝癌细胞系5-羟色胺及其受体的免疫细胞化学定位.科学通报，1995，40(6)：651.
6 Chamley-Campleu J, Camplell GR. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev, 1979, 59(1):1.
7 王文颖，周吕.八肽胆囊收缩素对大鼠胃平滑肌细胞收缩活动的作用.基础医学与临床，1996，16(1)：44.
8 Furner JH, Lalich J. Experimental cor pulmonale in the rat. Arch Pathol, 1965, 79(4):409.
9 Ohsawa F. Response of embryonic rat hippocampal neurons in culture to neurotrophin-3, brain derived neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. Neuroscience, 1993, 57(1):67.
(1997年10月6日收稿，1998年3月11日修回), 百拇医药
单位：第四军医大学；张福琴(病理生理学教研室)；李志超 赵德化(药理学教研室)；黄威权 组织胚胎学教研室(西安710032)；孙本韬(山西医学院电镜室)
关键词：血清素；高血压；肺动脉；野百合碱；大鼠
中国病理生理杂志990525 摘 要 目的：探讨5-HT在MCT性肺动脉高压中的作用。方法：用免疫组化方法和图象分析技术，测定肺组织中5-HT及其受体的变化；采用MTT法和测微网及钙荧光指示剂Fura 2/Am测定培养的肺动脉平滑肌细胞生长情况和收缩功能以及细胞内游离Ca2+浓度。结果：发现MCT引起大鼠肺动脉高压时肺组织中5-HT(127 494±20 736/mm2)及其受体(14 624±3 010/mm2)阳性细胞数目比对照组(3 720±1 018, 3 430±821/mm2)的均显著增加(P<0.01)。5-HT能使培养的肺动脉平滑肌细胞增生和收缩这种作用与其引起的Ca2+内流有关。结论：5-HT的收缩血管作用和促血管平滑肌细胞增殖作用在MCT性肺动脉高压的发病机制中可能具有重要的意义。
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The role of 5-hydroxypytamine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension
ZHANG Fu-Qin1, LI Zhi-Chao2,ZHAO De-Hua2, HUANG Wei-Quan3, SUN Ben-Tao4
Department of Pathophysiology, 2 Pharmacology, 3 Histology and Embrodylogy, Fouth Military Medical University,Xian (710032),4 Department of Electron Microscope, Shanxi Medical College, Taiyuan
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Abstract AIM and METHODS: To explore the effect of 5-hydroxytryptamine (5-HT) in monocrotaline(MCT)-induced pulmonary hypertension, 5-HT and 5-HT receptor ( 5-HTR) in pulmonary tissue was observed by immohistochemistry and image analysis system. Cellular growth, constrictions function and free Ca2+ in cultured pulmonary artery smooth muscle cells were measured by the methods of MCT, morphometry and calcium fluorescent probe Fura 2-Am. RESULTS：The numbers of 5-HT(127 494±20 736/mm2) and 5-HTR (14 624±3 010/mm2) positive cells in pulmonary tissue induced by MCT were increased compared with control (3720±1018, 3430±821/mm2). 5-HT could induce both cellular growth and contraction of pulmonary arterial smooth muscle cells. Free Ca2+ in cultured pulmonary arterial smooth muscle cells was significantly increased by 5-HT (242±12 nmol/L) compared with control(95±4 nmol/L).CONCLUSION：Cellular hyperplasia and contraction of pulmonary arterial smooth muscle cells induced by 5-HT were an important mechanism of MCT-induced pulmonary hypertensiom.
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MeSH Serotonin; Hypertension; Pulmonary artery; Monocrotaline; Rats
长期以来，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)与肺动脉高压的关系一直未形成明确的概念，随着研究思路和方法的改进及5-HT受体药理学的发展，现在认为5-HT在肺动脉高压的发生发展中起相当重要的作用。肺动脉和体动脉不同，对5-HT的缩血管效应比对去甲肾上腺素的更敏感。对5-HT在不同原因形成的肺动脉高压中的作用要做具体分析。例如5-HT在肺血栓性肺动脉高压中的作用比在缺氧性肺动脉高压中的作用更为重要[1]。Carillo等报道用5-HT合成抑制剂ρ-chlorophenylalanine可部分阻止野百合碱(monocrotaline,MCT)引起的肺动脉压升高和肺血管阻力增加[2]。Kanai等最近报道在MCT皮下注射后12～72 h动脉血中5-HT含量升高[3]，说明5-HT在MCT性肺动脉高压发生中具有一定作用。但是5-HT在动脉血中升高，为什么只引起肺动脉高压而无体循环高压，为什么5-HT增加只在注射MCT早期，而在肺动脉高压发生时却不增高，这种时相难以吻合的现象如何解释，本实验用免疫组化法做了进一步探讨。
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材料与方法
一、动物及分组：
8周龄雄性SD大鼠20只，体重(180±16) g，由第四军医大学实验动物中心提供。随机分为2组，每组10只。对照组背部皮下注射双蒸水3 mL/kg体重；MCT组背部皮下注射2%MCT 3 mL/kg(60 mg/kg体重)。
二、药品：
5-HT抗体和5-HT抗独特型单克隆抗体，由本校组织胚胎学教研室惠赠。5-HT硫酸肌酐，瑞士进口分装，批号：65-02-29，ABC药盒，购自武汉博士德生物制品公司。小牛血清(NBS)，浙江四季青生物制品研究所，批号19951125。MCT，纯度99%，由山西医学院电镜室惠赠。
RPMI 1640培养基，3-(4，5)-二甲基噻唑-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，二甲基亚砜，EGTA，Triton X-100,均为Sigma公司产品。Fura-2/AM 中国医学科学院药物研究所产品。无钙清洗液：成分：(mmol/L) NaCl 145, KCl 5, MgSO4 1, Glucose 10, Hepes 10, pH 7.40。负载液：成分RPMI 1640培养液含有2 g/L牛血清白蛋白，2 mmol/L谷氨酸，Hepes 10 mmol/L pH7.40。
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三、方法：
从各组实验动物的左肺下叶取组织块，中性甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片2张，其中1张组织切片用于5-HT免疫组化染色[4]，另1张用于5-HT受体免疫组化染色[5]，具体方法如下：
(一)肺组织切片5-HT免疫组化染色：肺组织切片→二甲苯脱蜡(10 min)→100%乙醇脱二甲苯(10 min)→0.5% H2O2，80%甲酶(消耗内源性过氧化物酶20 min)→PBS洗2次5 min/次→兔抗5-HT抗体(1∶5000) 24 h，4℃→PBS洗3次，5 min/次→加二抗(生物素标记的羊抗兔1∶200) 1 h，室温→PBS洗3次，5 min/次→ABC复合物(1∶200)30 min室温→显色。
用正常兔血清取代第一抗体孵育作对照实验。
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(二)肺组织切片5-HT受体免疫组化染色：将兔抗5-HT抗体换为5-HT抗独特型抗体(1∶100)进行免疫组化染色，其他步骤步与(一)相同。
(三)5-HT及5-HT受体阳性细胞记数及相对含量测定：经5-HT抗体及5-HT抗独特型抗体进行免疫组化染色的肺组织切片用图象分析仪测定阳性细胞的数量及其光密度值，每组随机取5张切片(来自5只大鼠)，每张切片连续测定10个视野(0.0627 mm2/视野)内阳性细胞的数目，测定其中30个阳性细胞的光密度值以表示其相对含量。
(四)5-HT对培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞生长及功能的影响：
1.大鼠肺动脉平滑肌细胞培养：雄性SD大鼠，体重100～110 g(第四军医大学实验动物中心提供)，腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg体重)麻醉后，无菌操作取出心肺，置于盛有D-Hanks液的培养皿中，分离肺外动脉，按Chamley-Camplell[6]介绍的贴壁法，培养肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)，即仔细剥离血管周围脂肪及外膜组织，纵形剪开血管壁，用刀片刮除内膜，D-Hanks液冲洗2次，将血管条剪成1 mm×1 mm×1 mm小块，贴附于卡氏培养瓶内，加入含20%小牛血清的RPMI 1640培养液，于CO2培养箱内培养，长满后进行传代。
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2.培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞功能实验：第3代PASMC在卡氏培养瓶内长满后，用0.3%胰蛋白酶消化，在倒置显微镜下观察，待80%细胞开始变圆时加入小牛血清终止消化，取细胞悬液均匀地接种于放有小盖玻片的培养皿中，细胞贴壁培养48 h后，吸出培养液，将贴有平滑肌细胞的小盖玻片随机分为2组，每组4张，分别放入2个培养皿内，第一组为正常对照组，加入生理盐水2 mL，第二组为5-HT组，加入含5-HT 10-5 mol/L的生理盐水2 mL。继续温育30 min后，吸出反应液，加2%多聚甲醛固定30 min，各组小盖玻片经95%乙醇5 min，再入1%伊红染色5 min，常规脱水，透明封固。参照王文颖等的方法[7]，在显微镜下观察各组平滑肌细胞形态，用测微网测定细胞的长度，每组随机测50个细胞，计算各组细胞平均长度。
3.培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖反应：将消化配置好的大鼠PASMC悬液移入96孔板，使细胞数为5×103/孔，培养24 h后，换成5% NBS RPMI 1640培养液，分别加入生理盐水或含5-HT 10-5 mol/L的生理盐水，置培养箱继续培养44 h(24 h更换5-HT 1次)，每孔加入MTT(5 mg/mL)溶液20 μL，37℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸出孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)。
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(五)培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i的测定：将消化配置好的大鼠第三代PASMC悬液移入6孔板，培养24 h后，换成5% NBS RPMI 1640培养液，分别加入生理盐水或5-HT(终浓度10-5 mon/L)，24 h补加1次5-HT，48 h后用0.3%胰蛋白酶消化，无钙清洗液清洗2遍，加负载液调细胞数为2×109/L，用台盼蓝排斥反应测细胞存活程度，要求细胞存活率>90%。取1 mL细胞悬液加Fura-2/AM 10 μmol/L(终浓度)，37℃，温育45 min，1000 r/min离心5 min，弃上清后，用清洗液洗2遍。取1 mL温育10 min，用日立MPF-4型荧光分光光度计以发射波长500 nm，激发波长300～400 nm间进行扫描，测定细胞悬液荧光值F，然后在细胞悬液中加入终浓度为18%的Triton X-100 20 μL，测定Fmax，再加入0.6 mol/L EGTA 20 μL，测定Fmin，依据公式：
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KD取值224。计算平滑肌细胞[Ca2+]i浓度。
四、统计分析：
全部数据以均数±标准差(
)表示，用组间t检验进行均数差异显著性测验。结果
一、肺组织中5-HT及5-HT受体阳性细胞数目及其相对含量变化：
肺组织经5-HT抗体及5-HT抗独特型抗体进行免疫组化染色后，MCT组的肺组织切片中阳性细胞的数量明显增多，染色显著加深，用图象分析仪测定其结果(表1)。
表1 肺组织中5-羟色胺及其受体阳性细胞的数目和相对含量的变化
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Tab 1 The changes in number and its relativity content of 5-HT and 5-HT receptor positive
cells in pulmonary tissue (
, n=5) Group5-HT positive cells
5-HT receptor positive cells
Number/mm2
Value of OD
Number/mm2
, 百拇医药
Value of OD
Control
3720±1018
0.3785±0.1949
3430±821
0.6325±0.1288
MCT
127 494±20 736**
1.1640±0.2570**
14 624±3010**
, 百拇医药 0.8319±0.1575**
**P<0.01, vs control; MCT=monocrotaline
二、5-HT对大鼠肺动脉平滑肌细胞收缩功能及生长增殖和Ca2+的影响：
5-HT(10-5 mol/L)能够明显地使培养的大鼠PASMC最大直径缩小，表明5-HT能使PASMC收缩；5-HT也能促使PASMC增殖和显著增加肺动脉平滑肌细胞内Ca2+(表2)。
表2 5-HT羟色胺对培养的肺动脉平滑肌细胞收缩
及生长和[Ca2+]i的作用
Tab 2 The effect of 5-HT on constriction and hyperplasia and [Ca2+]i
, 百拇医药
of cultured pulmonary arterial smooth muscle cells (
,n=6) GroupLength of
PASMC(μm)
Value of OD
[Ca2+]i
(nmol/L)
Control
184±49
0.098±0.021
, 百拇医药
95±4
5-HT
115±32**
0.135±0.008**
242±12**
**P<0.01,vs control
讨论
早在1965年Furner等[8]就注意到5-HT在MCT性肺动脉高压中的作用，但未引起足够的重视。最近，Kanai等[3]报道，在皮下注射MCT 3 d后，血浆中5-HT含量已恢复到正常水平。本实验结果发现，在注射MCT后4周，肺组织中5-HT阳性细胞数目及相对含量均增多，说明即使在动脉血中5-HT含量不增加的情况下，肺组织局部5-HT含量也是增多的。提示在MCT性肺动脉高压的病程中，肺组织中5-HT含量可能始终是增多的。这一发现为5-HT在MCT性肺动脉高压的发生发展中具有重要作用提供了更为合理的解释。
, 百拇医药
β型抗独特型抗体具有以下3种特性：具有与配体相似的结构和功能；能和配体相竞争与配体的抗体结合；也能和配体竞争与配体的受体结合。因此，本实验用5-HT抗独特型抗体进行免疫组化染色，对5-HT受体进行定位。本实验观察到5-HT受体阳性细胞数目及其相对含量亦显著增加。为进一步探讨5-HT对肺动脉平滑肌细胞的影响，我们用培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，观察5-HT的作用。实验结果显示5-HT能够引起培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞强烈收缩，表现为肺动脉平滑肌细胞最大长度显著缩短。MTT是一种能接收氢原子的染料，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将黄色的MTT还原为蓝紫色结晶物，用二甲基亚砜溶解后，在酶联免疫检测仪上测定光密度值(OD值)，在一定条件下，OD值与活细胞数及细胞活性成正相关[9]。本实验结果表明，5-HT能使培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞OD值明显增高，提示5-HT可能促进肺动脉平滑肌细胞增殖。用钙荧光指示剂Fura-2/Am测定细胞[Ca2+]i浓度，5-HT能够显著升高肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i，这可能与其引起的肺动脉平滑肌细胞收缩和增殖有关。本实验结果说明肺组织中5-HT聚集及其受体增多，在MCT性肺动脉高压的发生发展中可能起重要作用。
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参考文献
1 许澍淮.5-HT与心血管.见吴其夏主编.体液因素和血液循环病理生理学.第1版.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991.13～24.
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3 Kanai Y, Hori S, Tanaka T, et al. Role of 5-hydroxytryptamine in the progression of monocrotaline induced pulmonary hypertension in rats. Cardiovasc Res, 1993, 27(9):1619.
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4 Huang WQ, Fang YQ, Su HC, et al. Immunohistochemical localization of 5-HT in amphioxus. Chin Sci Bull, 1991, 36(4):329.
5 黄晓峰，黄威权，孙 岚，等.大鼠肝癌细胞系5-羟色胺及其受体的免疫细胞化学定位.科学通报，1995，40(6)：651.
6 Chamley-Campleu J, Camplell GR. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev, 1979, 59(1):1.
7 王文颖，周吕.八肽胆囊收缩素对大鼠胃平滑肌细胞收缩活动的作用.基础医学与临床，1996，16(1)：44.
8 Furner JH, Lalich J. Experimental cor pulmonale in the rat. Arch Pathol, 1965, 79(4):409.
9 Ohsawa F. Response of embryonic rat hippocampal neurons in culture to neurotrophin-3, brain derived neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. Neuroscience, 1993, 57(1):67.
(1997年10月6日收稿，1998年3月11日修回), 百拇医药