鼻腔鼻窦鳞癌、癌前期病变与癌基因c-myc扩增的相关性研究*
作者：王继群 王丽华 张 涛 张发歧 陈胜芝
单位：
王继群 王丽华 张 涛 暨南大学医学院第一临床医院耳鼻咽喉科(广州 510630)；张发歧 清远市人民医院耳鼻咽喉科；陈胜芝 湛江市中心医院耳鼻咽喉科
关键词：鼻腔；鼻窦；癌；鳞状细胞；癌基因
中国病理生理杂志990511 摘 要 目的：为明确鼻腔鼻窦鳞癌、癌前期病变与癌基因c-myc的关系，为鼻腔鼻窦鳞癌和癌前期病变的早期诊断和诊疗提供依据和方法。方法：利用分子生物学技术对44例标本进行分子病因学研究，包括24例鼻腔鼻窦鳞癌，15例良性肿瘤和5例鼻腔正常组织。结果：24例鼻腔鼻窦鳞癌c-myc的扩增倍数为10～40倍，癌前期病变组c-myc的扩增倍数为5～10倍，良性肿瘤及鼻腔正常组织中c-myc的扩增倍数为5倍以下。结论：c-myc的扩增水平与鼻腔鼻窦鳞癌的发生有关，与癌前期病变转化为恶性肿瘤有关。因而，c-myc的水平可能作为临床鼻腔鼻窦鳞癌的分子水平诊断和检测鼻腔内翻性乳头状瘤是否有恶变倾向的一种参考指标。
, http://www.100md.com
Relationship between the c-myc amplification and squamous cell
carcinoma and inverted papilloma in nasal cavity and nasal sinus
WANG Ji-Qun(1), ZHANG Fa-Qi(2), CHEN Sheng-Zhi(3), WANG Li-Hua(1), ZHANG Tao(1)
(1)ENT Department of the First Affiliated Hospital, Jinan University Medical College, Guangzhou (510630);
, http://www.100md.com
(2)ENT Department of Qinyuan City Hospital； (3)ENT Department of Zhangjiang City Central Hospital
Abstract AIM: To study the relationship between the c-myc amplification and squamous cell carcinoma inverted papilloma in nasal cavity and nasal sinus.METHODS：44 samples (24 cases of squamous cell carcinoma in nasal cavity and nasal sinus; the benign tumors are 15 cases which are 8 cases of inverted papilloma in nasal cavity, 5 cases of angioma in nasal cavity, 2 cases of maxillary cyst and 5 cases of normal tissue in nose) are studied by moleculobiologic technique. RESULTS：Amplification of c-myc in all of cases as follows: 10～40 times in malignant tumors, 5～10 times in inverted paplilloma, 5 times below in begin tumors and normal tissues. CONCLUSION： Amplificated level of c-myc as a molecular parameter might be used to detect whether inverted paplilloam in nasal cavity were changing into malignance early. The amplification of c-myc is responsible for the squamous cell carcinoma in nasal cavity and nasal sinus.
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MeSH Nasal cavity; Paranasal sinuses; Carcinoma, squamous cell; Oncogenes
许多研究表明，自然环境中很多物理、化学和生物因素都可以使癌基因激活，而这些变化又可以在癌症的演进过程中得到发展。上述3种因素所致细胞突变可以探究到DNA分子-基因水平。所有致癌因素最终一定要改变细胞的遗传物质才能发生致癌效应，鼻部恶性肿瘤也不例外。
材料与方法
一、临床资料、仪器及试剂：
共收集鼻腔鼻窦鳞癌24例，男性13例，女性11例，年龄35～70岁，病史1～3年。鼻腔鼻窦良性肿瘤15例(包括鼻腔血管瘤5例、上颌窦囊肿2例及临床称为癌前期病变的鼻内翻性乳头状瘤8例)，鼻腔正常组织5例；良性肿瘤组中男性11例，女性9例，年龄18～59岁。所有病变标本均取自术中或组织活检，且经过病理学诊断，正常鼻腔组织取自健康自愿提供者。
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二、方法：
(一)组织DNA的提取：采用蛋白酶K消化，酚/氯仿异戊醇抽提，乙醇沉淀法。100 mg新鲜组织，0℃条件下5 mL匀浆缓冲液(100 mmol/L Trils, 10 mmol/L EDTA, pH7.4)中制备组织匀浆，然后加入等体积消化缓冲液(20 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Trils, 20 mmol/L EDTA, pH7.4,含200 μg蛋白酶K/mL和0.2% SDS)，置37℃水浴消化3 h，然后加入等体积的水饱和酚的1/2体积氯仿异戊醇(2.4∶1)抽提2次，再用等体积的氯仿异戊醇提取1次，抽水相，无水乙醇沉淀后置于TE液体中。
(二)C-myc DNA探针的制备：扩增克隆转化菌，大量制备重组质粒，内切酶消化，凝胶电泳分离DNA片段，纯化后经缺口转化法，用[α-32 P]dATP标记。
(三)Dot blot DNA杂交：参照Conrad G杂交法[1]，每份标本DNA取3 μg，依次以15倍稀释成5个浓度，分别点膜。对照组采用全基因质粒，取1 μg依次以15倍稀释成5个浓度点膜，室温风干，80℃烤2 h。将已结合DNA的硝酸纤维放入可封口的耐热塑料袋中进行预杂交、杂交、放射自显影和激光扫描。
, 百拇医药
结果
B1-B7，C1-C5，D1-D5，E5，E7，F7，G2-G5共24例为鼻腔鼻窦鳞癌的标本，属c-myc高倍扩增组，扩增倍数为10～40倍；A6，A7，C6，C7，E1-E4，E6，F5-F6，G1，G6，G7共15例为鼻腔鼻窦良性肿瘤组，扩增倍数10倍以下。其中8例鼻内翻性乳头状瘤(临床上属癌前期病变)c-myc的扩增倍数为5～10倍。鼻腔血管瘤和上颌窦囊肿的c-myc扩增倍数为5倍以下。D6，F1-F4共5例为鼻腔正常组织的扩增倍数为5倍以下。见图1，2。
Fig 1 Autoradiol photograph in Dot blot hybridization
Vertical position is instead of 1,2,3,4,5,6,7 horizotal position is instead of A,B,C,D,E,F,G
, 百拇医药
图1 斑点杂交的放射自显影照片
Fig 2 Amplificative appearance of c-myc in different three groups of pathological changes and nasal tissue
图2 3组不同病变及组织的c-myc扩增表现
讨论
一、鼻腔鼻窦鳞癌c-myc癌基因激活的可能机制：
细胞癌变首先是癌基因的激活[2，3]。本实验已表明鼻腔鼻窦鳞癌c-myc的扩增倍数显著高于良性肿瘤及正常组织，说明癌细胞在被激活的c-myc控制下快速生长。c-myc是鼻腔鼻窦鳞癌不断增长的重要指令之一。目前认为癌基因激活至少有6种因素：(1)促进因子插入，(2)基因藕联，(3)基因突变，(4)基因扩增，(5)基因重排，(6)“游击”机制。其中以“促进因子插入”较为重要。即某些异体成分对细胞原癌基因的顺式激活作用[4，5]。异体成分最重要因素为病毒。在肿瘤细胞中的病毒通常是有缺陷性的，仅含有部分病毒基因序列。当病毒基因整合在细胞基因相邻位点时，这段插入的特异性核苷酸序列对癌基因产生激活作用。大多数引起肿瘤的逆转录病毒整合于细胞癌基因的下游，起顺式激活癌基因和干扰细胞癌基因的负调节作用。
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二、鼻腔鼻窦癌前期病变转为恶性肿瘤的分子基础：
鼻腔内翻性乳头状瘤是一种真性上皮瘤，分硬性和软性两种。前者来自鳞状上皮，又称鳞状上皮乳头状瘤；后者来自粘膜的上皮组织，又称内翻性乳头状瘤。它呈弥漫性生长，有破坏力，可以侵入颅腔，切除后易复发，有恶变倾向。临床上通常作癌前期病变处理。目前为什么内翻性乳头状瘤有上述临床表现，目前尚无从解释。形态学研究表明，内翻性乳头状瘤，有时可见细胞间桥，基底膜完整，易破坏周围的组织及骨质。那么同是内翻性乳头状瘤，有的可发生恶变，有的则不发生恶变。本研究从分子水平提示，c-myc癌基因可能是这一环节的重要因素。我们的研究发现，内翻性乳头状瘤c-myc基因的扩增倍数为5～10倍，与恶性肿瘤的10～40倍相比有显著差异，与鼻腔正常组织及鼻窦囊肿的0～5倍也有显著差异。而且从参数上看，c-myc在内翻性乳头状瘤细胞中处于边缘或部分活化状态因素。能否发生恶变可能与刺激或激活c-myc的因子有关。至于是什么内在或外在的激活因子起作用，尚需进一步研究。但是至少c-myc癌基因的扩增倍数可作为内翻性乳头状瘤是否发生恶变的一个参考指标。因为DNA分子的变化总是发生在细胞形态演进之前。
, 百拇医药
* 广东省自然科学基金资助(No 3930014)
参考文献
1 Conrads G, Mutters R, Fischer J, et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plague samples of periodontally healthy individuals. J Periodontol,1996,67:994.
2 Suzuki S, Tenjin J, Watanabe H, et al. Low level c-myc gene amplification in gastric cancer detected by dual color fluorescence in situ hybridization analysis. J Surg Oncol,1997,66:173.
, http://www.100md.com
3 Dooley S, Wurdrack I, Blin N, et al. Coexpression pattern of c-myc associated genes in a small cell lung cancer line with high steady state c-myc transcription. Biochem Biophys Res Commun,1995,61:698.
4 Jiqun W, Baoron C, Guoxuan B. Study on DNA sequences of human papilloma in laryngeal carcinoma and laryngeal precancerous conditions. Kitasato Med, 1993,23:499.
5 王继群，卜国铉.喉鳞癌及癌前期病变中HPV-DNA的检测.中华耳鼻咽喉科杂志，1993，增刊：43.
(1998年8月4日收稿，1998年12月7日修回), http://www.100md.com
单位：
王继群 王丽华 张 涛 暨南大学医学院第一临床医院耳鼻咽喉科(广州 510630)；张发歧 清远市人民医院耳鼻咽喉科；陈胜芝 湛江市中心医院耳鼻咽喉科
关键词：鼻腔；鼻窦；癌；鳞状细胞；癌基因
中国病理生理杂志990511 摘 要 目的：为明确鼻腔鼻窦鳞癌、癌前期病变与癌基因c-myc的关系，为鼻腔鼻窦鳞癌和癌前期病变的早期诊断和诊疗提供依据和方法。方法：利用分子生物学技术对44例标本进行分子病因学研究，包括24例鼻腔鼻窦鳞癌，15例良性肿瘤和5例鼻腔正常组织。结果：24例鼻腔鼻窦鳞癌c-myc的扩增倍数为10～40倍，癌前期病变组c-myc的扩增倍数为5～10倍，良性肿瘤及鼻腔正常组织中c-myc的扩增倍数为5倍以下。结论：c-myc的扩增水平与鼻腔鼻窦鳞癌的发生有关，与癌前期病变转化为恶性肿瘤有关。因而，c-myc的水平可能作为临床鼻腔鼻窦鳞癌的分子水平诊断和检测鼻腔内翻性乳头状瘤是否有恶变倾向的一种参考指标。
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Relationship between the c-myc amplification and squamous cell
carcinoma and inverted papilloma in nasal cavity and nasal sinus
WANG Ji-Qun(1), ZHANG Fa-Qi(2), CHEN Sheng-Zhi(3), WANG Li-Hua(1), ZHANG Tao(1)
(1)ENT Department of the First Affiliated Hospital, Jinan University Medical College, Guangzhou (510630);
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(2)ENT Department of Qinyuan City Hospital； (3)ENT Department of Zhangjiang City Central Hospital
Abstract AIM: To study the relationship between the c-myc amplification and squamous cell carcinoma inverted papilloma in nasal cavity and nasal sinus.METHODS：44 samples (24 cases of squamous cell carcinoma in nasal cavity and nasal sinus; the benign tumors are 15 cases which are 8 cases of inverted papilloma in nasal cavity, 5 cases of angioma in nasal cavity, 2 cases of maxillary cyst and 5 cases of normal tissue in nose) are studied by moleculobiologic technique. RESULTS：Amplification of c-myc in all of cases as follows: 10～40 times in malignant tumors, 5～10 times in inverted paplilloma, 5 times below in begin tumors and normal tissues. CONCLUSION： Amplificated level of c-myc as a molecular parameter might be used to detect whether inverted paplilloam in nasal cavity were changing into malignance early. The amplification of c-myc is responsible for the squamous cell carcinoma in nasal cavity and nasal sinus.
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MeSH Nasal cavity; Paranasal sinuses; Carcinoma, squamous cell; Oncogenes
许多研究表明，自然环境中很多物理、化学和生物因素都可以使癌基因激活，而这些变化又可以在癌症的演进过程中得到发展。上述3种因素所致细胞突变可以探究到DNA分子-基因水平。所有致癌因素最终一定要改变细胞的遗传物质才能发生致癌效应，鼻部恶性肿瘤也不例外。
材料与方法
一、临床资料、仪器及试剂：
共收集鼻腔鼻窦鳞癌24例，男性13例，女性11例，年龄35～70岁，病史1～3年。鼻腔鼻窦良性肿瘤15例(包括鼻腔血管瘤5例、上颌窦囊肿2例及临床称为癌前期病变的鼻内翻性乳头状瘤8例)，鼻腔正常组织5例；良性肿瘤组中男性11例，女性9例，年龄18～59岁。所有病变标本均取自术中或组织活检，且经过病理学诊断，正常鼻腔组织取自健康自愿提供者。
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二、方法：
(一)组织DNA的提取：采用蛋白酶K消化，酚/氯仿异戊醇抽提，乙醇沉淀法。100 mg新鲜组织，0℃条件下5 mL匀浆缓冲液(100 mmol/L Trils, 10 mmol/L EDTA, pH7.4)中制备组织匀浆，然后加入等体积消化缓冲液(20 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Trils, 20 mmol/L EDTA, pH7.4,含200 μg蛋白酶K/mL和0.2% SDS)，置37℃水浴消化3 h，然后加入等体积的水饱和酚的1/2体积氯仿异戊醇(2.4∶1)抽提2次，再用等体积的氯仿异戊醇提取1次，抽水相，无水乙醇沉淀后置于TE液体中。
(二)C-myc DNA探针的制备：扩增克隆转化菌，大量制备重组质粒，内切酶消化，凝胶电泳分离DNA片段，纯化后经缺口转化法，用[α-32 P]dATP标记。
(三)Dot blot DNA杂交：参照Conrad G杂交法[1]，每份标本DNA取3 μg，依次以15倍稀释成5个浓度，分别点膜。对照组采用全基因质粒，取1 μg依次以15倍稀释成5个浓度点膜，室温风干，80℃烤2 h。将已结合DNA的硝酸纤维放入可封口的耐热塑料袋中进行预杂交、杂交、放射自显影和激光扫描。
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结果
B1-B7，C1-C5，D1-D5，E5，E7，F7，G2-G5共24例为鼻腔鼻窦鳞癌的标本，属c-myc高倍扩增组，扩增倍数为10～40倍；A6，A7，C6，C7，E1-E4，E6，F5-F6，G1，G6，G7共15例为鼻腔鼻窦良性肿瘤组，扩增倍数10倍以下。其中8例鼻内翻性乳头状瘤(临床上属癌前期病变)c-myc的扩增倍数为5～10倍。鼻腔血管瘤和上颌窦囊肿的c-myc扩增倍数为5倍以下。D6，F1-F4共5例为鼻腔正常组织的扩增倍数为5倍以下。见图1，2。
Fig 1 Autoradiol photograph in Dot blot hybridization
Vertical position is instead of 1,2,3,4,5,6,7 horizotal position is instead of A,B,C,D,E,F,G
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图1 斑点杂交的放射自显影照片
Fig 2 Amplificative appearance of c-myc in different three groups of pathological changes and nasal tissue
图2 3组不同病变及组织的c-myc扩增表现
讨论
一、鼻腔鼻窦鳞癌c-myc癌基因激活的可能机制：
细胞癌变首先是癌基因的激活[2，3]。本实验已表明鼻腔鼻窦鳞癌c-myc的扩增倍数显著高于良性肿瘤及正常组织，说明癌细胞在被激活的c-myc控制下快速生长。c-myc是鼻腔鼻窦鳞癌不断增长的重要指令之一。目前认为癌基因激活至少有6种因素：(1)促进因子插入，(2)基因藕联，(3)基因突变，(4)基因扩增，(5)基因重排，(6)“游击”机制。其中以“促进因子插入”较为重要。即某些异体成分对细胞原癌基因的顺式激活作用[4，5]。异体成分最重要因素为病毒。在肿瘤细胞中的病毒通常是有缺陷性的，仅含有部分病毒基因序列。当病毒基因整合在细胞基因相邻位点时，这段插入的特异性核苷酸序列对癌基因产生激活作用。大多数引起肿瘤的逆转录病毒整合于细胞癌基因的下游，起顺式激活癌基因和干扰细胞癌基因的负调节作用。
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二、鼻腔鼻窦癌前期病变转为恶性肿瘤的分子基础：
鼻腔内翻性乳头状瘤是一种真性上皮瘤，分硬性和软性两种。前者来自鳞状上皮，又称鳞状上皮乳头状瘤；后者来自粘膜的上皮组织，又称内翻性乳头状瘤。它呈弥漫性生长，有破坏力，可以侵入颅腔，切除后易复发，有恶变倾向。临床上通常作癌前期病变处理。目前为什么内翻性乳头状瘤有上述临床表现，目前尚无从解释。形态学研究表明，内翻性乳头状瘤，有时可见细胞间桥，基底膜完整，易破坏周围的组织及骨质。那么同是内翻性乳头状瘤，有的可发生恶变，有的则不发生恶变。本研究从分子水平提示，c-myc癌基因可能是这一环节的重要因素。我们的研究发现，内翻性乳头状瘤c-myc基因的扩增倍数为5～10倍，与恶性肿瘤的10～40倍相比有显著差异，与鼻腔正常组织及鼻窦囊肿的0～5倍也有显著差异。而且从参数上看，c-myc在内翻性乳头状瘤细胞中处于边缘或部分活化状态因素。能否发生恶变可能与刺激或激活c-myc的因子有关。至于是什么内在或外在的激活因子起作用，尚需进一步研究。但是至少c-myc癌基因的扩增倍数可作为内翻性乳头状瘤是否发生恶变的一个参考指标。因为DNA分子的变化总是发生在细胞形态演进之前。
, 百拇医药
* 广东省自然科学基金资助(No 3930014)
参考文献
1 Conrads G, Mutters R, Fischer J, et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plague samples of periodontally healthy individuals. J Periodontol,1996,67:994.
2 Suzuki S, Tenjin J, Watanabe H, et al. Low level c-myc gene amplification in gastric cancer detected by dual color fluorescence in situ hybridization analysis. J Surg Oncol,1997,66:173.
, http://www.100md.com
3 Dooley S, Wurdrack I, Blin N, et al. Coexpression pattern of c-myc associated genes in a small cell lung cancer line with high steady state c-myc transcription. Biochem Biophys Res Commun,1995,61:698.
4 Jiqun W, Baoron C, Guoxuan B. Study on DNA sequences of human papilloma in laryngeal carcinoma and laryngeal precancerous conditions. Kitasato Med, 1993,23:499.
5 王继群，卜国铉.喉鳞癌及癌前期病变中HPV-DNA的检测.中华耳鼻咽喉科杂志，1993，增刊：43.
(1998年8月4日收稿，1998年12月7日修回), http://www.100md.com