低密度脂蛋白对培养的人肾小球系膜细胞的增殖作用及冬虫夏草对其的影响*
作者：王筱霞 吴兆龙
单位：上海医科大学中山医院肾内科(上海200032)
关键词：人类；脂蛋白类；LDL；冬虫夏草；肾小球硬化症；病灶性
中国病理生理杂志990507 摘 要 目的：探讨肾小球硬化的发病机理；并发现治疗肾小球硬化的治疗方法。方法：(1)通过测定[3H]胸腺嘧啶的掺入率，检测体外培养的人肾小球系膜细胞的增殖；(2)对人肾小球系膜细胞进行纯化和培养并对低密度、高密度脂蛋白进行[125I]标记。结果：(1)肾小球系膜细胞选择性结合和摄取[125I]LDL，(2)LDL刺激系膜细胞增殖且增殖作用具有双向性，(3)冬虫夏草对LDL 引起的细胞增殖具有抑制作用。结论：LDL刺激系膜细胞增殖可能直接参与肾小球硬化的发病，高脂血症对肾脏的损害可能由肾小球系膜细胞介导；抑制系膜细胞增殖可能对肾小球硬化的防治具有一定的可行性。
, http://www.100md.com
Proliferation of cultured human mesangial cells caused
by LDL and the adserse effect of Cordyceps
WANG Xiao-Xia, WU Zhao-Long
Shanghai Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai(200032)
Abstract AIM:To study the pathogenesis of glomerulosclerosis in vitro and find a treatment method of glomerulosclerosis.METHODS：Human glomerular mesangial cells were purified and cultured: Low density lipoprotein(LDL) and high density lipoprotein (HDL) labelled with [125 I]; and human mesangial cells (HMC) proliferation measured by counting [3 H] thymidine incorporation. RESULTS：(1) Cultured HMC uptake [125 I]LDL selectively, (2)LDL stimulated HMC proliferation and had a biphasic effect on HMC proliferation, (3)Cordyceps militaris had a strong inhibition on HMC proliferation induced by LDL. CONCLUSIONS： HMC proliferation induced by LDL may directly participate in the pathogenesis of glomerulosclerosis. The deleterious effects of hyperlipidemia on the kidney may be mediated by HMC. Therefore, inhibiting HMC proliferation may be practicable in the treatment of progressive glomerulosclerosis.
, 百拇医药
MeSH Human; Lipoproteins, LDL; Glomerulosclerosis, focal; Cordyceps sinensis
肾小球硬化是导致肾功能减退的主要因素之一[1]。研究发现，高脂血症与肾小球硬化关系密切。高脂血症时，大量脂质沉积在系膜细胞表面引起细胞 增殖，可能是导致肾小球硬化的关键[2]，作用机理还不太清楚。为了在细胞水平阐明高脂血症损伤肾小球，导致肾小球硬化的机理，本实验利用体外培养的肾小球系膜细胞和[125I]标记的低密度脂蛋白(low density lipoprotein)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein)，研究了系膜细胞对低密度脂蛋白的结合和摄取。低密度脂蛋白对系膜细胞的增殖作用；并首次报道冬虫夏草对系膜细胞的影响。
材料与方法
一、人肾小球系膜细胞的培养、鉴定及脂蛋白的分离、标记：
, http://www.100md.com
按美国明尼苏达大学医学院Morks.Paler教授提供的培养方法。对人肾小球系膜细胞进行了纯化及传代培养，并进行了细胞鉴定；用密度梯度法分离血液获得低(高)密度脂蛋白并利用固相氧化法对其分别进行[125 I]标记。
二、系膜细胞对标记的低密度脂蛋白的结合和摄取：
将第3代细胞以2×104浓度接种于96孔培养板，置于培养箱中(37℃，5% CO2)孵育3～4 d细胞长至半汇合状态后，使细胞处于同步静止状态。将10 μg/mL碘标记的低高密度脂蛋白分别加入培养板孔内(n=8)，设空白对照，孵育5 h后，4℃ Hanks液充分漂洗：4℃ 0.5%三氯甲烷充分漂洗，用1 mol/L NaOH溶解细胞，室温下置24 h，收集细胞碎片，烘干滤纸进行放射计数测定。
三、低密度脂蛋白对系膜细胞增殖作用的影响：
, 百拇医药
浆系膜细胞同步静止后，加入不同浓度的低密度脂蛋白(5 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/L，100 μg/mL，150 μg/mL，200 μg/mL，n=8)。每孔按 3.7×104 Bq加入[3H]胸腺嘧啶，设对照组。孵育24 h(37℃，5% CO2)，Hanks液充分漂洗及5%三氯乙酸洗涤，0.5%胰蛋白酶及0.02% EDTA(1：1)溶液溶解细胞，收集细胞碎片，进行放射计数测定。
四、冬早夏草对低密度脂蛋白产生的系膜细胞增殖的影响：
系膜细胞同步静止化后，加入不同浓度(100 μg/mL，200 μg/mL， 300 μg/mL， 400 μg/mL)的天然冬虫夏草，3.7×104 Bq/孔的[3H]胸腺嘧啶及10 μg/mL的低密度脂蛋白共同孵育24 h；北冬虫夏草(人工合成)实验组方法同上并同时设实验对照组：以下漂洗及溶解，收集细胞碎片，同位素计数测定。
, http://www.100md.com
五、统计方法：
数据以
表示，采用t检验和方差分析。
结果
(一)系膜细胞的鉴定和脂蛋白的分离及标记结果：免疫组化标记结果、胞浆内结蛋白(desmin)、肌动蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)均为阳性表达、Ⅷ因子(F8)及角蛋白(cytokeratin)阴性。血浆脂蛋白的分离结果显示：碘标记的低(高)密度脂蛋白的放化纯度均达98.7%。
(二)系膜细胞对碘标记的低密度脂蛋白的结合摄取：结果显示：低密度脂蛋白组的放射counts.min-1(7304.0±974.0，n=8)明显高于高密度脂蛋白组(303.0±35.0，n=8)，P<0.01。
, http://www.100md.com
(三)低密度脂蛋白对系膜细胞增殖作用的影响：见表1。
表1 不同浓度低密度脂蛋白对系膜细胞的影响
Tab 1 The effect of different concentration of LDL(low density
lipoprotein) on mesangial cells(,n=8) Group
Concentration of LDL
(μg/mL)
Counts.min-1
, 百拇医药
Control
0
62.5±18.3
LDL
5
919.5±216.0*
10
1106.0±132.0**
50
1200.0±311.0**
100
1690.0±307.0**
, http://www.100md.com
150
511.8±105.0*
200
456.1±115.0*
*P<0.05,**P<0.01, vs control
(四)北冬虫夏草及天然冬虫夏草对低密度脂蛋白产生的系膜细胞增殖的影响：见表2。
表2 冬虫夏草对LDL引起的系膜细胞增殖的影响
Tab 2 The effect of Cordyceps on proliferation of
mesangial cells caused by LDL(,n=8) Group
, 百拇医药
Counts.min-1
Blank
20.0±6.0
LDL (10 μg/mL)
1106.0±132.0
Cordyceps sinenis (μg/mL)+LDL(μg/mL)
100 + 10
192.0±25.0*
200 + 10
168.0±16.0**
, http://www.100md.com
300 + 10
145.0±20.0**
400 + 10
72.0±16.0**
Cordyceps militaris (μg/mL)+LDL(μg/mL)
100 + 10
99.5±21.0**
200 + 10
80.2±11.0**
300 + 10
, 百拇医药
79.8±19.0**
400 + 10
70.3±8.0**
*P<0.05,**P<0.01, vs LDL
讨论
肾小球固有细胞有3种：脏层上皮细胞、毛细血管内皮细胞和系膜细胞，实验的培养鉴定结果显示传代培养的人肾小球系膜细胞纯度极高，不含有上皮细胞及内皮细胞。
[125I]标记的低密度脂蛋白与系膜细胞亲和力高，并与细胞特异性结合，肝素及过量未标记的低密度脂量白均能阻断二者的结合[4]。我们的实验结果显示：[125I]标记的低密度脂蛋白组的counts.min-1计数明显高于高密度脂蛋白组，统计结果具有显著差异。故脂蛋白对系膜细胞的作用可能主要通过低密度脂蛋白，此项结果为系膜细胞通过特异性受体结合机制结合和摄取低密度脂蛋白提供了有力证据。
, 百拇医药
不同浓度的低密度脂蛋白组[3H]胸腺嘧啶掺入量明显高于实验对照组，低密度脂蛋白能够刺激系膜细胞增殖，且具有双向性：5～50 μg/mL浓度时，细胞增殖显著，100～200 μg/mL浓度时，细胞增殖受到抑制。目前认为，这种增殖作用与血小板生长因子有关[3]，增殖的双向性，有作者认为可能与高浓度低密度脂蛋白对细胞的毒性作用和刺激系膜细胞产生前列腺素E2有关[5，6]。肾小球超微结构显示系膜细胞与球内毛细血管内皮直接接触，毛细血管内皮裂隙直径为40 nm,低密度脂蛋白颗粒平均直径为20 nm，因此血液中的低密度脂蛋白可以滤出。研究表明，高脂血症发生时，肾小球毛细血管通透性增强，低密度脂蛋白滤出，与系膜细胞结合，刺激细胞增殖，同时刺激细胞合成大量系膜基质，表达单核细胞趋化蛋白MCP-1，合成有生物活性的趋化蛋白，使单核细胞合成许多细胞因子，如血小板生长因子，转移生长因子，而这些细胞因子刺激系膜细胞增殖及系膜基质合成[6～8]，从而引起肾小球硬化，因此，高脂血症与肾小球硬化关系极为密切。
, 百拇医药
本实验结果表明天然冬虫夏草及北冬虫夏草对低密度脂蛋白引起的系膜细胞增殖有明显的抑制作用。其作用机理，有作者认为是冬虫夏草抑制了细胞增殖过程中mRNA的合成[9]。我们的实验结果则表明是抑制了DNA的合成，可能是由于冬虫夏草与系膜细胞共同孵育的时间延长，抑制mRNA合成的同时，间接抑制了DNA的合成。从实验结果显然可以看出，2种药物的抑制作用无显著差异。但人工培植的冬虫夏草来源广泛，价格低廉，可以在临床广泛推广来防治肾小球硬化。
(致谢：感谢杭州中美合资华东制药厂和上海医科大学放射医学研究所程文英教授提供冬虫夏草)
*卫生部基金资助
参考文献
1 Anderson S, Brenner BM. Progressive renal disease: a disorder of adaptation. Q J Med, 1989, 70: 185.
, 百拇医药
2 Kasiske BL， O'Donnell MP, Clearly MP, et al. Treatment of hyperlipidemia reduces glomerular injury in obese Zuckers rats. Kidney Int, 1988,33: 667.
3 Grone EF, Abboud HE, Hobne M, et al. Actions of lipoproteins in cultured human mesangial cells: modulation by mitogenic vasoconstrictors. Am J Physiol, 1992,263: 686.
4 Rayner HC, Horsburgh T, Brown SL, et al. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein by cultured human glomerular cells. Nephron, 1990,55:292.
, 百拇医药
5 Wasserman J, Santiago A, Rifici V, et al. Interactions of low density lipoprotein with rat mesangial cells. Kidney Int, 1989,35: 1168.
6 Homma T, Ichikawa I, Hoover RL. Prostaglandins of mesangial origin inhibit mesangial cell proliferation and matrix synthesis (abstract). Kidney Int, 1988,33: 268A.
7 Rovin BH, Tan LC. LDL stimulates mesangial fibronectin production and chemoattractant expression. Kidney Int, 1993,43:218.
, http://www.100md.com
8 Jaffer F, Saunders C, Shultz P, et al. Regulation of mesangial cell growth by polypeptidemitogenic. Am J Pathol, 1989,135:261.
9 Miyazaki T, Oikawa N, Yamada H. Studies on fungal polysaccharides. xx. galactomanan of Cordyceps sinensis. Chem Pharm Bull,1977,25(12): 3324.
(1997年7月18收稿，1997年12月24日修回), 百拇医药
单位：上海医科大学中山医院肾内科(上海200032)
关键词：人类；脂蛋白类；LDL；冬虫夏草；肾小球硬化症；病灶性
中国病理生理杂志990507 摘 要 目的：探讨肾小球硬化的发病机理；并发现治疗肾小球硬化的治疗方法。方法：(1)通过测定[3H]胸腺嘧啶的掺入率，检测体外培养的人肾小球系膜细胞的增殖；(2)对人肾小球系膜细胞进行纯化和培养并对低密度、高密度脂蛋白进行[125I]标记。结果：(1)肾小球系膜细胞选择性结合和摄取[125I]LDL，(2)LDL刺激系膜细胞增殖且增殖作用具有双向性，(3)冬虫夏草对LDL 引起的细胞增殖具有抑制作用。结论：LDL刺激系膜细胞增殖可能直接参与肾小球硬化的发病，高脂血症对肾脏的损害可能由肾小球系膜细胞介导；抑制系膜细胞增殖可能对肾小球硬化的防治具有一定的可行性。
, http://www.100md.com
Proliferation of cultured human mesangial cells caused
by LDL and the adserse effect of Cordyceps
WANG Xiao-Xia, WU Zhao-Long
Shanghai Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai(200032)
Abstract AIM:To study the pathogenesis of glomerulosclerosis in vitro and find a treatment method of glomerulosclerosis.METHODS：Human glomerular mesangial cells were purified and cultured: Low density lipoprotein(LDL) and high density lipoprotein (HDL) labelled with [125 I]; and human mesangial cells (HMC) proliferation measured by counting [3 H] thymidine incorporation. RESULTS：(1) Cultured HMC uptake [125 I]LDL selectively, (2)LDL stimulated HMC proliferation and had a biphasic effect on HMC proliferation, (3)Cordyceps militaris had a strong inhibition on HMC proliferation induced by LDL. CONCLUSIONS： HMC proliferation induced by LDL may directly participate in the pathogenesis of glomerulosclerosis. The deleterious effects of hyperlipidemia on the kidney may be mediated by HMC. Therefore, inhibiting HMC proliferation may be practicable in the treatment of progressive glomerulosclerosis.
, 百拇医药
MeSH Human; Lipoproteins, LDL; Glomerulosclerosis, focal; Cordyceps sinensis
肾小球硬化是导致肾功能减退的主要因素之一[1]。研究发现，高脂血症与肾小球硬化关系密切。高脂血症时，大量脂质沉积在系膜细胞表面引起细胞 增殖，可能是导致肾小球硬化的关键[2]，作用机理还不太清楚。为了在细胞水平阐明高脂血症损伤肾小球，导致肾小球硬化的机理，本实验利用体外培养的肾小球系膜细胞和[125I]标记的低密度脂蛋白(low density lipoprotein)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein)，研究了系膜细胞对低密度脂蛋白的结合和摄取。低密度脂蛋白对系膜细胞的增殖作用；并首次报道冬虫夏草对系膜细胞的影响。
材料与方法
一、人肾小球系膜细胞的培养、鉴定及脂蛋白的分离、标记：
, http://www.100md.com
按美国明尼苏达大学医学院Morks.Paler教授提供的培养方法。对人肾小球系膜细胞进行了纯化及传代培养，并进行了细胞鉴定；用密度梯度法分离血液获得低(高)密度脂蛋白并利用固相氧化法对其分别进行[125 I]标记。
二、系膜细胞对标记的低密度脂蛋白的结合和摄取：
将第3代细胞以2×104浓度接种于96孔培养板，置于培养箱中(37℃，5% CO2)孵育3～4 d细胞长至半汇合状态后，使细胞处于同步静止状态。将10 μg/mL碘标记的低高密度脂蛋白分别加入培养板孔内(n=8)，设空白对照，孵育5 h后，4℃ Hanks液充分漂洗：4℃ 0.5%三氯甲烷充分漂洗，用1 mol/L NaOH溶解细胞，室温下置24 h，收集细胞碎片，烘干滤纸进行放射计数测定。
三、低密度脂蛋白对系膜细胞增殖作用的影响：
, 百拇医药
浆系膜细胞同步静止后，加入不同浓度的低密度脂蛋白(5 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/L，100 μg/mL，150 μg/mL，200 μg/mL，n=8)。每孔按 3.7×104 Bq加入[3H]胸腺嘧啶，设对照组。孵育24 h(37℃，5% CO2)，Hanks液充分漂洗及5%三氯乙酸洗涤，0.5%胰蛋白酶及0.02% EDTA(1：1)溶液溶解细胞，收集细胞碎片，进行放射计数测定。
四、冬早夏草对低密度脂蛋白产生的系膜细胞增殖的影响：
系膜细胞同步静止化后，加入不同浓度(100 μg/mL，200 μg/mL， 300 μg/mL， 400 μg/mL)的天然冬虫夏草，3.7×104 Bq/孔的[3H]胸腺嘧啶及10 μg/mL的低密度脂蛋白共同孵育24 h；北冬虫夏草(人工合成)实验组方法同上并同时设实验对照组：以下漂洗及溶解，收集细胞碎片，同位素计数测定。
, http://www.100md.com
五、统计方法：
数据以
表示，采用t检验和方差分析。结果
(一)系膜细胞的鉴定和脂蛋白的分离及标记结果：免疫组化标记结果、胞浆内结蛋白(desmin)、肌动蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)均为阳性表达、Ⅷ因子(F8)及角蛋白(cytokeratin)阴性。血浆脂蛋白的分离结果显示：碘标记的低(高)密度脂蛋白的放化纯度均达98.7%。
(二)系膜细胞对碘标记的低密度脂蛋白的结合摄取：结果显示：低密度脂蛋白组的放射counts.min-1(7304.0±974.0，n=8)明显高于高密度脂蛋白组(303.0±35.0，n=8)，P<0.01。
, http://www.100md.com
(三)低密度脂蛋白对系膜细胞增殖作用的影响：见表1。
表1 不同浓度低密度脂蛋白对系膜细胞的影响
Tab 1 The effect of different concentration of LDL(low density
lipoprotein) on mesangial cells(
,n=8) GroupConcentration of LDL
(μg/mL)
Counts.min-1
, 百拇医药
Control
0
62.5±18.3
LDL
5
919.5±216.0*
10
1106.0±132.0**
50
1200.0±311.0**
100
1690.0±307.0**
, http://www.100md.com
150
511.8±105.0*
200
456.1±115.0*
*P<0.05,**P<0.01, vs control
(四)北冬虫夏草及天然冬虫夏草对低密度脂蛋白产生的系膜细胞增殖的影响：见表2。
表2 冬虫夏草对LDL引起的系膜细胞增殖的影响
Tab 2 The effect of Cordyceps on proliferation of
mesangial cells caused by LDL(
,n=8) Group, 百拇医药
Counts.min-1
Blank
20.0±6.0
LDL (10 μg/mL)
1106.0±132.0
Cordyceps sinenis (μg/mL)+LDL(μg/mL)
100 + 10
192.0±25.0*
200 + 10
168.0±16.0**
, http://www.100md.com
300 + 10
145.0±20.0**
400 + 10
72.0±16.0**
Cordyceps militaris (μg/mL)+LDL(μg/mL)
100 + 10
99.5±21.0**
200 + 10
80.2±11.0**
300 + 10
, 百拇医药
79.8±19.0**
400 + 10
70.3±8.0**
*P<0.05,**P<0.01, vs LDL
讨论
肾小球固有细胞有3种：脏层上皮细胞、毛细血管内皮细胞和系膜细胞，实验的培养鉴定结果显示传代培养的人肾小球系膜细胞纯度极高，不含有上皮细胞及内皮细胞。
[125I]标记的低密度脂蛋白与系膜细胞亲和力高，并与细胞特异性结合，肝素及过量未标记的低密度脂量白均能阻断二者的结合[4]。我们的实验结果显示：[125I]标记的低密度脂蛋白组的counts.min-1计数明显高于高密度脂蛋白组，统计结果具有显著差异。故脂蛋白对系膜细胞的作用可能主要通过低密度脂蛋白，此项结果为系膜细胞通过特异性受体结合机制结合和摄取低密度脂蛋白提供了有力证据。
, 百拇医药
不同浓度的低密度脂蛋白组[3H]胸腺嘧啶掺入量明显高于实验对照组，低密度脂蛋白能够刺激系膜细胞增殖，且具有双向性：5～50 μg/mL浓度时，细胞增殖显著，100～200 μg/mL浓度时，细胞增殖受到抑制。目前认为，这种增殖作用与血小板生长因子有关[3]，增殖的双向性，有作者认为可能与高浓度低密度脂蛋白对细胞的毒性作用和刺激系膜细胞产生前列腺素E2有关[5，6]。肾小球超微结构显示系膜细胞与球内毛细血管内皮直接接触，毛细血管内皮裂隙直径为40 nm,低密度脂蛋白颗粒平均直径为20 nm，因此血液中的低密度脂蛋白可以滤出。研究表明，高脂血症发生时，肾小球毛细血管通透性增强，低密度脂蛋白滤出，与系膜细胞结合，刺激细胞增殖，同时刺激细胞合成大量系膜基质，表达单核细胞趋化蛋白MCP-1，合成有生物活性的趋化蛋白，使单核细胞合成许多细胞因子，如血小板生长因子，转移生长因子，而这些细胞因子刺激系膜细胞增殖及系膜基质合成[6～8]，从而引起肾小球硬化，因此，高脂血症与肾小球硬化关系极为密切。
, 百拇医药
本实验结果表明天然冬虫夏草及北冬虫夏草对低密度脂蛋白引起的系膜细胞增殖有明显的抑制作用。其作用机理，有作者认为是冬虫夏草抑制了细胞增殖过程中mRNA的合成[9]。我们的实验结果则表明是抑制了DNA的合成，可能是由于冬虫夏草与系膜细胞共同孵育的时间延长，抑制mRNA合成的同时，间接抑制了DNA的合成。从实验结果显然可以看出，2种药物的抑制作用无显著差异。但人工培植的冬虫夏草来源广泛，价格低廉，可以在临床广泛推广来防治肾小球硬化。
(致谢：感谢杭州中美合资华东制药厂和上海医科大学放射医学研究所程文英教授提供冬虫夏草)
*卫生部基金资助
参考文献
1 Anderson S, Brenner BM. Progressive renal disease: a disorder of adaptation. Q J Med, 1989, 70: 185.
, 百拇医药
2 Kasiske BL， O'Donnell MP, Clearly MP, et al. Treatment of hyperlipidemia reduces glomerular injury in obese Zuckers rats. Kidney Int, 1988,33: 667.
3 Grone EF, Abboud HE, Hobne M, et al. Actions of lipoproteins in cultured human mesangial cells: modulation by mitogenic vasoconstrictors. Am J Physiol, 1992,263: 686.
4 Rayner HC, Horsburgh T, Brown SL, et al. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein by cultured human glomerular cells. Nephron, 1990,55:292.
, 百拇医药
5 Wasserman J, Santiago A, Rifici V, et al. Interactions of low density lipoprotein with rat mesangial cells. Kidney Int, 1989,35: 1168.
6 Homma T, Ichikawa I, Hoover RL. Prostaglandins of mesangial origin inhibit mesangial cell proliferation and matrix synthesis (abstract). Kidney Int, 1988,33: 268A.
7 Rovin BH, Tan LC. LDL stimulates mesangial fibronectin production and chemoattractant expression. Kidney Int, 1993,43:218.
, http://www.100md.com
8 Jaffer F, Saunders C, Shultz P, et al. Regulation of mesangial cell growth by polypeptidemitogenic. Am J Pathol, 1989,135:261.
9 Miyazaki T, Oikawa N, Yamada H. Studies on fungal polysaccharides. xx. galactomanan of Cordyceps sinensis. Chem Pharm Bull,1977,25(12): 3324.
(1997年7月18收稿，1997年12月24日修回), 百拇医药