抗类脂A单克隆抗体的制备及免疫保护作用＊
作者：黄 宁 李 洵 阎蓉华 郑澄渝 潘小玲
单位：华西医科大学病理生理教研室(成都 610041)
关键词：
中国病理生理杂志990532 内毒素血症是全身炎症反应综合征、感染性休克、多器官功能衰竭的主要诱因之一，目前临床尚缺乏有效的诊断和治疗措施。制备具有广泛交叉性和保护性的单克隆抗体是对抗内毒素血症的重要措施之一。类脂A(lipid A)是内毒素的毒性中心，结构极为保守，因而制备抗lipid A单抗受到人们极大的关注。本文将lipid A包被在明尼苏达沙门氏菌粗糙突变株Re595表面作为免疫原，脾脏内免疫Balb/c小鼠，制备单抗，并对其免疫保护作用作了初步探讨。
方法
1.免疫原制备：收集过夜培养的Re595株细菌，1%乙酸100℃水浴2 h，离心洗涤，冷冻干燥，配成1 mg/mL菌悬液，lipid A溶于0.1%三乙胺中，浓度为1 mg/mL，按干菌/lipid A的5∶1比例将lipid A逐滴加入旋涡震荡的菌悬液中，充分混匀，冷冻干燥，即为包被lipid A的免疫原。
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2.脾脏免疫；免疫原溶于PBS(pH7.4)中，每毫升含lipid A 200 μg,菌1000 μg，用脾脏内免疫法直接免疫小鼠4次，每次0.2 mL，间隔2周。融合前3 d同法加强免疫一次。
3.杂交瘤细胞株的建立：取对数生长期SP 2/0骨髓瘤细胞与免疫Balb/c小鼠脾细胞按1∶5比例，以50%PEG为融合剂融合细胞，按常规HAT、HT培养基培养。用lipid A包板，间接ELISA检测培养上清，选择阳性孔用有限稀释法作克隆培养，直至100%分泌所需抗体。
4.单克隆抗体的制备及纯化：将5×105个杂交瘤细胞注入预先腹腔内注射过液体石蜡的经产Balb/c小鼠腹腔中，待腹水形成后，收集腹水，用蛋白A亲和层析抗体纯化试剂盒纯化抗体。
5.单克隆抗体的鉴定：①用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定单抗Ig亚类，②用ELISA结合试验鉴定单抗的特异性和交叉反应性：将LPS 10 μg/mL, lipid A 10 μg/mL,热灭活菌体1×108/mL包板，4℃过夜，洗涤，1%BSA-PBST封板，加稀释抗体37℃ 1 h后洗涤，再加HRP-羊抗鼠IgG 37℃ 1 h，然后加OPD溶液37℃ 10 min，终止反应后再用酶联检测仪测定OD492值。大于阴性对照2倍记为+，3倍记为+ +，4倍以上记为+ + +。
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6.小鼠腹腔保护试验：Balb/c小鼠，腹腔注射一定量单克隆抗体，2 h内用3倍LD50(2×108 CFU/只)绿脓杆菌腹腔攻击小鼠，设置生理盐水对照，7 d后观察动物存活只数。
结果
1.杂交瘤细胞株的建立：经一次融合，共有188孔生长有杂交瘤细胞，融合率为100%。选择其中96孔培养上清进行ELISA筛选，65孔与lipid A有阳性反应(阳性率为67.7%)。从中选择5个阳性孔进行克隆化培养，获得1株能持续分泌抗lipid A的杂交瘤细胞株，命名为1C9。
2.McAb 1C9的鉴定：琼脂免疫双扩试验显示1C9属IgG1亚类。间接ELISA显示1C9与lipid A、Re 595 LPS、J5 LPS反应为强阳性(+++)，与光滑性大肠杆菌，绿脓杆菌LPS呈阳性反应(+)；与热处理的大肠杆菌、绿脓杆菌以及大肠杆菌粗糙突变株J5和明尼苏达株Re 595均有较强的交叉反应(++)。
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3.McAb 1C9的保护作用：实验组10只小鼠每只腹腔注射纯化的单克隆抗体0.5 mL(200 μg),7 d后6只存活，存活率为60%，而对照组10只小鼠1周内全部死亡。
讨论
Lipid A是内毒素脂多糖(LPS)的毒性和活性中心，免疫原性极差。既往制备抗lipid A单抗多采用革兰氏阴性菌粗糙型变异株作为免疫原，经腹腔免疫途径来制备，但该法效果不太理想。我们曾用明尼苏达沙门氏菌粗糙突变株Re595多次腹腔免疫小鼠，制备抗lipid A单抗，均未获得成功，后改用lipid A包被酸化处理的Re595株作为免疫原，经脾脏内注射免疫小鼠，一次融合，即呈现较多阳性克隆。我们认为制备抗lipid A单抗，该免疫程序不失为一种简便可靠的方法。
抗lipid A单抗用于免疫保护和免疫诊断等研究。我们制备的抗类脂A单抗，经间接ELISA显示，可与多种革兰氏阴性菌LPS和菌体发生不同程度的结合反应，提示该单抗对不同革兰氏阴性菌感染可能会有一定的交叉保护作用。小鼠腹腔保护实验显示，该单抗对绿脓杆菌感染的小鼠有一定保护作用。
*纽约中华医学基金会资助
(1997年10月9日收稿，1999年4月3日修回), http://www.100md.com
单位：华西医科大学病理生理教研室(成都 610041)
关键词：
中国病理生理杂志990532 内毒素血症是全身炎症反应综合征、感染性休克、多器官功能衰竭的主要诱因之一，目前临床尚缺乏有效的诊断和治疗措施。制备具有广泛交叉性和保护性的单克隆抗体是对抗内毒素血症的重要措施之一。类脂A(lipid A)是内毒素的毒性中心，结构极为保守，因而制备抗lipid A单抗受到人们极大的关注。本文将lipid A包被在明尼苏达沙门氏菌粗糙突变株Re595表面作为免疫原，脾脏内免疫Balb/c小鼠，制备单抗，并对其免疫保护作用作了初步探讨。
方法
1.免疫原制备：收集过夜培养的Re595株细菌，1%乙酸100℃水浴2 h，离心洗涤，冷冻干燥，配成1 mg/mL菌悬液，lipid A溶于0.1%三乙胺中，浓度为1 mg/mL，按干菌/lipid A的5∶1比例将lipid A逐滴加入旋涡震荡的菌悬液中，充分混匀，冷冻干燥，即为包被lipid A的免疫原。
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2.脾脏免疫；免疫原溶于PBS(pH7.4)中，每毫升含lipid A 200 μg,菌1000 μg，用脾脏内免疫法直接免疫小鼠4次，每次0.2 mL，间隔2周。融合前3 d同法加强免疫一次。
3.杂交瘤细胞株的建立：取对数生长期SP 2/0骨髓瘤细胞与免疫Balb/c小鼠脾细胞按1∶5比例，以50%PEG为融合剂融合细胞，按常规HAT、HT培养基培养。用lipid A包板，间接ELISA检测培养上清，选择阳性孔用有限稀释法作克隆培养，直至100%分泌所需抗体。
4.单克隆抗体的制备及纯化：将5×105个杂交瘤细胞注入预先腹腔内注射过液体石蜡的经产Balb/c小鼠腹腔中，待腹水形成后，收集腹水，用蛋白A亲和层析抗体纯化试剂盒纯化抗体。
5.单克隆抗体的鉴定：①用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定单抗Ig亚类，②用ELISA结合试验鉴定单抗的特异性和交叉反应性：将LPS 10 μg/mL, lipid A 10 μg/mL,热灭活菌体1×108/mL包板，4℃过夜，洗涤，1%BSA-PBST封板，加稀释抗体37℃ 1 h后洗涤，再加HRP-羊抗鼠IgG 37℃ 1 h，然后加OPD溶液37℃ 10 min，终止反应后再用酶联检测仪测定OD492值。大于阴性对照2倍记为+，3倍记为+ +，4倍以上记为+ + +。
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6.小鼠腹腔保护试验：Balb/c小鼠，腹腔注射一定量单克隆抗体，2 h内用3倍LD50(2×108 CFU/只)绿脓杆菌腹腔攻击小鼠，设置生理盐水对照，7 d后观察动物存活只数。
结果
1.杂交瘤细胞株的建立：经一次融合，共有188孔生长有杂交瘤细胞，融合率为100%。选择其中96孔培养上清进行ELISA筛选，65孔与lipid A有阳性反应(阳性率为67.7%)。从中选择5个阳性孔进行克隆化培养，获得1株能持续分泌抗lipid A的杂交瘤细胞株，命名为1C9。
2.McAb 1C9的鉴定：琼脂免疫双扩试验显示1C9属IgG1亚类。间接ELISA显示1C9与lipid A、Re 595 LPS、J5 LPS反应为强阳性(+++)，与光滑性大肠杆菌，绿脓杆菌LPS呈阳性反应(+)；与热处理的大肠杆菌、绿脓杆菌以及大肠杆菌粗糙突变株J5和明尼苏达株Re 595均有较强的交叉反应(++)。
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3.McAb 1C9的保护作用：实验组10只小鼠每只腹腔注射纯化的单克隆抗体0.5 mL(200 μg),7 d后6只存活，存活率为60%，而对照组10只小鼠1周内全部死亡。
讨论
Lipid A是内毒素脂多糖(LPS)的毒性和活性中心，免疫原性极差。既往制备抗lipid A单抗多采用革兰氏阴性菌粗糙型变异株作为免疫原，经腹腔免疫途径来制备，但该法效果不太理想。我们曾用明尼苏达沙门氏菌粗糙突变株Re595多次腹腔免疫小鼠，制备抗lipid A单抗，均未获得成功，后改用lipid A包被酸化处理的Re595株作为免疫原，经脾脏内注射免疫小鼠，一次融合，即呈现较多阳性克隆。我们认为制备抗lipid A单抗，该免疫程序不失为一种简便可靠的方法。
抗lipid A单抗用于免疫保护和免疫诊断等研究。我们制备的抗类脂A单抗，经间接ELISA显示，可与多种革兰氏阴性菌LPS和菌体发生不同程度的结合反应，提示该单抗对不同革兰氏阴性菌感染可能会有一定的交叉保护作用。小鼠腹腔保护实验显示，该单抗对绿脓杆菌感染的小鼠有一定保护作用。
*纽约中华医学基金会资助
(1997年10月9日收稿，1999年4月3日修回), http://www.100md.com