雪旺氏细胞源神经营养蛋白的125碘标记物制备与鉴定*
作者：卢晓林 朱家恺 许扬滨 刘长征
单位：卢晓林 朱家恺 许扬滨 中山医科大学附一院显微外科(广州510080)；刘长征 中山医科大学核医学教研室
关键词：
雪旺氏细胞源神经营养蛋白的125碘 标记物制备与鉴定 雪旺氏细胞源神经营养蛋白(Schwann-cell derived neutrophic protein, SCDNTP)是从雪旺氏细胞中提取的一种神经营养蛋白，分子量为54×103，尤其对运动神经元有较强的营养支持和促进其损伤后修复作用[1]。但SCDNTP的作用机制尚不清楚。国内外报道的一些神经营养蛋白是通过激活相应的受体起作用。SCDNTP是否也有受体存在须待证实。用放射性标记配基来研究受体是一种经典、简便、可靠的方法，因此对SCDNTP的放射性标记是其受体分析的关键。本文作者用[125I]标记SCDNTP并对其质量进行了鉴定。
, 百拇医药
材料与方法
一、主要试剂与仪器：
SCDNTP，分子量54×103，本研究室自制(高效液相纯、电泳纯)[1]。[Na125I]，无载体，8.7GBq/mL，中国原子能科学研究院同位素研究所制品。氯胺T，分析纯。Tris-磷酸缓冲液，0.05 mol/L，pH7.5。Sephadex G-75凝胶柱(柱长15 cm，直径1 cm)，Pharmacia公司产品。301中速层析纸，杭州新华纸品厂产。XH-6010 γ放射免疫计数器。
二、标记方法：
按Greenwood和Hunter氯胺T氧化法[2]。
(一)加样：[Na125I] 1.85×107～7.4×107 Bq /10 μL; SCDNTP 20μg/10 μL; 氯胺T20μg/250 μL。
, 百拇医药
(二)碘化反应：冰水浴，搅拌0.5～2 min。
(三)终止反应：偏重亚硫酸钠100 μg/250 μL，1%KI 100 μL。
(四)分离结合和游离的[125I]：上Sephadex G-75凝胶柱层析，用0.05 mol/L Tris-磷酸缓冲液淋洗。流速1 mL/min，分布收集并计算[125I]-SCDNTP峰和[Na125I]峰放射值之比，计算标记率。
根据以上方法制备6批[125I]-SCDNTP，这6个批号的反应条件见表1。
表1 制备6批[125I]-SCDNTP的反应条件
Tab 1 The conditions for iodination of SCDNTP
, 百拇医药
No.of
[125I]-SCDNTP
[Na125I]
(107Bq)
CH-T
(μg)
SCDNTP
(μg)
Time of oxidation
(min)
9811
, 百拇医药
1.85
20
20
0.5
9812
1.85
20
20
1.0
9813
3.70
20
20
, http://www.100md.com
1.0
9814
7.40
20
20
0.5
9815
7.40
20
20
1.0
9816
7.40
, http://www.100md.com
20
20
2.0
三、标记物质量鉴定：
(一)比放射性测定:用XH-6010 γ放射免疫计数器测定标记物的放射性强度,计算标记物的比放射性。
(二)放化纯度测定：取经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化的125I-SCDNTP进行纸层析，分别测游离碘及标记蛋白的放射性，计算后者占总放射性的百分比即为其放化纯度。
(三)标记物的理化性质鉴定：取制备的标记和未标记蛋白各10 μL行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察其泳动位置。
(四)标记化合物的免疫活性鉴定：直接比较标记物与未标记物的免疫活性，用1.0 ng/mL标记物作抗体稀释曲线A,用0.1 ng/mL标记物加上0.9 ng/mL未标记物作抗体稀释曲线B，看二条曲线是一致还是分开[3]。
, 百拇医药
(五)标记物储存期稳定性：取不同时间的标记物重新过凝胶柱，计算游离碘峰占总放射性的百分比。 结果
一、SCDNTP的125碘化标记：
作6批SCDNTP的125碘化标记，主要参数见表2。
由表2可见在9812批号条件下制备的[125I]-SCDNTP既有较高的放射性浓度而且经计算平均1个SCDNTP分子挂上的[125I]原子也较少(约为1∶0.35)，因此我们初步认为该批号的反应条件为SCDNTP125碘化标记物制备的最佳反应条件。其标记物洗脱曲线见图1。
表2 6批SCDNTP125碘化标记参数
Tab 2 The parameters of SCDNTP [125 I]labeling
, 百拇医药
No.
[125I]-SCDNTP/Na125I
(cpm/cpm)
Labeling efficiency
(%)
Specific activity
(105 Bq/μg)
9811
0.59
37.3
3.45
, http://www.100md.com
9812
1.27
56.0
5.18
9813
0.68
40.4
7.47
9814
0.77
43.5
16.10
9815
, http://www.100md.com
1.02
50.0
18.50
9816
1.12
52.7
19.50
Fig 1 Elution pattern of reaction mixture from a 11 cm×15 cm column of Sephadex G-75. Factions of 0.5 mL were collected and assayed for radioactivity
, http://www.100md.com
图1 [125I]标记SCDNTP混合物的柱层析分离放射性分布图(9812批)
可见，第一峰为[125I]-SCDNTP，由于分子量大先被洗脱下来形成第一峰，第二峰为游离Na[125I]。9813～9816批标记物的比放射性偏高这里将不作分析，以下所述除非有所说明，否则均指9812批标记物。
二、比放射性为5.18×105 Bq /μg。
三、放化纯度 为98%。
四、理化性质：[125I]标记SCDNTP与未标记SCDNTP的泳动位置一致，见图2。
, 百拇医药
Fig 2 SDS-PAGE analysis of [125I]-SCDNTP
A: unlabeled SCDNTP; B: No.9811 [125I]-SCDNTP; C: No.9812 [125I]-SCDNTP
图2 [125I]-SCDNTP聚丙烯酰胺凝胶电泳图
五、标记物的免疫活性：
A、B两条抗体稀释曲线基本重合，说明标记物与未标记物的免疫活性是一致的[3]，见图3。
, 百拇医药
Dilution of the antibody
Fig 3 Immunoassay of [125I]-SCDNTP
图3 标记物免疫活性鉴定曲线
六、标记化合物的稳定性：
标记物-20℃保存，第2、5 d重过凝胶柱未出现游离碘峰；第10 d游离碘峰仅占总放射性0.8%；第20 d又有4.5%游离碘峰。因此在此贮存条件下1～10 d内该标记物是很稳定的。
讨论
作为受体分析用的标记配体应具有高度的放化纯度、合适的比放射性以及良好的生物活性。碘标记简单易行，其优点是很易得到高比放射性的配基，但受体分析要求标记物不仅要有较高比放射性，还要有良好的生物活性，这一点非常重要。一般认为平均一个蛋白质分子结合一个以下碘原子不影响它的生物活性，结合两个以上[125I]原子常导致蛋白质变性[4]。因此，理想的标记配基制备须选择合适的反应条件，这样所得到的标记物不致于挂上太多的[125I]而导致其变性，同时又具有合适的比放射性。本实验从多个批号中筛选出一组即9812批号，在此反应条件制备的[125I]-SCDNTP每个分子上平均挂有约0.35个[125I]原子，不影响它的生物活性。因为(1)每分子SCDNTP结合碘原子少，对SCDNTP结构影响很小。(2)电泳时标记物保持了原有的理化性质。反之，如果反应条件不当，蛋白质标记时受损伤，其电荷数量、质量甚至结构改变，电泳时标记物与非标记物的泳动位置就会不同。(3)标记物与未标记物的免疫活性一致。另外，根据以往受体分析对标记配基的要求[5]，可以认为标记物保持了原有的生物活性。这一点在以后的受体分析中得到证实(待发表)。由于第9812批标记物保持了原有的理化性质，而且免疫活性也一致，同时其比放射性亦较高，因此我们认为此标记物能保持其原有的生物活性，制备这批标记物的反应条件为最佳反应条件。
, 百拇医药
本实验研究结果表明按9812批条件制备的[125I]-SCDNTP具有高度的放化纯度、合适的比放射性及良好的生物活性，能够满足放射受体分析用。
* 国家自然基金资助(No.39470700)
参考文献
1 陈 强，朱家恺，顾熊飞.雪旺氏细胞源神经营养蛋白的进一步纯化及活性研究 . 中华显微外科杂志，1998，21，增刊：29.
2 Hunter WM, Greenwood FC. Preparation of iodine-131 labelled human growth hormone of high specific activity. Nature， 1962, 194:495.
3 樊为民 . 标记化合物的质量指标及其鉴定方法 . 放射免疫学杂志，1996，9(1)：51.
4 龚玉萍，邓承棋，李素琼 . 中国蕲毒蛇的碘化标记物制备及鉴定 . 华西医科大学学报，1995，26(1)：116.
5 雷幼导.受体的放射分析.见：曹泽毅主编. 激素受体及其临床应用.第1版. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993.89～97.
(1999年3月15日收稿，1999年4月19日修回), 百拇医药
单位：卢晓林 朱家恺 许扬滨 中山医科大学附一院显微外科(广州510080)；刘长征 中山医科大学核医学教研室
关键词：
雪旺氏细胞源神经营养蛋白的125碘 标记物制备与鉴定 雪旺氏细胞源神经营养蛋白(Schwann-cell derived neutrophic protein, SCDNTP)是从雪旺氏细胞中提取的一种神经营养蛋白，分子量为54×103，尤其对运动神经元有较强的营养支持和促进其损伤后修复作用[1]。但SCDNTP的作用机制尚不清楚。国内外报道的一些神经营养蛋白是通过激活相应的受体起作用。SCDNTP是否也有受体存在须待证实。用放射性标记配基来研究受体是一种经典、简便、可靠的方法，因此对SCDNTP的放射性标记是其受体分析的关键。本文作者用[125I]标记SCDNTP并对其质量进行了鉴定。
, 百拇医药
材料与方法
一、主要试剂与仪器：
SCDNTP，分子量54×103，本研究室自制(高效液相纯、电泳纯)[1]。[Na125I]，无载体，8.7GBq/mL，中国原子能科学研究院同位素研究所制品。氯胺T，分析纯。Tris-磷酸缓冲液，0.05 mol/L，pH7.5。Sephadex G-75凝胶柱(柱长15 cm，直径1 cm)，Pharmacia公司产品。301中速层析纸，杭州新华纸品厂产。XH-6010 γ放射免疫计数器。
二、标记方法：
按Greenwood和Hunter氯胺T氧化法[2]。
(一)加样：[Na125I] 1.85×107～7.4×107 Bq /10 μL; SCDNTP 20μg/10 μL; 氯胺T20μg/250 μL。
, 百拇医药
(二)碘化反应：冰水浴，搅拌0.5～2 min。
(三)终止反应：偏重亚硫酸钠100 μg/250 μL，1%KI 100 μL。
(四)分离结合和游离的[125I]：上Sephadex G-75凝胶柱层析，用0.05 mol/L Tris-磷酸缓冲液淋洗。流速1 mL/min，分布收集并计算[125I]-SCDNTP峰和[Na125I]峰放射值之比，计算标记率。
根据以上方法制备6批[125I]-SCDNTP，这6个批号的反应条件见表1。
表1 制备6批[125I]-SCDNTP的反应条件
Tab 1 The conditions for iodination of SCDNTP
, 百拇医药
No.of
[125I]-SCDNTP
[Na125I]
(107Bq)
CH-T
(μg)
SCDNTP
(μg)
Time of oxidation
(min)
9811
, 百拇医药
1.85
20
20
0.5
9812
1.85
20
20
1.0
9813
3.70
20
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1.0
9814
7.40
20
20
0.5
9815
7.40
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20
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9816
7.40
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20
20
2.0
三、标记物质量鉴定：
(一)比放射性测定:用XH-6010 γ放射免疫计数器测定标记物的放射性强度,计算标记物的比放射性。
(二)放化纯度测定：取经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化的125I-SCDNTP进行纸层析，分别测游离碘及标记蛋白的放射性，计算后者占总放射性的百分比即为其放化纯度。
(三)标记物的理化性质鉴定：取制备的标记和未标记蛋白各10 μL行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察其泳动位置。
(四)标记化合物的免疫活性鉴定：直接比较标记物与未标记物的免疫活性，用1.0 ng/mL标记物作抗体稀释曲线A,用0.1 ng/mL标记物加上0.9 ng/mL未标记物作抗体稀释曲线B，看二条曲线是一致还是分开[3]。
, 百拇医药
(五)标记物储存期稳定性：取不同时间的标记物重新过凝胶柱，计算游离碘峰占总放射性的百分比。 结果
一、SCDNTP的125碘化标记：
作6批SCDNTP的125碘化标记，主要参数见表2。
由表2可见在9812批号条件下制备的[125I]-SCDNTP既有较高的放射性浓度而且经计算平均1个SCDNTP分子挂上的[125I]原子也较少(约为1∶0.35)，因此我们初步认为该批号的反应条件为SCDNTP125碘化标记物制备的最佳反应条件。其标记物洗脱曲线见图1。
表2 6批SCDNTP125碘化标记参数
Tab 2 The parameters of SCDNTP [125 I]labeling
, 百拇医药
No.
[125I]-SCDNTP/Na125I
(cpm/cpm)
Labeling efficiency
(%)
Specific activity
(105 Bq/μg)
9811
0.59
37.3
3.45
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9812
1.27
56.0
5.18
9813
0.68
40.4
7.47
9814
0.77
43.5
16.10
9815
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1.02
50.0
18.50
9816
1.12
52.7
19.50
Fig 1 Elution pattern of reaction mixture from a 11 cm×15 cm column of Sephadex G-75. Factions of 0.5 mL were collected and assayed for radioactivity
, http://www.100md.com
图1 [125I]标记SCDNTP混合物的柱层析分离放射性分布图(9812批)
可见，第一峰为[125I]-SCDNTP，由于分子量大先被洗脱下来形成第一峰，第二峰为游离Na[125I]。9813～9816批标记物的比放射性偏高这里将不作分析，以下所述除非有所说明，否则均指9812批标记物。
二、比放射性为5.18×105 Bq /μg。
三、放化纯度 为98%。
四、理化性质：[125I]标记SCDNTP与未标记SCDNTP的泳动位置一致，见图2。
, 百拇医药
Fig 2 SDS-PAGE analysis of [125I]-SCDNTP
A: unlabeled SCDNTP; B: No.9811 [125I]-SCDNTP; C: No.9812 [125I]-SCDNTP
图2 [125I]-SCDNTP聚丙烯酰胺凝胶电泳图
五、标记物的免疫活性：
A、B两条抗体稀释曲线基本重合，说明标记物与未标记物的免疫活性是一致的[3]，见图3。
, 百拇医药
Dilution of the antibody
Fig 3 Immunoassay of [125I]-SCDNTP
图3 标记物免疫活性鉴定曲线
六、标记化合物的稳定性：
标记物-20℃保存，第2、5 d重过凝胶柱未出现游离碘峰；第10 d游离碘峰仅占总放射性0.8%；第20 d又有4.5%游离碘峰。因此在此贮存条件下1～10 d内该标记物是很稳定的。
讨论
作为受体分析用的标记配体应具有高度的放化纯度、合适的比放射性以及良好的生物活性。碘标记简单易行，其优点是很易得到高比放射性的配基，但受体分析要求标记物不仅要有较高比放射性，还要有良好的生物活性，这一点非常重要。一般认为平均一个蛋白质分子结合一个以下碘原子不影响它的生物活性，结合两个以上[125I]原子常导致蛋白质变性[4]。因此，理想的标记配基制备须选择合适的反应条件，这样所得到的标记物不致于挂上太多的[125I]而导致其变性，同时又具有合适的比放射性。本实验从多个批号中筛选出一组即9812批号，在此反应条件制备的[125I]-SCDNTP每个分子上平均挂有约0.35个[125I]原子，不影响它的生物活性。因为(1)每分子SCDNTP结合碘原子少，对SCDNTP结构影响很小。(2)电泳时标记物保持了原有的理化性质。反之，如果反应条件不当，蛋白质标记时受损伤，其电荷数量、质量甚至结构改变，电泳时标记物与非标记物的泳动位置就会不同。(3)标记物与未标记物的免疫活性一致。另外，根据以往受体分析对标记配基的要求[5]，可以认为标记物保持了原有的生物活性。这一点在以后的受体分析中得到证实(待发表)。由于第9812批标记物保持了原有的理化性质，而且免疫活性也一致，同时其比放射性亦较高，因此我们认为此标记物能保持其原有的生物活性，制备这批标记物的反应条件为最佳反应条件。
, 百拇医药
本实验研究结果表明按9812批条件制备的[125I]-SCDNTP具有高度的放化纯度、合适的比放射性及良好的生物活性，能够满足放射受体分析用。
* 国家自然基金资助(No.39470700)
参考文献
1 陈 强，朱家恺，顾熊飞.雪旺氏细胞源神经营养蛋白的进一步纯化及活性研究 . 中华显微外科杂志，1998，21，增刊：29.
2 Hunter WM, Greenwood FC. Preparation of iodine-131 labelled human growth hormone of high specific activity. Nature， 1962, 194:495.
3 樊为民 . 标记化合物的质量指标及其鉴定方法 . 放射免疫学杂志，1996，9(1)：51.
4 龚玉萍，邓承棋，李素琼 . 中国蕲毒蛇的碘化标记物制备及鉴定 . 华西医科大学学报，1995，26(1)：116.
5 雷幼导.受体的放射分析.见：曹泽毅主编. 激素受体及其临床应用.第1版. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993.89～97.
(1999年3月15日收稿，1999年4月19日修回), 百拇医药