大鼠心肌缺血再灌注时红细胞膜流动性变化及某些药物作用
作者：焦晓慧 孟繁学 韩大英
单位：首都医科大学心血管生理教研室(北京100054)
关键词：
中国病理生理杂志990635 有关心肌缺血再灌注损伤已有很多研究，最近Makoto Suematsu等的工作表明：微循环紊乱是心肌细胞损伤的前提和关键。而红细胞的可变形性在决定血液流动性，以及微循环的有效灌注方面都有十分重要的作用。许多疾病伴有红细胞膜可变形性的异常。膜的流动性是细胞的重要力学特性，红细胞的所有正常生理功能都与细胞膜结构的完整性及脂质双层的流动性有关。有研究表明：冠心病患者心绞痛发作后，血流速度减慢，红细胞聚集性增强，红细胞膜流动性降低，微循环灌注恶化；急性心肌梗塞患者红细胞膜流动性明显降低。但在心肌急性缺血再灌注损伤(I/R)时红细膜流动性的变化还未见报道。本文旨在观察大鼠心肌急性缺血再灌注损伤(I/R)时红细胞膜流动性变化及某些药物作用。
, http://www.100md.com
材料与方法
1.大鼠心肌I/R模型：Wistar大鼠(由本校动物室提供，体重200～250 g)。戊巴比妥钠(40 mg/kg ip)麻醉，气管插管，微型动物呼吸机维持呼吸，频率50～60次/min，潮气量5 mL/100 g。左侧第四肋间开胸，暴露心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间左冠状动脉起始点下方2～3 mm处用4号线结扎左冠状动脉前降支，对照组只穿一条4号线但不结扎。实验组于结扎前5 min给药，结扎左冠状动脉前降支30 min后，放开再灌注30 min。整个实验过程中用Ⅱ导联心电记录，经FZG-81直流前置放大器放大(增益200，1000；滤波0.1 kHz；输入选择1 s)，由SR54超低频双线示波器监测心电(灵敏度100 mV/cm,扫描速度50 ms)，经生物信号采集板将心电图数据采集，用GNSA软件，计算机记录。然后断头取血3～5 mL测定乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CPK)。
2.红细胞膜流动性的测定：制备红细胞膜悬浮液：取抗凝血离心，弃上清与表面白膜。用等渗磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次。将沉淀的红细胞悬液在等渗PBS中配成1∶1的悬液备用。
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(1)低渗溶血：2 mL(1∶1)红细胞悬液28 mL pH7.4,10 mmol/L PBS,置4℃冰箱1 h。
(2)分离红细胞膜：取低渗溶血液于50 mL聚乙烯脂离心管中，4℃离心(10 000 r/min 30 min)。弃上清，得红色影泡，pH7.4 ,10 μmol/L PBS洗后4℃离心，(10 000 r/min, 30 min)，共两次。pH7.4 10 mmol/L PBS稀释成10 mL悬浮液冰箱中保存。
(3)红细胞膜蛋白测定：70 g/L牛血清蛋白，0.9% NaCl稀释50倍配成母液，取5个10 mL试管，一管取1 mL母液稀释5倍，二管取1 mL一管液稀释2倍，以后3管依次如二管配置。每个管中5 mL硷性丙酮混匀，室温20 min。然后加酚试剂0.5 mL混匀，室温30 min。650 nm下紫外分光光度计测定各管光密度。制成量效关系曲线。取1 mL红细胞膜悬浮液根据量效关系曲线测定红细胞膜蛋白浓度，然后将红细胞膜悬浮液配成200～800 ng/L液用于红细胞膜脂流动性测定。
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(4)红细胞膜脂流动性测定：取红细胞膜悬浮液2.0 mL，蛋白浓度200～800 ng/L，用等量的2.0×10-6 mol/L DPH 25℃标记30 min。台式离心机3000 r/min,20 min，去残余标记液，共两次。pH7.4 10 mmol/L PBS洗1次，最后样本悬浮在pH7.4 PBS中。用荧光分光光度计在激发光波长362 nm，发射光波长432 nm下测定各标本的荧光偏振度。
3.心律失常评分标准：(Curtis Walker, 1988)。
早搏(ventricular premature beats, PVC)1分；二联律/齐射(bigeminy/salvo， BS)2分；室速(ventricular tachycardia, VT)3分；非持续性室颤(non-sustained ventricular fibrillation, non-sustained VF)4分；持续性室颤(sustained ventricular fibrillation, sustained VF)5分；
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4.统计处理：室验数据用SPSS软件包进行统计学分析。结果用均数±标准差(
)表示，单因素方差分析统计。
结果
1.急性缺血再灌注损伤(I/R)时心肌电活动和血清酶(LDH，CPK)的变化：结扎大鼠冠状动脉前降支30 min，再灌注30 min，LDH，CPK显著升高，同时出现严重室性心律失常，心律失常严重程度与血清酶变化呈显著相关，P<0.05，图1。
Fig 1 The changes of seurm creatine (CPK, LDH)during acute myocardial ischemia and reperfusion group and control group in rat heart. CON=control;,n=8,*P<0.05, vs control
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图1 大鼠心肌急性缺血再灌注损伤(I/R)组与正常组(Con)心肌电活动和血清酶(LDH，CPK)的变化
2.I/R时红细胞膜流动性的变化：I/R时红细胞膜荧光偏振值下降(0.320±0.006～0.315±0.002，P<0.05,n=8)。亦即红细胞膜流动性或变形能力增强。
3.正常及缺血再灌注时药物对红细胞膜流动性的影响：DTNP，川芎嗪在正常及缺血再灌注损伤时对红细胞膜流动性无影响。1，6二磷酸果糖可使正常红细胞膜荧光偏振值下降，在急性缺血再灌注损伤时红细胞膜流动性则使其趋于正常，提示：1，6二磷酸果糖有稳定红细胞膜流动性的作用。
讨论
本文首次研究了大鼠急性心肌缺血再灌注损伤时红细胞膜流动性的变化。当结扎大鼠冠状动脉前降支30 min再灌注30 min后血清酶(LDH，CPK)明显升高，同时出现严重的室性心律失常。电生理变化与血清酶变化正相关，表明心肌细胞已经受损。而此时红细胞膜荧光偏振度P值却下降，提示红细胞膜流动性增强，亦即红细胞流动性增强。这与电生理变化相反，而与苏晓华等的报道一致。他们的工作表明：缺血再灌注早期线粒体呼吸链功能代尝性增高，膜结合型已糖激酶活性升高，线粒体膜流动性增强与糖酵解水平增高有关。在急性缺血再灌损伤时红细胞膜代谢主要以糖酵解为主，故缺血再灌时红细胞膜流动性增强可能也是代偿性反应。为进一步探讨缺血再灌注时红细胞膜流动性变化的机制，本文观察了DTNB，川芎嗪，1，6二磷酸果糖在正常和缺血再灌注损伤时对红细胞膜流动性的影响。结果发现，DTNB，川芎嗪在正常和缺血再换注损伤时对红细胞膜的流动性均无影响；1，6二磷酸果糖可使正常红细胞膜荧光偏振值下降，在缺血再灌注损伤条件下使红细胞膜流动性趋于正常，提示1，6二磷酸果糖有稳定红细胞膜流动性的作用。此结果进一步说明缺血再灌注损伤时红细胞膜流动性的变化可能与能量代谢有关。
(1998年5月12日收稿，1999年3月11日修回), http://www.100md.com
单位：首都医科大学心血管生理教研室(北京100054)
关键词：
中国病理生理杂志990635 有关心肌缺血再灌注损伤已有很多研究，最近Makoto Suematsu等的工作表明：微循环紊乱是心肌细胞损伤的前提和关键。而红细胞的可变形性在决定血液流动性，以及微循环的有效灌注方面都有十分重要的作用。许多疾病伴有红细胞膜可变形性的异常。膜的流动性是细胞的重要力学特性，红细胞的所有正常生理功能都与细胞膜结构的完整性及脂质双层的流动性有关。有研究表明：冠心病患者心绞痛发作后，血流速度减慢，红细胞聚集性增强，红细胞膜流动性降低，微循环灌注恶化；急性心肌梗塞患者红细胞膜流动性明显降低。但在心肌急性缺血再灌注损伤(I/R)时红细膜流动性的变化还未见报道。本文旨在观察大鼠心肌急性缺血再灌注损伤(I/R)时红细胞膜流动性变化及某些药物作用。
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材料与方法
1.大鼠心肌I/R模型：Wistar大鼠(由本校动物室提供，体重200～250 g)。戊巴比妥钠(40 mg/kg ip)麻醉，气管插管，微型动物呼吸机维持呼吸，频率50～60次/min，潮气量5 mL/100 g。左侧第四肋间开胸，暴露心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间左冠状动脉起始点下方2～3 mm处用4号线结扎左冠状动脉前降支，对照组只穿一条4号线但不结扎。实验组于结扎前5 min给药，结扎左冠状动脉前降支30 min后，放开再灌注30 min。整个实验过程中用Ⅱ导联心电记录，经FZG-81直流前置放大器放大(增益200，1000；滤波0.1 kHz；输入选择1 s)，由SR54超低频双线示波器监测心电(灵敏度100 mV/cm,扫描速度50 ms)，经生物信号采集板将心电图数据采集，用GNSA软件，计算机记录。然后断头取血3～5 mL测定乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CPK)。
2.红细胞膜流动性的测定：制备红细胞膜悬浮液：取抗凝血离心，弃上清与表面白膜。用等渗磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次。将沉淀的红细胞悬液在等渗PBS中配成1∶1的悬液备用。
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(1)低渗溶血：2 mL(1∶1)红细胞悬液28 mL pH7.4,10 mmol/L PBS,置4℃冰箱1 h。
(2)分离红细胞膜：取低渗溶血液于50 mL聚乙烯脂离心管中，4℃离心(10 000 r/min 30 min)。弃上清，得红色影泡，pH7.4 ,10 μmol/L PBS洗后4℃离心，(10 000 r/min, 30 min)，共两次。pH7.4 10 mmol/L PBS稀释成10 mL悬浮液冰箱中保存。
(3)红细胞膜蛋白测定：70 g/L牛血清蛋白，0.9% NaCl稀释50倍配成母液，取5个10 mL试管，一管取1 mL母液稀释5倍，二管取1 mL一管液稀释2倍，以后3管依次如二管配置。每个管中5 mL硷性丙酮混匀，室温20 min。然后加酚试剂0.5 mL混匀，室温30 min。650 nm下紫外分光光度计测定各管光密度。制成量效关系曲线。取1 mL红细胞膜悬浮液根据量效关系曲线测定红细胞膜蛋白浓度，然后将红细胞膜悬浮液配成200～800 ng/L液用于红细胞膜脂流动性测定。
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(4)红细胞膜脂流动性测定：取红细胞膜悬浮液2.0 mL，蛋白浓度200～800 ng/L，用等量的2.0×10-6 mol/L DPH 25℃标记30 min。台式离心机3000 r/min,20 min，去残余标记液，共两次。pH7.4 10 mmol/L PBS洗1次，最后样本悬浮在pH7.4 PBS中。用荧光分光光度计在激发光波长362 nm，发射光波长432 nm下测定各标本的荧光偏振度。
3.心律失常评分标准：(Curtis Walker, 1988)。
早搏(ventricular premature beats, PVC)1分；二联律/齐射(bigeminy/salvo， BS)2分；室速(ventricular tachycardia, VT)3分；非持续性室颤(non-sustained ventricular fibrillation, non-sustained VF)4分；持续性室颤(sustained ventricular fibrillation, sustained VF)5分；
, 百拇医药
4.统计处理：室验数据用SPSS软件包进行统计学分析。结果用均数±标准差(
)表示，单因素方差分析统计。结果
1.急性缺血再灌注损伤(I/R)时心肌电活动和血清酶(LDH，CPK)的变化：结扎大鼠冠状动脉前降支30 min，再灌注30 min，LDH，CPK显著升高，同时出现严重室性心律失常，心律失常严重程度与血清酶变化呈显著相关，P<0.05，图1。
Fig 1 The changes of seurm creatine (CPK, LDH)during acute myocardial ischemia and reperfusion group and control group in rat heart. CON=control;
,n=8,*P<0.05, vs control, 百拇医药
图1 大鼠心肌急性缺血再灌注损伤(I/R)组与正常组(Con)心肌电活动和血清酶(LDH，CPK)的变化
2.I/R时红细胞膜流动性的变化：I/R时红细胞膜荧光偏振值下降(0.320±0.006～0.315±0.002，P<0.05,n=8)。亦即红细胞膜流动性或变形能力增强。
3.正常及缺血再灌注时药物对红细胞膜流动性的影响：DTNP，川芎嗪在正常及缺血再灌注损伤时对红细胞膜流动性无影响。1，6二磷酸果糖可使正常红细胞膜荧光偏振值下降，在急性缺血再灌注损伤时红细胞膜流动性则使其趋于正常，提示：1，6二磷酸果糖有稳定红细胞膜流动性的作用。
讨论
本文首次研究了大鼠急性心肌缺血再灌注损伤时红细胞膜流动性的变化。当结扎大鼠冠状动脉前降支30 min再灌注30 min后血清酶(LDH，CPK)明显升高，同时出现严重的室性心律失常。电生理变化与血清酶变化正相关，表明心肌细胞已经受损。而此时红细胞膜荧光偏振度P值却下降，提示红细胞膜流动性增强，亦即红细胞流动性增强。这与电生理变化相反，而与苏晓华等的报道一致。他们的工作表明：缺血再灌注早期线粒体呼吸链功能代尝性增高，膜结合型已糖激酶活性升高，线粒体膜流动性增强与糖酵解水平增高有关。在急性缺血再灌损伤时红细胞膜代谢主要以糖酵解为主，故缺血再灌时红细胞膜流动性增强可能也是代偿性反应。为进一步探讨缺血再灌注时红细胞膜流动性变化的机制，本文观察了DTNB，川芎嗪，1，6二磷酸果糖在正常和缺血再灌注损伤时对红细胞膜流动性的影响。结果发现，DTNB，川芎嗪在正常和缺血再换注损伤时对红细胞膜的流动性均无影响；1，6二磷酸果糖可使正常红细胞膜荧光偏振值下降，在缺血再灌注损伤条件下使红细胞膜流动性趋于正常，提示1，6二磷酸果糖有稳定红细胞膜流动性的作用。此结果进一步说明缺血再灌注损伤时红细胞膜流动性的变化可能与能量代谢有关。
(1998年5月12日收稿，1999年3月11日修回), http://www.100md.com