反义N-ras 1基因抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞增殖和肥大
作者：孙 旗 徐成斌
单位：北京医科大学第二临床学院心血管内科(北京 100044)
关键词：基因；心肌；细胞；培养的；血管紧张素Ⅱ；原癌基因
反义N 摘 要 目的：探讨逆转录病毒介导的N-ras 1基因对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞增殖和肥大的抑制作用，及其应用于心肌肥厚基因治疗的可能性。方法：将重组逆转录病毒反义N-ras 1基因体外转染乳鼠心肌细胞。应用RT-PCR及Western印迹法检测基因表达情况。应用细胞计数、[3H]-TdR掺入及细胞体积检测手段，观察N-ras 1基因对心肌细胞增殖及肥大的抑制作用。结果：逆转录病毒载体能将外源性基因导入心肌细胞并表达。反义N-ras 1基因导入可抑制心细胞增殖及肥大。结论：逆转录病毒介导N-ras 1基因有可能作为心肌肥厚的基因治疗手段。
Inhibitory effect on antisense N-ras 1 gene on the proliferation and hypertrophy of cardiomyocytes induced by angiotension Ⅱ
, 百拇医药
SUN Qi, XU Cheng-Bin
Department of Cardiology, People's Hospital, Beijing Medical Univrersity, Beijing(100044)
Abstract AIM:To study the inhibitory effect of antisense N-ras 1 gene mediated by retrovirus vector on proliferation and hypertyophy of cardiomyocytes induced by Ang Ⅱ and the possibility by using antisense N-ras 1 gene for gene therapy of cardiac hypertrophy. METHODS：Antisense N-ras 1 gene recombinant retrovirus vector was transfected into cardiomyocytes in vitro. The expression of ras mRNA and p21 protein were detected by RT-PCR and Western blotting. The inhibitory role of antisense N-ras 1 gene for proliferation and hypertrophy of cardiomyocytes was observed by cell counting,[3 H]-TdR incorporation and cell volume respectively. RESULTS：Retrovirus vector tramsfered antisense N-ras 1 gene into cardiomyocytes. The expression of antisense N-ras 1 gene restricted the proliferation and hypertrophy of cardiomyocytes. CONCLUSION：Antisese N-ras 1 gene mediated by retrovirus can be used to treat cardiac hypertrophy.
, 百拇医药
MeSH Genes; Myocardium; Cells, cultured; Angiotensin Ⅱ; Prot-oncogenes
心肌肥厚是心肌及其间质细胞对生长因子的一种应答反映，是体内一系列基因异常表达的结果。血管紧张素Ⅱ(angiotension Ⅱ,Ang Ⅱ)是影响心肌肥厚的主要因子，具有促心肌细胞增殖和肥大的作用[1]。原癌基因ras表达产物p21蛋白是一种小分子量的G蛋白，可与GTP结合向细胞内传递增殖信息[2]。因而Ang Ⅱ的作用可能与p21蛋白有关。本研究选用逆转录病毒载体重组反义N-ras 1基因体外传染乳鼠心肌细胞，观察对心肌细胞增殖和肥大的作用，以探讨利用反义技术治疗心肌肥厚的可能性。
材料与方法
一、材料：
N-ras 1质粒由上海肿瘤研究所提供。基因片段长度0.9 kb，氨苄抗性。包装细胞PA317和NIH3T3由中科院病毒所提供。受体菌E.coli HB 101为本室储存。限制性内切酶购自德国GIBCOBRL和Promega公司，Ang Ⅱ购于Sigma公司。
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二、方法：
1.构建fpGV1-MT-N-ras 1(exon 1)逆转录病毒重组载体，得到重组质粒后用EcoR1、Bg 1Ⅱ双酶切鉴定。
2.细胞培养、转染及抗性克隆的筛选：取出生后1～3 d的正常Wistar大鼠乳鼠，按Scott等[3]方法培养心肌细胞。包装细胞PA317和NIH3T3细胞均用含有10%～20%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下进行培养。用磷酸钙沉淀法将重组质粒导入PA317中，经G418筛选获得抗性克隆，用NIH 3T3细胞测定重组病毒的滴度，挑取高滴度的PA317细胞克隆收集其上清，经40 000 r/min离心60 min浓缩100倍后，转染心肌细胞。
3.RT-PCR定量检测N-ras mRNA表达：采用一步法提取细胞总RNA。用PE公司的反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录以获得cDNA。再进行PCR双扩增反应，同时加入N-ras引物一对和β-actin引物一对在同一体系中扩增N-ras和β-actin这两个目的片段。
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N-ras引物序列：
5’-CTGGTGTGAAATGACTGAGT
5’-GGTGGGATCATATTCATCTA
β-actin引物序列：
5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAAC
5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCAA
PCR反应条件：95℃，1 min→50℃，30 s→72℃, 1min，共30个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果。
4. Western印迹检测p21蛋白的表达：细胞总蛋白的提取，聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转移后显色，用N-ras p21抗体检测p21蛋白并进行定量分析。
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5.细胞计数方法：消化贴壁生长的细胞制成悬液并调整至细胞5×104个/mL，移入24孔培养板中，孵育24 h后换成含2%胎牛血清的培养液，继续孵育24 h加入Ang Ⅱ，再培养72 h，用血细胞计数板进行计数。
6.液闪计数法检测[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)细胞内掺入情况：心肌细胞接种及检测时相同前。检测前4 h每孔加入2.5 μL [3 H]-TdR[(3.7×1010Bq/mL)，中国原子能科学研究院]。收集细胞，破膜，液闪计数。每次计3孔，取平均值。
7.细胞体积测定：细胞体积是通过测量细胞直径获得的。将各组心肌细胞分别接种于培养皿内， 按上述方法加入干预因素72 h后，中止培养。用无Ca2+、Mg2+的Hanks液快速冲洗长满细胞的培养皿3次，加入2 mL 0.25%的胰酶溶液约10 min后加入3 mL含有10%胎牛血清的培养基终止消化。在倒置显微镜下，可观察到细胞呈圆型，每组随机选择20个细胞，用计算机MICC软件测量细胞的直径，通过直径计算出每个细胞的体积。
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三、统计处理：
数据以
表示，组间用t检验判定均数差异显著性。
结果
一、重组质粒的酶切：
质粒载体为fpGV1-MT，长度为5.8 kb，N-ras 1 cDNA片断长度为0.9 kb,EcoRⅠ、Bg1 Ⅱ酶切。
二、重组逆转录病毒滴度的测定：
取PA317抗性克隆株培养上清制备病毒悬液，感染NIH 3T3细胞，经G418筛选，2周后根据长出的克隆计算病毒的滴度为2×105 CFU/mL。
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三、反义N-ras 1基因对心肌细胞增殖的影响：
如图1所示，此结果表明在细胞水平上，转染了重组逆转病毒反义N-ras 1基因的心肌细胞的增殖受到一定程度的抑制。而转染了正义N-ras 1基因的心肌细胞的细胞计数与加入Ang Ⅱ刺激的心肌细胞相比无显著差异(P>0.05)，说明正义N-ras 1基因对细胞增殖无抑制作用。
Fig 1 Effect of antisense N-ras 1 gene on the proliferation of cardiomyocytes induced by AngⅡ (,n=6)
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A:control; B:10-8mol/L Ang Ⅱ;D:antisense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ;F:sense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ
图1 反义N-ras 1对AngⅡ 诱导心肌细胞增殖的影响
四、反义N-ras 1基因对心肌细胞DNA合成的影响：
在Ang Ⅱ刺激组，心肌细胞的DNA合成较对照组多了38.5%(P<0.05)说明Ang Ⅱ具有明显的促心肌细胞增殖作用。转染了反义N-ras 1基因的心肌细胞组较AngⅡ刺激组低了26.3%(P<0.05)，转染了正义N-ras 1基因细胞组与AngⅡ基因细胞组与Ang Ⅱ刺激组相比无显著差异(P>0.05)，(如图2所示)。
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Fig 2 Effect of antisense N-ras 1 gene on the DNA incorporation of cardiomyocytes induced by Ang Ⅱ (,n=6)
A:control; B:10-8mol/L Ang Ⅱ;D:antisense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ;F:sense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ
图2 反义N-ras 1基因对心肌细胞DNA合成的影响
五、反义N-ras 1基因对心肌细胞平均体积的影响：
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加入Ang Ⅱ 72 h后，测定心肌细胞体积，结果显示，Ang Ⅱ刺激组的单个心肌细胞体积为2 135.5±33.6，明显高于对照组1 521.3±25.4(P<0.05)，而转染反义N-ras 1基因的细胞体积为1 743±23.6显著低于Ang Ⅱ刺激组(P<0.05)，说明反义N-ras 1基因对Ang Ⅱ诱导的心肌细胞体积增加有抑制作用。
六、反义N-ras 1基因对N-ras mRNA表达的影响：
以适量的各组心肌细胞总RNA进行反转录，反转录得到cDNA用β-actin和ras两对引物进行PCR双扩增反应，通过定量观察β-actin/ras的比值，来比较各细胞间ras mRNA的表达水平。结果发现：Ang Ⅱ刺激组和转染正义 N-ras 1基因组心肌细胞的ras mRNA表达明显强于对照组，而转染反义N-ras 1基因组的细胞表达水平低于Ang Ⅱ刺激组，(图3)。
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Fig 3 Effect of antisense N-ras 1 gene on N-ras mRNA expression of cardiomyocytes
A:control B:10-8mol/L Ang Ⅱ;D:antisense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ;F:sense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ
图3 反义N-ras 1 基因对心肌细胞N-ras mRNA表达的影响
七、反义N-ras 1基因对ras表达产物p21蛋白的影响：
经Ang Ⅱ单独刺激的心肌细胞OD值为8.50±0.48与对照组OD值6.81±0.57相比，p21蛋白表达量增高(P<0.05,n=4)；而转染反义N-ras 1基因组(OD值为7.38±0.41)表达水平低于Ang Ⅱ单独刺激组(P<0.05, n=4)。图4的结果提示反义N-ras 1基因部分抑制了Ang Ⅱ诱导的心肌细胞内p21蛋白表达。
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Fig 4 Western blotting
A:control; B:10-8mol/L Ang Ⅱ;D:antisense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ;F:sense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ
图4 蛋白质印迹法
讨论
近年来研究发现，ras基因在某些心血管疾病的发生发展的分子机制中起到了十分重要的作用。
在新生大鼠心脏中有ras基因的表达[4]。在心肌负荷时，ras基因的表达增加，一些促心肌生长因子亦可通过ras基因表达产物作为中介，通过磷酸肌酸激酶和蛋白激酶C增加的胞内钙，促进fos或myc基因的表达，引起细胞的增生和肥大。高血压、瓣膜病、缺血性心脏病等都可引起心肌负荷的增加。增生和肥厚的心肌，还可促进血管紧张素和一些生长因子的生成再反馈性引起心肌的增生。
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Ang Ⅱ是肾素-血管紧张素系统中一个重要成员，是心肌肥厚形成的主要影响因素之一。本工作中证实其具有促进心肌细胞增殖和肥大作用，同时还发现Ang Ⅱ作用后，心肌细胞内N-ras基因mRNA和表达蛋白p21的水平明显增高。这说明Ang Ⅱ的促心肌细胞增殖和肥大作用与N-ras基因有关，N-ras基因的变化和其表达蛋白p21功能的改变都可影响Ang Ⅱ的作用。但是N-ras基因在Ang Ⅱ作用后的高表达究竟直接反应还是一种伴随现象，还需作进一步研究。
正常状态下，外界刺激信号传入细胞使p21GDP转化为p21GTP，从而激活腺苷酸环化酶、磷酸肌醇激酶和蛋白激酶C，产生大量的第二信使，引起一系列细胞反应[5]。有研究表明，受体酪氨酸激酶Ras-MAPK是将外界刺激信号传递到细胞核内的最重要途径。Ras在这一信号转导途径中起着分子开关的作用。Ras表达产物p21蛋白可直接或间接激活浆内的丝氨酸苏氨酸激酶，引发蛋白质磷酸化级联反应。本实验中，利用反义N-ras 1基因抑制Ang Ⅱ刺激心肌细胞增殖和肥大的作用机制可能与上述机理有关。由于Ras在细胞信息传递中的承上启下的特殊地位，反义N-ras 1基因转染心肌细胞，直接转录出反义RNA与相应的mRNA形成双链，阻止mRNA翻译过程，也可以抑制其转录过程，其表达产物p21蛋白也受到抑制，最终使细胞增殖或肥大过程中胞内信息传导总通路受到抑制。本实验结果表明，反义N-ras 1基因对Ang Ⅱ诱导下的心肌细胞增殖、肥大，DNA合成，ras mRNA表达及p21蛋白表达均有抑制作用，对进一步阐明心肌肥厚的发生机制及寻找新的防治对策提出了可供探索的途径。
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参考文献
1 Komuro I, Katoh Y, Hoh E, et al. Mechanisms of cardiac hypertrophy and injury-possible role of protein kinase C acitivation. Jpn Circ J, 1991, 55:1149.
2 Neyses L, Haber E, Homcy C. Molecular biology of oncogens and cardiovascular hypertrop. J Hypertens, 1992, 10:1447.
3 Scott JA, Khaw BA, Locke E, et al. The role of free radical-mediated processes in oxygen-related damage in cultured murine myocardial cells. Circ Res, 1985, 56:72.
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4 Claycomb WC, Lanson NA. Proto-oncogene expression in proliferating and differentiating cardiac and skeletal muscle. Biochem J, 1987, 247:701.
5 Satoch T, Nakafuku M, Kaziro Y. Function of ras as a molecular swicth in signal transduction. J Biol Chem, 1992, 267:24149.
(1998年10月6日收稿，1999年1月29日修回), 百拇医药
单位：北京医科大学第二临床学院心血管内科(北京 100044)
关键词：基因；心肌；细胞；培养的；血管紧张素Ⅱ；原癌基因
反义N 摘 要 目的：探讨逆转录病毒介导的N-ras 1基因对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞增殖和肥大的抑制作用，及其应用于心肌肥厚基因治疗的可能性。方法：将重组逆转录病毒反义N-ras 1基因体外转染乳鼠心肌细胞。应用RT-PCR及Western印迹法检测基因表达情况。应用细胞计数、[3H]-TdR掺入及细胞体积检测手段，观察N-ras 1基因对心肌细胞增殖及肥大的抑制作用。结果：逆转录病毒载体能将外源性基因导入心肌细胞并表达。反义N-ras 1基因导入可抑制心细胞增殖及肥大。结论：逆转录病毒介导N-ras 1基因有可能作为心肌肥厚的基因治疗手段。
Inhibitory effect on antisense N-ras 1 gene on the proliferation and hypertrophy of cardiomyocytes induced by angiotension Ⅱ
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SUN Qi, XU Cheng-Bin
Department of Cardiology, People's Hospital, Beijing Medical Univrersity, Beijing(100044)
Abstract AIM:To study the inhibitory effect of antisense N-ras 1 gene mediated by retrovirus vector on proliferation and hypertyophy of cardiomyocytes induced by Ang Ⅱ and the possibility by using antisense N-ras 1 gene for gene therapy of cardiac hypertrophy. METHODS：Antisense N-ras 1 gene recombinant retrovirus vector was transfected into cardiomyocytes in vitro. The expression of ras mRNA and p21 protein were detected by RT-PCR and Western blotting. The inhibitory role of antisense N-ras 1 gene for proliferation and hypertrophy of cardiomyocytes was observed by cell counting,[3 H]-TdR incorporation and cell volume respectively. RESULTS：Retrovirus vector tramsfered antisense N-ras 1 gene into cardiomyocytes. The expression of antisense N-ras 1 gene restricted the proliferation and hypertrophy of cardiomyocytes. CONCLUSION：Antisese N-ras 1 gene mediated by retrovirus can be used to treat cardiac hypertrophy.
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MeSH Genes; Myocardium; Cells, cultured; Angiotensin Ⅱ; Prot-oncogenes
心肌肥厚是心肌及其间质细胞对生长因子的一种应答反映，是体内一系列基因异常表达的结果。血管紧张素Ⅱ(angiotension Ⅱ,Ang Ⅱ)是影响心肌肥厚的主要因子，具有促心肌细胞增殖和肥大的作用[1]。原癌基因ras表达产物p21蛋白是一种小分子量的G蛋白，可与GTP结合向细胞内传递增殖信息[2]。因而Ang Ⅱ的作用可能与p21蛋白有关。本研究选用逆转录病毒载体重组反义N-ras 1基因体外传染乳鼠心肌细胞，观察对心肌细胞增殖和肥大的作用，以探讨利用反义技术治疗心肌肥厚的可能性。
材料与方法
一、材料：
N-ras 1质粒由上海肿瘤研究所提供。基因片段长度0.9 kb，氨苄抗性。包装细胞PA317和NIH3T3由中科院病毒所提供。受体菌E.coli HB 101为本室储存。限制性内切酶购自德国GIBCOBRL和Promega公司，Ang Ⅱ购于Sigma公司。
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二、方法：
1.构建fpGV1-MT-N-ras 1(exon 1)逆转录病毒重组载体，得到重组质粒后用EcoR1、Bg 1Ⅱ双酶切鉴定。
2.细胞培养、转染及抗性克隆的筛选：取出生后1～3 d的正常Wistar大鼠乳鼠，按Scott等[3]方法培养心肌细胞。包装细胞PA317和NIH3T3细胞均用含有10%～20%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下进行培养。用磷酸钙沉淀法将重组质粒导入PA317中，经G418筛选获得抗性克隆，用NIH 3T3细胞测定重组病毒的滴度，挑取高滴度的PA317细胞克隆收集其上清，经40 000 r/min离心60 min浓缩100倍后，转染心肌细胞。
3.RT-PCR定量检测N-ras mRNA表达：采用一步法提取细胞总RNA。用PE公司的反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录以获得cDNA。再进行PCR双扩增反应，同时加入N-ras引物一对和β-actin引物一对在同一体系中扩增N-ras和β-actin这两个目的片段。
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N-ras引物序列：
5’-CTGGTGTGAAATGACTGAGT
5’-GGTGGGATCATATTCATCTA
β-actin引物序列：
5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAAC
5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCAA
PCR反应条件：95℃，1 min→50℃，30 s→72℃, 1min，共30个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果。
4. Western印迹检测p21蛋白的表达：细胞总蛋白的提取，聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转移后显色，用N-ras p21抗体检测p21蛋白并进行定量分析。
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5.细胞计数方法：消化贴壁生长的细胞制成悬液并调整至细胞5×104个/mL，移入24孔培养板中，孵育24 h后换成含2%胎牛血清的培养液，继续孵育24 h加入Ang Ⅱ，再培养72 h，用血细胞计数板进行计数。
6.液闪计数法检测[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)细胞内掺入情况：心肌细胞接种及检测时相同前。检测前4 h每孔加入2.5 μL [3 H]-TdR[(3.7×1010Bq/mL)，中国原子能科学研究院]。收集细胞，破膜，液闪计数。每次计3孔，取平均值。
7.细胞体积测定：细胞体积是通过测量细胞直径获得的。将各组心肌细胞分别接种于培养皿内， 按上述方法加入干预因素72 h后，中止培养。用无Ca2+、Mg2+的Hanks液快速冲洗长满细胞的培养皿3次，加入2 mL 0.25%的胰酶溶液约10 min后加入3 mL含有10%胎牛血清的培养基终止消化。在倒置显微镜下，可观察到细胞呈圆型，每组随机选择20个细胞，用计算机MICC软件测量细胞的直径，通过直径计算出每个细胞的体积。
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三、统计处理：
数据以
表示，组间用t检验判定均数差异显著性。结果
一、重组质粒的酶切：
质粒载体为fpGV1-MT，长度为5.8 kb，N-ras 1 cDNA片断长度为0.9 kb,EcoRⅠ、Bg1 Ⅱ酶切。
二、重组逆转录病毒滴度的测定：
取PA317抗性克隆株培养上清制备病毒悬液，感染NIH 3T3细胞，经G418筛选，2周后根据长出的克隆计算病毒的滴度为2×105 CFU/mL。
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三、反义N-ras 1基因对心肌细胞增殖的影响：
如图1所示，此结果表明在细胞水平上，转染了重组逆转病毒反义N-ras 1基因的心肌细胞的增殖受到一定程度的抑制。而转染了正义N-ras 1基因的心肌细胞的细胞计数与加入Ang Ⅱ刺激的心肌细胞相比无显著差异(P>0.05)，说明正义N-ras 1基因对细胞增殖无抑制作用。
Fig 1 Effect of antisense N-ras 1 gene on the proliferation of cardiomyocytes induced by AngⅡ (
,n=6), http://www.100md.com
A:control; B:10-8mol/L Ang Ⅱ;D:antisense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ;F:sense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ
图1 反义N-ras 1对AngⅡ 诱导心肌细胞增殖的影响
四、反义N-ras 1基因对心肌细胞DNA合成的影响：
在Ang Ⅱ刺激组，心肌细胞的DNA合成较对照组多了38.5%(P<0.05)说明Ang Ⅱ具有明显的促心肌细胞增殖作用。转染了反义N-ras 1基因的心肌细胞组较AngⅡ刺激组低了26.3%(P<0.05)，转染了正义N-ras 1基因细胞组与AngⅡ基因细胞组与Ang Ⅱ刺激组相比无显著差异(P>0.05)，(如图2所示)。
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Fig 2 Effect of antisense N-ras 1 gene on the DNA incorporation of cardiomyocytes induced by Ang Ⅱ (
,n=6)A:control; B:10-8mol/L Ang Ⅱ;D:antisense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ;F:sense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ
图2 反义N-ras 1基因对心肌细胞DNA合成的影响
五、反义N-ras 1基因对心肌细胞平均体积的影响：
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加入Ang Ⅱ 72 h后，测定心肌细胞体积，结果显示，Ang Ⅱ刺激组的单个心肌细胞体积为2 135.5±33.6，明显高于对照组1 521.3±25.4(P<0.05)，而转染反义N-ras 1基因的细胞体积为1 743±23.6显著低于Ang Ⅱ刺激组(P<0.05)，说明反义N-ras 1基因对Ang Ⅱ诱导的心肌细胞体积增加有抑制作用。
六、反义N-ras 1基因对N-ras mRNA表达的影响：
以适量的各组心肌细胞总RNA进行反转录，反转录得到cDNA用β-actin和ras两对引物进行PCR双扩增反应，通过定量观察β-actin/ras的比值，来比较各细胞间ras mRNA的表达水平。结果发现：Ang Ⅱ刺激组和转染正义 N-ras 1基因组心肌细胞的ras mRNA表达明显强于对照组，而转染反义N-ras 1基因组的细胞表达水平低于Ang Ⅱ刺激组，(图3)。
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Fig 3 Effect of antisense N-ras 1 gene on N-ras mRNA expression of cardiomyocytes
A:control B:10-8mol/L Ang Ⅱ;D:antisense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ;F:sense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ
图3 反义N-ras 1 基因对心肌细胞N-ras mRNA表达的影响
七、反义N-ras 1基因对ras表达产物p21蛋白的影响：
经Ang Ⅱ单独刺激的心肌细胞OD值为8.50±0.48与对照组OD值6.81±0.57相比，p21蛋白表达量增高(P<0.05,n=4)；而转染反义N-ras 1基因组(OD值为7.38±0.41)表达水平低于Ang Ⅱ单独刺激组(P<0.05, n=4)。图4的结果提示反义N-ras 1基因部分抑制了Ang Ⅱ诱导的心肌细胞内p21蛋白表达。
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Fig 4 Western blotting
A:control; B:10-8mol/L Ang Ⅱ;D:antisense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ;F:sense N-ras 1 gene+10-8 mol/L Ang Ⅱ
图4 蛋白质印迹法
讨论
近年来研究发现，ras基因在某些心血管疾病的发生发展的分子机制中起到了十分重要的作用。
在新生大鼠心脏中有ras基因的表达[4]。在心肌负荷时，ras基因的表达增加，一些促心肌生长因子亦可通过ras基因表达产物作为中介，通过磷酸肌酸激酶和蛋白激酶C增加的胞内钙，促进fos或myc基因的表达，引起细胞的增生和肥大。高血压、瓣膜病、缺血性心脏病等都可引起心肌负荷的增加。增生和肥厚的心肌，还可促进血管紧张素和一些生长因子的生成再反馈性引起心肌的增生。
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Ang Ⅱ是肾素-血管紧张素系统中一个重要成员，是心肌肥厚形成的主要影响因素之一。本工作中证实其具有促进心肌细胞增殖和肥大作用，同时还发现Ang Ⅱ作用后，心肌细胞内N-ras基因mRNA和表达蛋白p21的水平明显增高。这说明Ang Ⅱ的促心肌细胞增殖和肥大作用与N-ras基因有关，N-ras基因的变化和其表达蛋白p21功能的改变都可影响Ang Ⅱ的作用。但是N-ras基因在Ang Ⅱ作用后的高表达究竟直接反应还是一种伴随现象，还需作进一步研究。
正常状态下，外界刺激信号传入细胞使p21GDP转化为p21GTP，从而激活腺苷酸环化酶、磷酸肌醇激酶和蛋白激酶C，产生大量的第二信使，引起一系列细胞反应[5]。有研究表明，受体酪氨酸激酶Ras-MAPK是将外界刺激信号传递到细胞核内的最重要途径。Ras在这一信号转导途径中起着分子开关的作用。Ras表达产物p21蛋白可直接或间接激活浆内的丝氨酸苏氨酸激酶，引发蛋白质磷酸化级联反应。本实验中，利用反义N-ras 1基因抑制Ang Ⅱ刺激心肌细胞增殖和肥大的作用机制可能与上述机理有关。由于Ras在细胞信息传递中的承上启下的特殊地位，反义N-ras 1基因转染心肌细胞，直接转录出反义RNA与相应的mRNA形成双链，阻止mRNA翻译过程，也可以抑制其转录过程，其表达产物p21蛋白也受到抑制，最终使细胞增殖或肥大过程中胞内信息传导总通路受到抑制。本实验结果表明，反义N-ras 1基因对Ang Ⅱ诱导下的心肌细胞增殖、肥大，DNA合成，ras mRNA表达及p21蛋白表达均有抑制作用，对进一步阐明心肌肥厚的发生机制及寻找新的防治对策提出了可供探索的途径。
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参考文献
1 Komuro I, Katoh Y, Hoh E, et al. Mechanisms of cardiac hypertrophy and injury-possible role of protein kinase C acitivation. Jpn Circ J, 1991, 55:1149.
2 Neyses L, Haber E, Homcy C. Molecular biology of oncogens and cardiovascular hypertrop. J Hypertens, 1992, 10:1447.
3 Scott JA, Khaw BA, Locke E, et al. The role of free radical-mediated processes in oxygen-related damage in cultured murine myocardial cells. Circ Res, 1985, 56:72.
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4 Claycomb WC, Lanson NA. Proto-oncogene expression in proliferating and differentiating cardiac and skeletal muscle. Biochem J, 1987, 247:701.
5 Satoch T, Nakafuku M, Kaziro Y. Function of ras as a molecular swicth in signal transduction. J Biol Chem, 1992, 267:24149.
(1998年10月6日收稿，1999年1月29日修回), 百拇医药