金属硫蛋白在心肌缺血再灌注损伤修复中的抗氧化作用
作者：金慧英 李法卿 房德兴 谭维国 陈华标 李素芹
单位：南京军区联勤部军事医学研究所 (南京 210002)
关键词：金属硫蛋白；脂质过氧化；局部缺血；再灌注
金属硫蛋白在心肌缺血再灌注损伤 修复中的抗氧化作用 摘 要 目的：探讨金属硫蛋白(MT)在心肌梗塞和缺血再灌注心肌损伤修复中与脂质过氧化的关系。方法：采用大鼠心肌梗塞/缺血再灌注模型，测定手术后24 h和8周心肌组织的MT及脂质过氧化的中间产物丙二醛(MDA)的含量。结果：心肌梗塞和缺血再灌注24 h后MDA含量均显著高于对照组(P<0.01)，8周后MDA显著降低(P<0.05)；而MT的含量在术后24 h即升高，8周MT继续升高，缺血再灌注组MT达(314.09±23.18) ng/mg蛋白。结论：MT对心肌梗塞和缺血再灌注所产生的脂质过氧化产物可能具有清除作用，从而促进损伤心肌的修复。
, 百拇医药
The antioxidative effects of metallothionein on recovery of
myocardial injury after ischemia and reperfusion
JIN Hui-Ying, LI Fa-Qing, FANG De-Xing, TAN Wei-Guo, CHEN Hua-Biao, LI Su-Qin
Institute of Military Medicine of Nanjing Command, PLA, Nanjing (210002)
Abstract AIM:The relationship of metallothionein(MT) and lipid peroxidation on myocardial injury of myocardial infarction and ischemia-reperfusion was studied. METHODS：Contents of MT and malonyldialdehyde (MDA)-metabolism products of lipid peroxidation of rat myocardial tissue were determined in 24 hours and 8 weeks after myocardial infarction and ischemia-reperfusion. RESULTS：After 24 hours myocardial infarction and ischemia-reperfusion, MDA contents were obviously higher than that of the control(P<0.01), especially in ischemia-reperfusion group, MDA contents were 5.7 folds of the control. But 8 weeks after myocardial infarction and ischemia-reperfusion, MDA contents were decreased progressively(P<0.05). After 24 hours of myocardial infarction and ischemia-reperfusion, MT contents were significantly higher than that of the control, then increased gradually in 8 weeks. MT contents reached to (314.09±23.18) ng/mg protein in 8 weeks group after ischemia-reperfusion.CONCLUSION：MT might be able to eliminate effectively the lipid peroxidation products which was caused by ischemia and reperfusion, thus created a better protection on myocardial injury.
, http://www.100md.com
MeSH Metallothionein; Lipid peroxides; Ischemia; Reperfusion
大量研究证明自由基损伤是缺血再灌注损伤的关键因素。金属硫蛋白(metallothionein,MT)是小分子可诱导蛋白，多种生理及病理情况下均有MT的变化，特别是MT具有清除自由基和脂质过氧化的功能[1]，但MT与心肌梗塞急性期和恢复期脂质过氧化的变化关系目前仍无明确结论，本研究旨在探讨MT在心肌缺血再灌注损伤恢复中是否具有持续的抗氧化作用，为MT在缺血再灌注损伤中的治疗研究提供依据。
材料与方法
(一)试剂和仪器：兔抗鼠MT抗体为本室自制，MDA测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，余试剂均为国产分析纯。PG-3022酶标仪(国营华东电子管厂)，UV-160A紫外分光光度计(SHIMADZU，日本)。
, http://www.100md.com
(二)标本制备和指标测定：参考文献[2]方法，30只雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)分为5组，乙醚麻醉，仰卧固定，接微型人工呼吸机及心电图机，行常压口腔通气并维持麻醉状态；常规消毒开胸，暴露心脏，剪开心包，5-0丝线穿过冠状动脉前降支部分，假手术组只穿线不结扎，心肌梗塞组结扎，缺血再灌注组阻断血流45 min后松开，实施再灌注，常规关胸，分笼饲养；分别于手术后24 h及8周处死。取心室肌称重，生理盐水制成10%匀浆，部分匀浆测定脂质过氧化的中间产物MDA含量，部分匀浆15 000 r/min 1 h离心，取上清按文献[3]测MT含量，蛋白定量采用染料法。
(三)统计学处理：结果数据以
表示，采用t检验判定组间差异的显著性。
, 百拇医药
结果
大鼠心肌梗塞和缺血再灌注处理24 h及8周后心肌组织MDA、MT的含量变化见表1。心肌梗塞和缺血再灌注后24 h MDA含量均显著高于对照组(P<0.01)，而在手术后8周发现心肌梗塞组MDA含量与对照相比已无明显差异，缺血再灌注组MDA含量显著低于24 h组(P<0.01)。MT的含量在手术后24 h即明显高于对照组(P<0.01)，手术后8周又显著高于24 h组(P<0.01)，特别是缺血再灌注组，8周时MT的含量是对照组的2.87倍，是24 h组的1.8倍，同时也显著高于心肌梗塞组(P<0.05)。
表1 大鼠心肌梗塞及缺血再灌注后不同
时间组MT与MDA的含量
Tab 1 Contents of MT and MDA of rat myocardial tissue in
, http://www.100md.com
different time course after myocardial infarction
and ischemia-reperfusion (,n=6)
Group
MDA
(nmol/mg pro)
MT
(ng/mg pro)
Control
, 百拇医药 2.454±0.430
109.19±14.18
Mycardial infarction
24 h
5.346±0.650**
141.92±21.25**
8 weeks
3.530±0.990
173.80±17.61**
Ischemia-reperfusion
, 百拇医药
24 h
13.909±1.440**
160.51±16.16**
8 weeks
4.162±0.520*
314.09±23.18**
* P<0.05,**P<0.01 vs control
讨论
结果表明：大鼠急性心肌梗塞和缺血再灌注后心肌细胞均产生大量氧自由基，特别是缺血再灌注后，活化的中性粒细胞大量聚集在缺血区，加速了自由基的生成，后者刺激生物膜中的不饱和脂肪酸启动自由基链式反应产生脂质过氧化，所以脂质过氧化含量间接反映了自由基损伤的程度，脂质过氧化造成膜结构与功能障碍，导致细胞损伤[4]，因而在最初的24 h MDA含量均显著增高。
, 百拇医药
MT作为一种小分子可诱导蛋白，广泛分布于哺乳动物的各种器官中，MT分子中有20个半胱氨酸残基，具有清除自由基和脂质过氧化的功能，是重要的内源性抗损伤物质，在多种应激及病理情况下均有MT的升高，因而MT可能参与心肌损伤的修复过程。Kang[5]采用转基因小鼠研究证明高表达MT的小鼠缺血再灌注后心肌损伤程度明显小于非转基因鼠。本实验也发现心肌梗塞和缺血再灌注24 h后心肌MT含量明显升高，考虑这可能是应激状态下的一种代偿反应。在手术后8周，MT持续升高，可发挥清除自由基及脂质过氧化的功能，特别是在急性期脂质过氧化严重升高的缺血再灌注组，心肌MT的含量显著高于24 h组和心肌梗塞组，同时恢复期脂质过氧化又显著降低，推测MT对心肌缺血和缺血再灌注所至的脂质过氧化有清除作用，并参与心肌细胞损伤的修复，在心肌修复中起着持续的抗氧化作用，这可能与MT富含巯基的结构有关。至于MT是否还具有其他的保护作用机制有待进一步研究。
参考文献
1 朱赓伯.金属硫蛋白的生物学特性及生理作用.生命的化学， 1995，15(1)：23.
, http://www.100md.com
2 Satoshi Y, Shozo K, Moritani H, et al. Reperfusion hastens appearance and extent of distribution of type 1 collagen in infart sone. Cardiovasc Res, 1995,307:763.
3 金慧英，魏尧梅，胡惠民，等.镉-金属硫蛋白的抗体制备及酶联免疫吸附法测定.中国公共卫生，1998，14(2)：103.
4 Zweior JL. Measurement of superoxide derived free radicals in the reperfused heart. Evidence for a free radical mechanism of reperfusion injury. J Biol Chem, 1988,263:1353.
5 Kang YJ, Chen Y, Yu A, et al. Overexpression of metallothionein in the heart of transgenic mice suppresses doxonibicin cardiotoxicity. J Clin Invest, 1997,15:1501.
(1998年9月2日收稿，1999年1月1日修回), http://www.100md.com
单位：南京军区联勤部军事医学研究所 (南京 210002)
关键词：金属硫蛋白；脂质过氧化；局部缺血；再灌注
金属硫蛋白在心肌缺血再灌注损伤 修复中的抗氧化作用 摘 要 目的：探讨金属硫蛋白(MT)在心肌梗塞和缺血再灌注心肌损伤修复中与脂质过氧化的关系。方法：采用大鼠心肌梗塞/缺血再灌注模型，测定手术后24 h和8周心肌组织的MT及脂质过氧化的中间产物丙二醛(MDA)的含量。结果：心肌梗塞和缺血再灌注24 h后MDA含量均显著高于对照组(P<0.01)，8周后MDA显著降低(P<0.05)；而MT的含量在术后24 h即升高，8周MT继续升高，缺血再灌注组MT达(314.09±23.18) ng/mg蛋白。结论：MT对心肌梗塞和缺血再灌注所产生的脂质过氧化产物可能具有清除作用，从而促进损伤心肌的修复。
, 百拇医药
The antioxidative effects of metallothionein on recovery of
myocardial injury after ischemia and reperfusion
JIN Hui-Ying, LI Fa-Qing, FANG De-Xing, TAN Wei-Guo, CHEN Hua-Biao, LI Su-Qin
Institute of Military Medicine of Nanjing Command, PLA, Nanjing (210002)
Abstract AIM:The relationship of metallothionein(MT) and lipid peroxidation on myocardial injury of myocardial infarction and ischemia-reperfusion was studied. METHODS：Contents of MT and malonyldialdehyde (MDA)-metabolism products of lipid peroxidation of rat myocardial tissue were determined in 24 hours and 8 weeks after myocardial infarction and ischemia-reperfusion. RESULTS：After 24 hours myocardial infarction and ischemia-reperfusion, MDA contents were obviously higher than that of the control(P<0.01), especially in ischemia-reperfusion group, MDA contents were 5.7 folds of the control. But 8 weeks after myocardial infarction and ischemia-reperfusion, MDA contents were decreased progressively(P<0.05). After 24 hours of myocardial infarction and ischemia-reperfusion, MT contents were significantly higher than that of the control, then increased gradually in 8 weeks. MT contents reached to (314.09±23.18) ng/mg protein in 8 weeks group after ischemia-reperfusion.CONCLUSION：MT might be able to eliminate effectively the lipid peroxidation products which was caused by ischemia and reperfusion, thus created a better protection on myocardial injury.
, http://www.100md.com
MeSH Metallothionein; Lipid peroxides; Ischemia; Reperfusion
大量研究证明自由基损伤是缺血再灌注损伤的关键因素。金属硫蛋白(metallothionein,MT)是小分子可诱导蛋白，多种生理及病理情况下均有MT的变化，特别是MT具有清除自由基和脂质过氧化的功能[1]，但MT与心肌梗塞急性期和恢复期脂质过氧化的变化关系目前仍无明确结论，本研究旨在探讨MT在心肌缺血再灌注损伤恢复中是否具有持续的抗氧化作用，为MT在缺血再灌注损伤中的治疗研究提供依据。
材料与方法
(一)试剂和仪器：兔抗鼠MT抗体为本室自制，MDA测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，余试剂均为国产分析纯。PG-3022酶标仪(国营华东电子管厂)，UV-160A紫外分光光度计(SHIMADZU，日本)。
, http://www.100md.com
(二)标本制备和指标测定：参考文献[2]方法，30只雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)分为5组，乙醚麻醉，仰卧固定，接微型人工呼吸机及心电图机，行常压口腔通气并维持麻醉状态；常规消毒开胸，暴露心脏，剪开心包，5-0丝线穿过冠状动脉前降支部分，假手术组只穿线不结扎，心肌梗塞组结扎，缺血再灌注组阻断血流45 min后松开，实施再灌注，常规关胸，分笼饲养；分别于手术后24 h及8周处死。取心室肌称重，生理盐水制成10%匀浆，部分匀浆测定脂质过氧化的中间产物MDA含量，部分匀浆15 000 r/min 1 h离心，取上清按文献[3]测MT含量，蛋白定量采用染料法。
(三)统计学处理：结果数据以
表示，采用t检验判定组间差异的显著性。, 百拇医药
结果
大鼠心肌梗塞和缺血再灌注处理24 h及8周后心肌组织MDA、MT的含量变化见表1。心肌梗塞和缺血再灌注后24 h MDA含量均显著高于对照组(P<0.01)，而在手术后8周发现心肌梗塞组MDA含量与对照相比已无明显差异，缺血再灌注组MDA含量显著低于24 h组(P<0.01)。MT的含量在手术后24 h即明显高于对照组(P<0.01)，手术后8周又显著高于24 h组(P<0.01)，特别是缺血再灌注组，8周时MT的含量是对照组的2.87倍，是24 h组的1.8倍，同时也显著高于心肌梗塞组(P<0.05)。
表1 大鼠心肌梗塞及缺血再灌注后不同
时间组MT与MDA的含量
Tab 1 Contents of MT and MDA of rat myocardial tissue in
, http://www.100md.com
different time course after myocardial infarction
and ischemia-reperfusion (
,n=6)Group
MDA
(nmol/mg pro)
MT
(ng/mg pro)
Control
, 百拇医药 2.454±0.430
109.19±14.18
Mycardial infarction
24 h
5.346±0.650**
141.92±21.25**
8 weeks
3.530±0.990
173.80±17.61**
Ischemia-reperfusion
, 百拇医药
24 h
13.909±1.440**
160.51±16.16**
8 weeks
4.162±0.520*
314.09±23.18**
* P<0.05,**P<0.01 vs control
讨论
结果表明：大鼠急性心肌梗塞和缺血再灌注后心肌细胞均产生大量氧自由基，特别是缺血再灌注后，活化的中性粒细胞大量聚集在缺血区，加速了自由基的生成，后者刺激生物膜中的不饱和脂肪酸启动自由基链式反应产生脂质过氧化，所以脂质过氧化含量间接反映了自由基损伤的程度，脂质过氧化造成膜结构与功能障碍，导致细胞损伤[4]，因而在最初的24 h MDA含量均显著增高。
, 百拇医药
MT作为一种小分子可诱导蛋白，广泛分布于哺乳动物的各种器官中，MT分子中有20个半胱氨酸残基，具有清除自由基和脂质过氧化的功能，是重要的内源性抗损伤物质，在多种应激及病理情况下均有MT的升高，因而MT可能参与心肌损伤的修复过程。Kang[5]采用转基因小鼠研究证明高表达MT的小鼠缺血再灌注后心肌损伤程度明显小于非转基因鼠。本实验也发现心肌梗塞和缺血再灌注24 h后心肌MT含量明显升高，考虑这可能是应激状态下的一种代偿反应。在手术后8周，MT持续升高，可发挥清除自由基及脂质过氧化的功能，特别是在急性期脂质过氧化严重升高的缺血再灌注组，心肌MT的含量显著高于24 h组和心肌梗塞组，同时恢复期脂质过氧化又显著降低，推测MT对心肌缺血和缺血再灌注所至的脂质过氧化有清除作用，并参与心肌细胞损伤的修复，在心肌修复中起着持续的抗氧化作用，这可能与MT富含巯基的结构有关。至于MT是否还具有其他的保护作用机制有待进一步研究。
参考文献
1 朱赓伯.金属硫蛋白的生物学特性及生理作用.生命的化学， 1995，15(1)：23.
, http://www.100md.com
2 Satoshi Y, Shozo K, Moritani H, et al. Reperfusion hastens appearance and extent of distribution of type 1 collagen in infart sone. Cardiovasc Res, 1995,307:763.
3 金慧英，魏尧梅，胡惠民，等.镉-金属硫蛋白的抗体制备及酶联免疫吸附法测定.中国公共卫生，1998，14(2)：103.
4 Zweior JL. Measurement of superoxide derived free radicals in the reperfused heart. Evidence for a free radical mechanism of reperfusion injury. J Biol Chem, 1988,263:1353.
5 Kang YJ, Chen Y, Yu A, et al. Overexpression of metallothionein in the heart of transgenic mice suppresses doxonibicin cardiotoxicity. J Clin Invest, 1997,15:1501.
(1998年9月2日收稿，1999年1月1日修回), http://www.100md.com