细胞色素p450对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响*
作者：张立克 王 雯 陈瑞芬 王 民 丁鼎武
单位：
张立克 王 雯 丁鼎武 首都医科大学病理生理学教研室 (北京100054)；陈瑞芬 首都医科大学病理解剖学教研室；王 民 首都医科大学中心实验室
关键词：细胞色素P450；心肌；局部缺血；再灌注损伤
中国病理生理杂志990612 摘 要 目的：通过观察细胞色素p450抑制剂对大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤的影响，了解细胞色素p450与心肌缺血/再灌注损伤的关系，并初步分析作用机制。方法：观察给予细胞色素p450抑制剂或11， 12-EET后，大鼠在体心肌缺血/再灌注室性心律失常、心肌梗塞范围及超微结构的变化，及TEA与glibenclamide对EETs作用的影响。结果：细胞色素p450抑制剂clotrimazole(0.9 mmol/L)和SKF525A(0.54 mmol/L)减轻、而外源性11， 12-EET加重缺血/再灌注心律失常、心肌梗塞范围及心肌超微结构病变；TEA与glibenclamide可拮抗11,12-EET的作用。结论：细胞色素p450参与了心肌缺血/再灌注损伤；其作用与EETs释放并开通钙敏感性及ATP敏感性钾通道有关。
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Effects of cytochrome p450 on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats
ZHANG Li-Ke, WANG Wen, CHEN Rui-Fen, WANG Min, DING Ding-Wu
Department of Pathophysiology, Capital University of Medical Science, Beijing(100054)
Abstracts AIM: To study the effects of cytochrome p450 on myocardial ischemia/reperfusion injury and the mechanisms. METHODS: Observing the changes of ischemia/reperfusion arrhythmias , myocardial ultrastructure injury and myocardial infarct size after cytochrome p450 inhibitors or 11, 12,-EET(epoxyeicosatrienoic acids) and the influence of TEA (tetrae thylammonium) and glibenclamide on them. RESULTS: The cytochrome p450 inhibitors clotrimazole (0.9 mmol/L) and SKF525a (0.54 mmol/L)decreased but 11,12-EET increased the ischemia/reperfusion arrhythmia, myocardium infarct size and ultrastructure injury; the effect of 11,12-EET could be reduced by TEA and glibenclamide. CONCLUSION：Cytochrome p450 might relate to myocardial ischemia/reperfusion injury and the action of it may be through releasing EET and opening the KATP and KCa .
, 百拇医药
MeSH Cytochrome P-450； EETs； Myocardium; Ischemia; Reperfusion injury
近年来，细胞色素p450单氧化酶及其花生四烯酸代谢产物环-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)对心血管的影响引起了人们的兴趣。有报道在心肌缺血/再灌注时，心肌中细胞色素p450含量及活性均有所提高[1，2]，这对于心肌缺血/再灌注损伤的意义如何尚不清楚；还有人指出，细胞色素p450代谢产物EETs可加重离体心脏再灌注后心功能障碍[3]，但EETs对在体心肌缺血/再灌注损伤有何影响，尤其是对心律失常和心肌结构有何影响，尚未见报道。
本文旨在观察抑制细胞色素p450对大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤的影响，并对其作用机制进行初步分析。
材料与方法
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实验采用健康雄性Wistar大鼠,戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后,人工呼吸下开胸,采用冠状动脉左前降支(left anterior descending ,LAD)结扎和松开的方法复制心肌缺血/再灌注模型。用RM-6200四道生理记录仪(日本元件，国内组装)连接计算机记录II导心电。计算室性早博发生次数(ventricular extrasystole, VE)；室性心动过速发生率(ventricular tachycardias rate, VTr)及累计持续时间(ventricular tachycardias time, VTt)；室颤发生率(ventricular fibrillation rate, VFr)及累计持续时间(ventricular fibrillation time, VFt)；心电不稳持续时间(lasting time, LT)；并参照Cutis[4]和Ravingerova[5]等方法制定下述标准对室性心律失常(ventricular arrhythmias,VA)评分。0分：无VA或有<5次的VE； 1分：仅有≥5次VE； 2分：仅有一阵<60 s 的VT； 3分：有一阵≥60 s或多阵累计<60 s的VT； 4分：多阵VT，累计>60 s； 5分：出现VF； 6分：出现持续5 min以上的VF或在观察期间死亡。鉴于大鼠心肌缺血性心律失常分为2期[6]，采用缺血10 min和缺血60 min 2种模型观察缺血性心律失常；而再灌心律失常受缺血时间的影响，故主要观察发生率最高的缺血10min再灌注心律失常。
, 百拇医药
实验完毕，结扎LAD，自左心室注入饱和曲利本兰，显示缺血范围；缺血1 h再灌30 min动物取下心脏后，采用TTC染色显示梗塞范围。采用图象分析系统(Q550-IW型，德国产品)计算左心室面积(left ventricular zone, LV)，缺血濒危区(risk zone, RZ)及梗塞区面积(infarct zone, IZ)。以缺血范围%(RZ/LZ)和梗塞范围%(IZ/RZ)表示之。缺血10min再灌10 min动物各组1只，电镜取材，制片，观察心肌超微结构变化。实验分为6组，均于冠脉结扎前20 min静脉给予同容积(1 mL/100 g体重)物质。其中对照组(control)给予生理盐水；细胞色素p450单氧化酶抑制SKF525a(SKF)组给予0.54 mmol/L SKF525a、clotrimazole(CLO)组给予0.9 mmol/L clotrimazole；外源性EETs组(EET)给予0.2 μg/100 g 11, 12-EET; EETs加钙敏感性钾通道阻滞剂组(EET-TEA)，给予同量的11,12-EET及30 mmol/100 g四乙胺(tetraethylammonium, TEA)；而 EETs加ATP敏感性钾通道阻滞剂组(EET-GLI)，则给予同量的11,12-EET及0.25 mmol/100 g glibenclamide(GLI)。各组又分为A组(缺血10 min，再灌10 min)和B组(缺血1 h，再灌30 min)。
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数据以
表示。各组间记量资料的比较采用单因素方差分析，差异显著性用Student-Newman-Keuls法进行两两比较。各组间计数资料的比较采用χ2检验。
结果
(一)各组间大鼠的心肌缺血范围均无显著差异(P>0.05)。
(二)各有关物质对缺血性心律失常的影响见表1和表2。各组大鼠缺血期(包括缺血10 min和缺血60 min)心律失常的首发时间结果见图1。对再灌注心律失常的影响见表3。缺血/再灌注后心肌梗塞范围的变化见图2。
表1 缺血10 min心律失常指标变化
Tab 1 The arrhythmia in 10 min occlusion of LAD(n=10，) Group
, http://www.100md.com
VTr
VTt (s)
VFr
VFt (s)
LT (min)
VA score
Control
90%
39.5±39.0
10%
0.1±0.3
2.40±1.12
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3.0±1.2
EET
90%
29.6±27.0
50%
48.0±66.6*
7.6±2.5**
3.7±1.5
EET-TEA
30%#
8.9±15.8
0#
, 百拇医药
0#
2.1±2.2##
1.4±1.2#
EET-GLI
70%
11.5±18.3
0#
0#
1.1±1.2##
1.9±1.2#
SKF
, http://www.100md.com
50%
7.6±18.6*
0
0
1.3±0.9*
1.7±1.2*
CLO
20%**
0.7±1.5*
0
0
1.2±0.9*
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1.0±0.6**
*P<0.05, ** P<0.01,vs control group; #P<0.05, ## P<0.01, vs EET group
表2 缺血60 min心律失常指标变化
Tab 2 The arrhythmia in 60 min occlusion of LAD (n =10，) Group
VTr
VTt (s)
VFr
VFt (s)
, 百拇医药
LT (min)
VA score
Control
100%
36.6±28.1
10%
0.5±1.5
11.8±6.3
3.1±0.6
EET
100%
91.1±74.7*
, 百拇医药
40%
79.5±143.0
24.3±11.0**
4.3±0.6**
EET-TEA
100%
15.8±11.0#
10%
1.2±3.7
18.0±6.9
3.0±0.6##
, 百拇医药
EET-GLI
80%
19.7±22.7#
0#
0
15.0±7.2#
2.7±0.9##
SKF
60%*
31.6±37.9
0
, 百拇医药
0
12.3±8.8
2.2±1.2
CLO
80%
13.5±17.6*
0
0
7.7±5
2.2±0.9*
*P<0.05, ** P<0.01, vs control group；# P<0.05, ## P<0.01, vs EET group
, 百拇医药
表3 再灌10 min心律失常指标变化
Tab 3 The arrhythmia in 10 min reperfusion of LAD (n =10，) Group
VTr
VTt (s)
VFr
VFt (s)
IVF
LT (min)
VA score
Control
, http://www.100md.com
100%
152.0±176.0
80%
51.1±103.0
40%
4.90±3.16
5.2±0.6
EET
90%
137.3±101.0
100%
203.4±185.0*
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60%
9.8±0.6**
5.6±0.6
EET-TEA
100%
69.7±51.1
30%##
6.8±17.38##
0##
6.8±2.5##
3.9±0.9##
, 百拇医药
EET-GLI
100%
88.6±65.4
60%#
14.6±31.1#
0##
7.1±2.2##
4.5±0.6##
SKF
70%
29.7±33.8
, 百拇医药
0**
0
0*
3.1± 2.5
2.4±1.2**
CLO
90%
39.2±29.0
0**
0
0*
3.3±2.8
, 百拇医药
2.7±0.9**
*P<0.05,** P<0.01, vs control group；# P<0.05,## P<0.01, vs EET group
Fig 1 The comparison about the beginning time of arrhythmia
(, n=10, **P<0.01, vs control group,##P<0.01, vs EET group)
图1 心律失常首发时间的比较
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Fig 2 The comparison about myocardium infarct size
(,n=10,*P<0.05, vs control group; ##P<0.01, vs EET group)
图2 心律梗塞范围的比较
在透射电镜下看到，对照组心肌肌原纤维排列紊乱，有断裂，明带增宽；线粒体明显肿胀，空泡变性较明显；出现心肌细胞核染色质边集。EET组心肌超微结构的损伤较对照组严重。线粒体明显肿胀，部分嵴消失，线粒体膜破裂，大量空泡形成；心肌细胞核染色质边集明显；核及线粒体周围出现积液性间隙。SKF组、CLO组、EET-TEA及EET-GLI组心肌超微结构的变化较轻。肌原纤维排列较整齐，无断裂；线粒体肿胀较轻，未见明显空泡变性；细胞核染色质边集不明显。
, 百拇医药
讨论
影响心肌缺血/再灌注损伤的因素很多。文献报道[4，5]，心肌缺血范围的大小与缺血/再灌注室性心律失常的严重程度密切相关。本实验中分别测定了每组大鼠的心肌缺血范围，各组间均无显著差异，这就排除了缺血范围对室性心律失常的影响。
本实验结果可以看到，给予细胞色素p450抑制剂后，缺血/再灌注各时程的心律失常与对照组相比，均有不同程度的减轻；全部缺血期的VA首发时间明显延长。指出细胞色素p450抑制剂可减轻缺血/再灌注心律失常。给予细胞色素p450抑制剂后，心肌梗塞范围明显缩小，心肌超微结构的病变程度也较对照组有所减轻，表明细胞色素p450抑制剂可减少缺血/再灌注后坏死心肌数目，降低心肌细胞损伤程度。上述结果证实细胞色素p450抑制剂具有保护心肌的作用，提示内源性细胞色素p450或其代谢产物可能参与了心肌缺血/再灌注损伤。
EETs是花生四烯酸细胞色素p450单氧化酶特异性代谢产物[1]。许多学者证实，EETs可舒张包括冠状动脉在内的众多血管床。其作用机制与其开放血管平滑肌细胞钾通道，使平滑肌细胞超极化有关。故EETs被认为是一类内皮衍生性超极化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor, EDHF)[7～9]。Rosolowsky等[2]发现, 冠脉狭窄时花生四烯酸细胞色素p450单氧化酶途径的产物EETs的含量明显增加。Bend等[1]提出, 再灌注时细胞色素p450对花生四烯酸代谢的能力明显增强, 可能有大量的单氧化酶产物如EETs生成。鉴于EETs可加重离体心脏再灌注后心功能障碍[3]，细胞色素p450是否通过释放EETs而影响心肌缺血/再灌注后心律失常和心肌结构损伤，值得探讨。
, 百拇医药
本实验给予11， 12-EET后，缺血及再灌注各时程的心律失常均较对照组严重，心肌梗塞范围提高了7.30%(P<0.05)，心肌超微结构病变也较重，表明外源性11， 12-EET加重缺血/再灌注心律失常及心肌结构损伤程度。这也提示内源性EETs可能参与了细胞色素450所致的心肌缺血/再灌注损伤。
目前对于EETs在心肌缺血/再灌注中的作用机制尚不清楚。但有不少资料表明EETs作为内皮衍生性超极化因子，通过激活细胞膜K+通道而发挥作用[7～9]。但究竟是何种K+通道尚有争议。为探讨11， 12-EET加重心肌缺血/再灌注损伤的作用机制中是否有K+通道参与，我们分别观察了11， 12-EET加用钙敏感性钾通道(Ca2+-sensitive potassium channel,KCa)阻滞剂TEA和ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel ,KATP)阻滞剂glibenclamide后上述各项指标的变化。结果发现，与EET组相比，EET-TEA组大鼠缺血/再灌注各时程的心律失常均有所减轻；心肌梗塞范围明显缩小；心肌超微结构的病变减轻。表明KCa阻滞剂TEA可减轻11， 12-EET对心肌缺血/再灌注的损伤作用，提示11， 12-EET的作用与其激活KCa有关。EET-GLI组的各项指标与EET组相比也均有所减轻。这也提示11， 12-EET加重心肌缺血/再灌注损伤的作用也与其激活KATP有关。
, 百拇医药
11， 12-EET激活K+通道后为何会加重心肌缺血/再灌注损伤？11， 12-EET具体作用在何部位？KCa和KATP开放后通过何种细胞内信号传递系统而起作用？这些问题均值得进一步探讨。
* 北京市自然科学基金资助
参考文献
1 Bend JR, Karmazyn M. Role of eicosanoids in the ischemic and reperfused myocardium. EXS, 1996, 76：243.
2 Rosolowsky M, Falck JR, Willerson JT, et al. Synthesis of lipoxygenase and epoxygenase products of arachidonic acid by normal and stenosed canine coronary arteries. Circ Res, 1990，66：608.
, 百拇医药
3 Moffat MP, Ward CA, Bend JR,et al. Effects of epoxyeicosatrienoic acids on isolated hearts and ventricular myocytes. Am J Physiol, 1993, 264:H1154.
4 Curtis MJ, MacLeod BA, Walker MJA. Model for the study of arrhythmias in myocardial ischemia and infarction: the use of the rat. J Mol Cell Cardiol, 1987,19:399.
5 Ravinggerova T , Tribulova N,Slezak J, et al . Brief intermediate and prolonged ischemia in the isolated crystalloid perfused rat heart: relationship between susceptibility to arrhythmias and degree of ultrastructural injury. J Mol Cell Cardiol, 1995，27:1937.
, 百拇医药
6 Harris AS. Excitatory factors in ventricular tachycardia resulting from myocardial ischemia. Science, 1954， 119:200.
7 Campbell WB, Gebremedhin D, Pratt PF, et al. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium- derived hyperpolarizing factors. Circ Res, 1996，78(3):415.
8 Hu S, Kim H. Activation of K+ channel in vascular smooth muscles by cytochrome p450 metabolites of arachidonic acid . Eur J Pharmacol, 1993，230：215.
9 Hecker M, Bara AT, Bauersachs J, et al. Characterization of endothelium-derived hyperpolarizing factor as a cytochrome p450-derived arachidonic acid metabolite in mammals. J Physiol, 1994，481(2)：407.
(1998年9月7日收稿，1998年12月30日修回), 百拇医药
单位：
张立克 王 雯 丁鼎武 首都医科大学病理生理学教研室 (北京100054)；陈瑞芬 首都医科大学病理解剖学教研室；王 民 首都医科大学中心实验室
关键词：细胞色素P450；心肌；局部缺血；再灌注损伤
中国病理生理杂志990612 摘 要 目的：通过观察细胞色素p450抑制剂对大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤的影响，了解细胞色素p450与心肌缺血/再灌注损伤的关系，并初步分析作用机制。方法：观察给予细胞色素p450抑制剂或11， 12-EET后，大鼠在体心肌缺血/再灌注室性心律失常、心肌梗塞范围及超微结构的变化，及TEA与glibenclamide对EETs作用的影响。结果：细胞色素p450抑制剂clotrimazole(0.9 mmol/L)和SKF525A(0.54 mmol/L)减轻、而外源性11， 12-EET加重缺血/再灌注心律失常、心肌梗塞范围及心肌超微结构病变；TEA与glibenclamide可拮抗11,12-EET的作用。结论：细胞色素p450参与了心肌缺血/再灌注损伤；其作用与EETs释放并开通钙敏感性及ATP敏感性钾通道有关。
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Effects of cytochrome p450 on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats
ZHANG Li-Ke, WANG Wen, CHEN Rui-Fen, WANG Min, DING Ding-Wu
Department of Pathophysiology, Capital University of Medical Science, Beijing(100054)
Abstracts AIM: To study the effects of cytochrome p450 on myocardial ischemia/reperfusion injury and the mechanisms. METHODS: Observing the changes of ischemia/reperfusion arrhythmias , myocardial ultrastructure injury and myocardial infarct size after cytochrome p450 inhibitors or 11, 12,-EET(epoxyeicosatrienoic acids) and the influence of TEA (tetrae thylammonium) and glibenclamide on them. RESULTS: The cytochrome p450 inhibitors clotrimazole (0.9 mmol/L) and SKF525a (0.54 mmol/L)decreased but 11,12-EET increased the ischemia/reperfusion arrhythmia, myocardium infarct size and ultrastructure injury; the effect of 11,12-EET could be reduced by TEA and glibenclamide. CONCLUSION：Cytochrome p450 might relate to myocardial ischemia/reperfusion injury and the action of it may be through releasing EET and opening the KATP and KCa .
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MeSH Cytochrome P-450； EETs； Myocardium; Ischemia; Reperfusion injury
近年来，细胞色素p450单氧化酶及其花生四烯酸代谢产物环-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)对心血管的影响引起了人们的兴趣。有报道在心肌缺血/再灌注时，心肌中细胞色素p450含量及活性均有所提高[1，2]，这对于心肌缺血/再灌注损伤的意义如何尚不清楚；还有人指出，细胞色素p450代谢产物EETs可加重离体心脏再灌注后心功能障碍[3]，但EETs对在体心肌缺血/再灌注损伤有何影响，尤其是对心律失常和心肌结构有何影响，尚未见报道。
本文旨在观察抑制细胞色素p450对大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤的影响，并对其作用机制进行初步分析。
材料与方法
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实验采用健康雄性Wistar大鼠,戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后,人工呼吸下开胸,采用冠状动脉左前降支(left anterior descending ,LAD)结扎和松开的方法复制心肌缺血/再灌注模型。用RM-6200四道生理记录仪(日本元件，国内组装)连接计算机记录II导心电。计算室性早博发生次数(ventricular extrasystole, VE)；室性心动过速发生率(ventricular tachycardias rate, VTr)及累计持续时间(ventricular tachycardias time, VTt)；室颤发生率(ventricular fibrillation rate, VFr)及累计持续时间(ventricular fibrillation time, VFt)；心电不稳持续时间(lasting time, LT)；并参照Cutis[4]和Ravingerova[5]等方法制定下述标准对室性心律失常(ventricular arrhythmias,VA)评分。0分：无VA或有<5次的VE； 1分：仅有≥5次VE； 2分：仅有一阵<60 s 的VT； 3分：有一阵≥60 s或多阵累计<60 s的VT； 4分：多阵VT，累计>60 s； 5分：出现VF； 6分：出现持续5 min以上的VF或在观察期间死亡。鉴于大鼠心肌缺血性心律失常分为2期[6]，采用缺血10 min和缺血60 min 2种模型观察缺血性心律失常；而再灌心律失常受缺血时间的影响，故主要观察发生率最高的缺血10min再灌注心律失常。
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实验完毕，结扎LAD，自左心室注入饱和曲利本兰，显示缺血范围；缺血1 h再灌30 min动物取下心脏后，采用TTC染色显示梗塞范围。采用图象分析系统(Q550-IW型，德国产品)计算左心室面积(left ventricular zone, LV)，缺血濒危区(risk zone, RZ)及梗塞区面积(infarct zone, IZ)。以缺血范围%(RZ/LZ)和梗塞范围%(IZ/RZ)表示之。缺血10min再灌10 min动物各组1只，电镜取材，制片，观察心肌超微结构变化。实验分为6组，均于冠脉结扎前20 min静脉给予同容积(1 mL/100 g体重)物质。其中对照组(control)给予生理盐水；细胞色素p450单氧化酶抑制SKF525a(SKF)组给予0.54 mmol/L SKF525a、clotrimazole(CLO)组给予0.9 mmol/L clotrimazole；外源性EETs组(EET)给予0.2 μg/100 g 11, 12-EET; EETs加钙敏感性钾通道阻滞剂组(EET-TEA)，给予同量的11,12-EET及30 mmol/100 g四乙胺(tetraethylammonium, TEA)；而 EETs加ATP敏感性钾通道阻滞剂组(EET-GLI)，则给予同量的11,12-EET及0.25 mmol/100 g glibenclamide(GLI)。各组又分为A组(缺血10 min，再灌10 min)和B组(缺血1 h，再灌30 min)。
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数据以
表示。各组间记量资料的比较采用单因素方差分析，差异显著性用Student-Newman-Keuls法进行两两比较。各组间计数资料的比较采用χ2检验。结果
(一)各组间大鼠的心肌缺血范围均无显著差异(P>0.05)。
(二)各有关物质对缺血性心律失常的影响见表1和表2。各组大鼠缺血期(包括缺血10 min和缺血60 min)心律失常的首发时间结果见图1。对再灌注心律失常的影响见表3。缺血/再灌注后心肌梗塞范围的变化见图2。
表1 缺血10 min心律失常指标变化
Tab 1 The arrhythmia in 10 min occlusion of LAD(n=10，
) Group, http://www.100md.com
VTr
VTt (s)
VFr
VFt (s)
LT (min)
VA score
Control
90%
39.5±39.0
10%
0.1±0.3
2.40±1.12
, http://www.100md.com
3.0±1.2
EET
90%
29.6±27.0
50%
48.0±66.6*
7.6±2.5**
3.7±1.5
EET-TEA
30%#
8.9±15.8
0#
, 百拇医药
0#
2.1±2.2##
1.4±1.2#
EET-GLI
70%
11.5±18.3
0#
0#
1.1±1.2##
1.9±1.2#
SKF
, http://www.100md.com
50%
7.6±18.6*
0
0
1.3±0.9*
1.7±1.2*
CLO
20%**
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0
0
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, http://www.100md.com
1.0±0.6**
*P<0.05, ** P<0.01,vs control group; #P<0.05, ## P<0.01, vs EET group
表2 缺血60 min心律失常指标变化
Tab 2 The arrhythmia in 60 min occlusion of LAD (n =10，
) GroupVTr
VTt (s)
VFr
VFt (s)
, 百拇医药
LT (min)
VA score
Control
100%
36.6±28.1
10%
0.5±1.5
11.8±6.3
3.1±0.6
EET
100%
91.1±74.7*
, 百拇医药
40%
79.5±143.0
24.3±11.0**
4.3±0.6**
EET-TEA
100%
15.8±11.0#
10%
1.2±3.7
18.0±6.9
3.0±0.6##
, 百拇医药
EET-GLI
80%
19.7±22.7#
0#
0
15.0±7.2#
2.7±0.9##
SKF
60%*
31.6±37.9
0
, 百拇医药
0
12.3±8.8
2.2±1.2
CLO
80%
13.5±17.6*
0
0
7.7±5
2.2±0.9*
*P<0.05, ** P<0.01, vs control group；# P<0.05, ## P<0.01, vs EET group
, 百拇医药
表3 再灌10 min心律失常指标变化
Tab 3 The arrhythmia in 10 min reperfusion of LAD (n =10，
) GroupVTr
VTt (s)
VFr
VFt (s)
IVF
LT (min)
VA score
Control
, http://www.100md.com
100%
152.0±176.0
80%
51.1±103.0
40%
4.90±3.16
5.2±0.6
EET
90%
137.3±101.0
100%
203.4±185.0*
, http://www.100md.com
60%
9.8±0.6**
5.6±0.6
EET-TEA
100%
69.7±51.1
30%##
6.8±17.38##
0##
6.8±2.5##
3.9±0.9##
, 百拇医药
EET-GLI
100%
88.6±65.4
60%#
14.6±31.1#
0##
7.1±2.2##
4.5±0.6##
SKF
70%
29.7±33.8
, 百拇医药
0**
0
0*
3.1± 2.5
2.4±1.2**
CLO
90%
39.2±29.0
0**
0
0*
3.3±2.8
, 百拇医药
2.7±0.9**
*P<0.05,** P<0.01, vs control group；# P<0.05,## P<0.01, vs EET group
Fig 1 The comparison about the beginning time of arrhythmia
(
, n=10, **P<0.01, vs control group,##P<0.01, vs EET group)图1 心律失常首发时间的比较
, http://www.100md.com
Fig 2 The comparison about myocardium infarct size
(
,n=10,*P<0.05, vs control group; ##P<0.01, vs EET group)图2 心律梗塞范围的比较
在透射电镜下看到，对照组心肌肌原纤维排列紊乱，有断裂，明带增宽；线粒体明显肿胀，空泡变性较明显；出现心肌细胞核染色质边集。EET组心肌超微结构的损伤较对照组严重。线粒体明显肿胀，部分嵴消失，线粒体膜破裂，大量空泡形成；心肌细胞核染色质边集明显；核及线粒体周围出现积液性间隙。SKF组、CLO组、EET-TEA及EET-GLI组心肌超微结构的变化较轻。肌原纤维排列较整齐，无断裂；线粒体肿胀较轻，未见明显空泡变性；细胞核染色质边集不明显。
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讨论
影响心肌缺血/再灌注损伤的因素很多。文献报道[4，5]，心肌缺血范围的大小与缺血/再灌注室性心律失常的严重程度密切相关。本实验中分别测定了每组大鼠的心肌缺血范围，各组间均无显著差异，这就排除了缺血范围对室性心律失常的影响。
本实验结果可以看到，给予细胞色素p450抑制剂后，缺血/再灌注各时程的心律失常与对照组相比，均有不同程度的减轻；全部缺血期的VA首发时间明显延长。指出细胞色素p450抑制剂可减轻缺血/再灌注心律失常。给予细胞色素p450抑制剂后，心肌梗塞范围明显缩小，心肌超微结构的病变程度也较对照组有所减轻，表明细胞色素p450抑制剂可减少缺血/再灌注后坏死心肌数目，降低心肌细胞损伤程度。上述结果证实细胞色素p450抑制剂具有保护心肌的作用，提示内源性细胞色素p450或其代谢产物可能参与了心肌缺血/再灌注损伤。
EETs是花生四烯酸细胞色素p450单氧化酶特异性代谢产物[1]。许多学者证实，EETs可舒张包括冠状动脉在内的众多血管床。其作用机制与其开放血管平滑肌细胞钾通道，使平滑肌细胞超极化有关。故EETs被认为是一类内皮衍生性超极化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor, EDHF)[7～9]。Rosolowsky等[2]发现, 冠脉狭窄时花生四烯酸细胞色素p450单氧化酶途径的产物EETs的含量明显增加。Bend等[1]提出, 再灌注时细胞色素p450对花生四烯酸代谢的能力明显增强, 可能有大量的单氧化酶产物如EETs生成。鉴于EETs可加重离体心脏再灌注后心功能障碍[3]，细胞色素p450是否通过释放EETs而影响心肌缺血/再灌注后心律失常和心肌结构损伤，值得探讨。
, 百拇医药
本实验给予11， 12-EET后，缺血及再灌注各时程的心律失常均较对照组严重，心肌梗塞范围提高了7.30%(P<0.05)，心肌超微结构病变也较重，表明外源性11， 12-EET加重缺血/再灌注心律失常及心肌结构损伤程度。这也提示内源性EETs可能参与了细胞色素450所致的心肌缺血/再灌注损伤。
目前对于EETs在心肌缺血/再灌注中的作用机制尚不清楚。但有不少资料表明EETs作为内皮衍生性超极化因子，通过激活细胞膜K+通道而发挥作用[7～9]。但究竟是何种K+通道尚有争议。为探讨11， 12-EET加重心肌缺血/再灌注损伤的作用机制中是否有K+通道参与，我们分别观察了11， 12-EET加用钙敏感性钾通道(Ca2+-sensitive potassium channel,KCa)阻滞剂TEA和ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel ,KATP)阻滞剂glibenclamide后上述各项指标的变化。结果发现，与EET组相比，EET-TEA组大鼠缺血/再灌注各时程的心律失常均有所减轻；心肌梗塞范围明显缩小；心肌超微结构的病变减轻。表明KCa阻滞剂TEA可减轻11， 12-EET对心肌缺血/再灌注的损伤作用，提示11， 12-EET的作用与其激活KCa有关。EET-GLI组的各项指标与EET组相比也均有所减轻。这也提示11， 12-EET加重心肌缺血/再灌注损伤的作用也与其激活KATP有关。
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11， 12-EET激活K+通道后为何会加重心肌缺血/再灌注损伤？11， 12-EET具体作用在何部位？KCa和KATP开放后通过何种细胞内信号传递系统而起作用？这些问题均值得进一步探讨。
* 北京市自然科学基金资助
参考文献
1 Bend JR, Karmazyn M. Role of eicosanoids in the ischemic and reperfused myocardium. EXS, 1996, 76：243.
2 Rosolowsky M, Falck JR, Willerson JT, et al. Synthesis of lipoxygenase and epoxygenase products of arachidonic acid by normal and stenosed canine coronary arteries. Circ Res, 1990，66：608.
, 百拇医药
3 Moffat MP, Ward CA, Bend JR,et al. Effects of epoxyeicosatrienoic acids on isolated hearts and ventricular myocytes. Am J Physiol, 1993, 264:H1154.
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7 Campbell WB, Gebremedhin D, Pratt PF, et al. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium- derived hyperpolarizing factors. Circ Res, 1996，78(3):415.
8 Hu S, Kim H. Activation of K+ channel in vascular smooth muscles by cytochrome p450 metabolites of arachidonic acid . Eur J Pharmacol, 1993，230：215.
9 Hecker M, Bara AT, Bauersachs J, et al. Characterization of endothelium-derived hyperpolarizing factor as a cytochrome p450-derived arachidonic acid metabolite in mammals. J Physiol, 1994，481(2)：407.
(1998年9月7日收稿，1998年12月30日修回), 百拇医药