玉米花粉多糖对大鼠肺泡巨噬细胞的激活作用*
作者：吕建新 金丽琴 陈国荣 袁 谦 杨开颜 谢克俭 王开发 张玉兰
单位：
吕建新 袁 谦 谢克俭 温州医学院检验医学系(温州 325027)；金丽琴 基础部生化教研室； 陈国荣 杨开颜 基础部病理教研室；王开发 张玉兰 同济大学花粉应用研究中心
关键词：多糖类；巨噬细胞；肺泡；大鼠
玉米花粉多糖对大鼠肺泡巨噬细胞的激活作用 摘 要 目的：探讨玉米花粉多糖对肺泡巨噬细胞的激活作用。方法：用250、500、1000 μg/mL的玉米花粉多糖体外诱导培养大鼠肺泡巨噬细胞72 h，用全自动生化分析仪测定肺泡巨噬细胞内乳酸脱氢酶与酸性磷酸酶活性，用放射免疫分析法测定肺泡巨噬细胞内肿瘤坏死因子的含量。结果：3种浓度的玉米花粉多糖均能非常显著地提高体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞内乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶的活性，并能非常显著地诱导肺泡巨噬细胞表达肿瘤坏死子因子。结论：玉米花粉多糖对肺泡巨噬细胞具有激活作用。
, 百拇医药
The activative effect of maize pollen polysaccharides
on alveolar macrophages of rats
LU Jian-Xin, JIN Li-Qin, CHEN Guo-Rong, YUAN Qian, YANG Kai-Yan
XIE Ke-Jian, WANG Kai-Fa, ZHANG Yu-Lan
Department of Laboratory Medical Science, Wenzhou Medical College, Wenzhou (325027)
Abstract AIM:To study the activative effects of maize pollen polysaccharides on alveolar macrophage (AMΦ).METHODS：The activities of lactate dehydrogenase(LDH) and acid phosphatase (ACP) in the AMΦ of rats were detected by automatic biochemistry analyzer, and the expression level of tumor necrosis factor (TNF) in the AMΦ of rats was analyzed by radioimmunoassay, after the AMΦ of rats were cultured with 250, 500, 1000 μg/mL pollen polysaccharides of maize (PPM)-RPMI 1640 for 72 hours in vitro.RESULTS：Activities of LDH and ACP was increased in AMΦ of rats induced by PPM, and the expression level of TNF in the AMΦ induced by PPM was increased markedly too.CONCLUSION：PPM can activate AMΦ in vitro.
, 百拇医药
MeSH Polysaccharides; Macrophage, alveolar; Rats
多糖对机体的免疫功能具有双向调节作用已得到公认，适当浓度的多糖不仅能提高机体的特异性免疫功能，而且也能增强机体的非特异性免疫功能[1，2]。本文拟研究玉米花粉多糖(pollen polysaccharides of maize，PPM)对大鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages, AMΦ)内乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH， EC 1， 1， 1， 27)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP, EC, 3,1,3,2)活性的调节作用，以及对肺泡巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)的诱导作用，并探讨PPM对肺泡巨噬细胞的激活作用。
材料与方法
一、玉米花粉多糖的制备：
, 百拇医药
玉米花粉用蒸馏水浸泡2 h，胶体磨连续粉碎10 min，煮沸3 h,1 000 r/min离心10 min，收集上清；沉淀重复提取1次，合并两次上清液，用旋转蒸发器浓缩后加入3倍体积95%乙醇，离心取沉淀；沉淀物用热水溶解后按Sevag法脱蛋白，加入3倍体积95%乙醇，静置后离心，取沉淀并用95%乙醇、无水乙醇各洗1次，丙酮、乙醚各洗2次后，挥干即得PPM。
二、实验动物：
正常SD大鼠(由本院实验动物中心提供)，体重250～300 g。
三、PPM细胞培养液的配制：
称取PPM 1.0 g，用含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液80 mL溶解，用5% NaCO3调节pH至7.2后定容至100 mL，0.22 μm微孔滤膜无菌过滤，配成10 mg/mL的PPM RPMI 1640细胞培养液，4℃冰箱保存。实验时再用无菌的RPMI 1640细胞培养液(pH7.2)稀释成250 μg/mL， PPM、 500 μg/mL PPM、 1 000 μg/mL PPM的RPMI 1640细胞培养液。
, 百拇医药
四、大鼠肺泡巨噬细胞的收集与培养：
取正常SD大鼠10只，股动脉放血处死后，常规消毒后于无菌室内用无菌的生理盐水20 mL通过气管插管灌入肺内，轻轻按柔肺部后抽回，重复灌洗1次，合并后于1000 r/min离心10 min收集细胞，用Hanks液洗涤后，用含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液调节成AMΦ浓度为2×106/mL，并以每孔0.5 mL分装在24孔细胞培养板上，在37℃、5%CO2浓度的条件下培养2 h，弃去细胞培养液及非贴壁的细胞，用Hanks液轻洗贴壁的AMΦ后，将AMΦ分成4组，每组8孔，分别加入RPMI 1640、 250 μg/mL PPM-RPMI 1640、 500 μg/mL PPM-RPMI 1640、 1000 μg/mL PPM-RPMI 1640细胞培养液2 mL在37℃、5%CO2条件下培养，并于24 h、 48 h时更换新鲜的培养液，72 h后弃去培养液，并用Hanks液轻洗AMΦ。
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五、肺泡巨噬细胞的破碎：
取上述培养的 AMΦ，每孔加0.2 mL双蒸水，超声清洗机振荡2次，每次2 min，再用-30 ℃、+30 ℃反复冻融5次破碎细胞，制成每毫升为5×106个细胞的破碎AMΦ悬液。
六、AMΦ内LDH活性测定：
采用Wahlefeld方法，以L-乳酸为底物全自动生化分析仪上速率法测定NADH+H+的生成(全自动生化分析仪由日本日立公司制造，型号7170)，反应体系为：温度37℃，破碎的AMΦ悬液18 μL，延迟时间30 s，反应总体积360 μL，每隔15 s测1点，共测34点，以19～24连续6点直线回归求值。酶活力单位采用国际单位(IU)，即每升破碎的AMΦ悬液37℃每分钟使1 μmol乳酸转化为丙酮酸所需的酶量为1IU。
七、AMΦ内ACP活性测定：
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以对硝基苯酚磷酸酯为底物全自动生化分析仪(日立7170)双试剂终点法测定，R1为基质液(对硝基苯酚磷酸酯-柠檬酸buf，pH5.0)，R4为1 mol/L NaOH, λ1 405 nm,λ2 546 nm，反应体系为：破碎的AMΦ悬液10 μL，R1 200 μL, 反应100 min(测定34点)后加R4 100 μL终止反应求值，酶活力单位采用国际单位(IU)，即每升破碎的AMΦ悬液在pH5.0 、37℃、每分钟水解1 μmol对硝基苯酚磷酸酯为对硝基酚所需的酶量为1IU。
八、AMΦ内TNF含量测定：
用放射免疫分析法测定，试剂购自解放军总医院东亚免疫技术研究所，操作按说明书。
九、统计分析：
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数据用
表示，用t检验判定组间的差异显著性。
结果
一、PPM对AMΦ内LDH和ACP活性的影响：
表1所示，大鼠AMΦ经3种不同浓度的PPM 72 h诱导培养后，其细胞内LDH和ACP活性均非常显著地高于对照组(P<0.001)，其中LDH活性具有明显的量效关系，随着PPM浓度的增大AMΦ内LDH活性显著降低。
表1 玉米花粉多糖对大鼠AMΦ酶活性的影响
Tab 1 Effects of PPM on the enzymes activity in the AMΦ
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of rats(,n=8)
Concentration of
PPM(μg/mL)
LDH(IU)
ACP(IU)
0
82.7±22.2
19.5±1.5
250
180.2±28.8*▲
, 百拇医药
25.0±3.3*
500
168.5±28.4*#
23.7±1.4*
1000
139.7±18.5*
26.0±3.5*
*P<0.001, vs 0 μg/mL PPM
#P<0.05, ▲P<0.001, vs 1000 μg/mL PPM
二、PPM对AMΦ TNF的诱导作用：
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表2所示，大鼠AMΦ经3种不同浓度的PPM 72 h诱导培养后，其细胞内TNF水平均高于对照组(PPM浓度由低到高依次为P<0.001, P<0.01, P<0.05)，表明PPM对AMΦ TNF表达具有诱导作用。
表2 玉米花粉多糖对大鼠AMΦ内TNF的诱导作用
Tab 2 Induced expression effects of PPM on the TNF in
the AMΦ of rats(,n=8)
Concentration of PPM(μg/mL)
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TNF(ng/107 cell)
0
0.874±0.176
250
1.566±0.222**
500
1.152±0.148**★
1000
1.130±0.204*★
*P<0.05, **P<0.01, vs 0 μg/mL PPM
, 百拇医药
★P<0.01, vs 250 μg/mL PPM
讨论
玉米花粉系由蜜蜂从玉米花朵雄蕊采集的花粉，已有研究表明，玉米花粉可显著降低细胞内的脂质过氧化物水平，显著提高细胞内的还原型谷胱甘肽含量，显著提高细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性，并能增加心肌耐缺氧、缺血作用，可改善微循环障碍等药理作用[3，4]。玉米花粉对环磷酰胺所致的小鼠脾脏和胸腺萎缩有显著的抑制作用，对细胞免疫和体液免疫也均有显著的增强作用[5,6]。因此，玉米花粉具有良好的开发应用前景。本研究分离纯化了玉米花粉的多糖有效成分，并进一步用PPM诱导体外培养的大鼠AMΦ，研究结果表明，PPM可显著提高AMΦ内LDH和ACP的活性，证明PPM具有免疫调节活性，对巨噬细胞具有激活作用[7～9]。鉴于PPM可增加AMΦ内TNF的表达，因此推测其激活的机制与细胞因子的表达有关，这有待进一步验证。
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* 温州市重大科技攻关项目及上海市自然科学基金资助
参考文献
1 Kumazawa Y, Mizunoe K, Otsuka Y. Immunostimulating polysaccharide separated from hot water extract of Angelica acutiloba Kitagawa. Immunology, 1982, 47:75.
2 Cui JY, Lin ZB. Effects of Tremella polysaccharides on immune function of physically -stressed mice. J Chin Pharm Sci, 1992, 1:49.
3 郭贵文，柳 黄，高 应.玉米花粉对大鼠体内抗氧化能力的影响.营养学报，1993，15(2)：152.
, 百拇医药
4 王洪武，余颂涛，王士雯.玉米花粉对高血脂家兔过氧化脂质及6-酮-PGF1 α/TXB2代谢的影响.中华心血管病杂志，1990，18(6)：370.
5 郑文辉，邱 华，王福华，等.口服玉米花粉对免疫功能的影响.中国免疫学杂志，1987，3(1)：57.
6 张惠云，贾素菊，丁建伟，等.玉米花粉动物试验对外周血象的影响.山东医药，1991，31(2)：25.
7 吕建新，金丽琴，陈国荣，等.细脚拟青霉对大鼠肺泡巨噬细胞的激活作用.免疫学杂志，1997，13(2)：82.
8 Cohn ZA.The activation of mononuclear phagocytes: Fact, fancy, and future. J Immunol, 1978, 121:813.
9 Dong Z, Qi X, Fidler IJ. Tyrosine phosphorylation of mitogen-activated protein kinases is necessary for activation of murine macrophages by natural and synthetic bacterial products. J Exp Med, 1993, 177:1071.
(1998年12月23日收稿，1999年4月16日修回), 百拇医药
单位：
吕建新 袁 谦 谢克俭 温州医学院检验医学系(温州 325027)；金丽琴 基础部生化教研室； 陈国荣 杨开颜 基础部病理教研室；王开发 张玉兰 同济大学花粉应用研究中心
关键词：多糖类；巨噬细胞；肺泡；大鼠
玉米花粉多糖对大鼠肺泡巨噬细胞的激活作用 摘 要 目的：探讨玉米花粉多糖对肺泡巨噬细胞的激活作用。方法：用250、500、1000 μg/mL的玉米花粉多糖体外诱导培养大鼠肺泡巨噬细胞72 h，用全自动生化分析仪测定肺泡巨噬细胞内乳酸脱氢酶与酸性磷酸酶活性，用放射免疫分析法测定肺泡巨噬细胞内肿瘤坏死因子的含量。结果：3种浓度的玉米花粉多糖均能非常显著地提高体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞内乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶的活性，并能非常显著地诱导肺泡巨噬细胞表达肿瘤坏死子因子。结论：玉米花粉多糖对肺泡巨噬细胞具有激活作用。
, 百拇医药
The activative effect of maize pollen polysaccharides
on alveolar macrophages of rats
LU Jian-Xin, JIN Li-Qin, CHEN Guo-Rong, YUAN Qian, YANG Kai-Yan
XIE Ke-Jian, WANG Kai-Fa, ZHANG Yu-Lan
Department of Laboratory Medical Science, Wenzhou Medical College, Wenzhou (325027)
Abstract AIM:To study the activative effects of maize pollen polysaccharides on alveolar macrophage (AMΦ).METHODS：The activities of lactate dehydrogenase(LDH) and acid phosphatase (ACP) in the AMΦ of rats were detected by automatic biochemistry analyzer, and the expression level of tumor necrosis factor (TNF) in the AMΦ of rats was analyzed by radioimmunoassay, after the AMΦ of rats were cultured with 250, 500, 1000 μg/mL pollen polysaccharides of maize (PPM)-RPMI 1640 for 72 hours in vitro.RESULTS：Activities of LDH and ACP was increased in AMΦ of rats induced by PPM, and the expression level of TNF in the AMΦ induced by PPM was increased markedly too.CONCLUSION：PPM can activate AMΦ in vitro.
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MeSH Polysaccharides; Macrophage, alveolar; Rats
多糖对机体的免疫功能具有双向调节作用已得到公认，适当浓度的多糖不仅能提高机体的特异性免疫功能，而且也能增强机体的非特异性免疫功能[1，2]。本文拟研究玉米花粉多糖(pollen polysaccharides of maize，PPM)对大鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages, AMΦ)内乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH， EC 1， 1， 1， 27)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP, EC, 3,1,3,2)活性的调节作用，以及对肺泡巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)的诱导作用，并探讨PPM对肺泡巨噬细胞的激活作用。
材料与方法
一、玉米花粉多糖的制备：
, 百拇医药
玉米花粉用蒸馏水浸泡2 h，胶体磨连续粉碎10 min，煮沸3 h,1 000 r/min离心10 min，收集上清；沉淀重复提取1次，合并两次上清液，用旋转蒸发器浓缩后加入3倍体积95%乙醇，离心取沉淀；沉淀物用热水溶解后按Sevag法脱蛋白，加入3倍体积95%乙醇，静置后离心，取沉淀并用95%乙醇、无水乙醇各洗1次，丙酮、乙醚各洗2次后，挥干即得PPM。
二、实验动物：
正常SD大鼠(由本院实验动物中心提供)，体重250～300 g。
三、PPM细胞培养液的配制：
称取PPM 1.0 g，用含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液80 mL溶解，用5% NaCO3调节pH至7.2后定容至100 mL，0.22 μm微孔滤膜无菌过滤，配成10 mg/mL的PPM RPMI 1640细胞培养液，4℃冰箱保存。实验时再用无菌的RPMI 1640细胞培养液(pH7.2)稀释成250 μg/mL， PPM、 500 μg/mL PPM、 1 000 μg/mL PPM的RPMI 1640细胞培养液。
, 百拇医药
四、大鼠肺泡巨噬细胞的收集与培养：
取正常SD大鼠10只，股动脉放血处死后，常规消毒后于无菌室内用无菌的生理盐水20 mL通过气管插管灌入肺内，轻轻按柔肺部后抽回，重复灌洗1次，合并后于1000 r/min离心10 min收集细胞，用Hanks液洗涤后，用含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液调节成AMΦ浓度为2×106/mL，并以每孔0.5 mL分装在24孔细胞培养板上，在37℃、5%CO2浓度的条件下培养2 h，弃去细胞培养液及非贴壁的细胞，用Hanks液轻洗贴壁的AMΦ后，将AMΦ分成4组，每组8孔，分别加入RPMI 1640、 250 μg/mL PPM-RPMI 1640、 500 μg/mL PPM-RPMI 1640、 1000 μg/mL PPM-RPMI 1640细胞培养液2 mL在37℃、5%CO2条件下培养，并于24 h、 48 h时更换新鲜的培养液，72 h后弃去培养液，并用Hanks液轻洗AMΦ。
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五、肺泡巨噬细胞的破碎：
取上述培养的 AMΦ，每孔加0.2 mL双蒸水，超声清洗机振荡2次，每次2 min，再用-30 ℃、+30 ℃反复冻融5次破碎细胞，制成每毫升为5×106个细胞的破碎AMΦ悬液。
六、AMΦ内LDH活性测定：
采用Wahlefeld方法，以L-乳酸为底物全自动生化分析仪上速率法测定NADH+H+的生成(全自动生化分析仪由日本日立公司制造，型号7170)，反应体系为：温度37℃，破碎的AMΦ悬液18 μL，延迟时间30 s，反应总体积360 μL，每隔15 s测1点，共测34点，以19～24连续6点直线回归求值。酶活力单位采用国际单位(IU)，即每升破碎的AMΦ悬液37℃每分钟使1 μmol乳酸转化为丙酮酸所需的酶量为1IU。
七、AMΦ内ACP活性测定：
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以对硝基苯酚磷酸酯为底物全自动生化分析仪(日立7170)双试剂终点法测定，R1为基质液(对硝基苯酚磷酸酯-柠檬酸buf，pH5.0)，R4为1 mol/L NaOH, λ1 405 nm,λ2 546 nm，反应体系为：破碎的AMΦ悬液10 μL，R1 200 μL, 反应100 min(测定34点)后加R4 100 μL终止反应求值，酶活力单位采用国际单位(IU)，即每升破碎的AMΦ悬液在pH5.0 、37℃、每分钟水解1 μmol对硝基苯酚磷酸酯为对硝基酚所需的酶量为1IU。
八、AMΦ内TNF含量测定：
用放射免疫分析法测定，试剂购自解放军总医院东亚免疫技术研究所，操作按说明书。
九、统计分析：
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数据用
表示，用t检验判定组间的差异显著性。结果
一、PPM对AMΦ内LDH和ACP活性的影响：
表1所示，大鼠AMΦ经3种不同浓度的PPM 72 h诱导培养后，其细胞内LDH和ACP活性均非常显著地高于对照组(P<0.001)，其中LDH活性具有明显的量效关系，随着PPM浓度的增大AMΦ内LDH活性显著降低。
表1 玉米花粉多糖对大鼠AMΦ酶活性的影响
Tab 1 Effects of PPM on the enzymes activity in the AMΦ
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of rats(
,n=8)Concentration of
PPM(μg/mL)
LDH(IU)
ACP(IU)
0
82.7±22.2
19.5±1.5
250
180.2±28.8*▲
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25.0±3.3*
500
168.5±28.4*#
23.7±1.4*
1000
139.7±18.5*
26.0±3.5*
*P<0.001, vs 0 μg/mL PPM
#P<0.05, ▲P<0.001, vs 1000 μg/mL PPM
二、PPM对AMΦ TNF的诱导作用：
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表2所示，大鼠AMΦ经3种不同浓度的PPM 72 h诱导培养后，其细胞内TNF水平均高于对照组(PPM浓度由低到高依次为P<0.001, P<0.01, P<0.05)，表明PPM对AMΦ TNF表达具有诱导作用。
表2 玉米花粉多糖对大鼠AMΦ内TNF的诱导作用
Tab 2 Induced expression effects of PPM on the TNF in
the AMΦ of rats(
,n=8)Concentration of PPM(μg/mL)
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TNF(ng/107 cell)
0
0.874±0.176
250
1.566±0.222**
500
1.152±0.148**★
1000
1.130±0.204*★
*P<0.05, **P<0.01, vs 0 μg/mL PPM
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★P<0.01, vs 250 μg/mL PPM
讨论
玉米花粉系由蜜蜂从玉米花朵雄蕊采集的花粉，已有研究表明，玉米花粉可显著降低细胞内的脂质过氧化物水平，显著提高细胞内的还原型谷胱甘肽含量，显著提高细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性，并能增加心肌耐缺氧、缺血作用，可改善微循环障碍等药理作用[3，4]。玉米花粉对环磷酰胺所致的小鼠脾脏和胸腺萎缩有显著的抑制作用，对细胞免疫和体液免疫也均有显著的增强作用[5,6]。因此，玉米花粉具有良好的开发应用前景。本研究分离纯化了玉米花粉的多糖有效成分，并进一步用PPM诱导体外培养的大鼠AMΦ，研究结果表明，PPM可显著提高AMΦ内LDH和ACP的活性，证明PPM具有免疫调节活性，对巨噬细胞具有激活作用[7～9]。鉴于PPM可增加AMΦ内TNF的表达，因此推测其激活的机制与细胞因子的表达有关，这有待进一步验证。
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参考文献
1 Kumazawa Y, Mizunoe K, Otsuka Y. Immunostimulating polysaccharide separated from hot water extract of Angelica acutiloba Kitagawa. Immunology, 1982, 47:75.
2 Cui JY, Lin ZB. Effects of Tremella polysaccharides on immune function of physically -stressed mice. J Chin Pharm Sci, 1992, 1:49.
3 郭贵文，柳 黄，高 应.玉米花粉对大鼠体内抗氧化能力的影响.营养学报，1993，15(2)：152.
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4 王洪武，余颂涛，王士雯.玉米花粉对高血脂家兔过氧化脂质及6-酮-PGF1 α/TXB2代谢的影响.中华心血管病杂志，1990，18(6)：370.
5 郑文辉，邱 华，王福华，等.口服玉米花粉对免疫功能的影响.中国免疫学杂志，1987，3(1)：57.
6 张惠云，贾素菊，丁建伟，等.玉米花粉动物试验对外周血象的影响.山东医药，1991，31(2)：25.
7 吕建新，金丽琴，陈国荣，等.细脚拟青霉对大鼠肺泡巨噬细胞的激活作用.免疫学杂志，1997，13(2)：82.
8 Cohn ZA.The activation of mononuclear phagocytes: Fact, fancy, and future. J Immunol, 1978, 121:813.
9 Dong Z, Qi X, Fidler IJ. Tyrosine phosphorylation of mitogen-activated protein kinases is necessary for activation of murine macrophages by natural and synthetic bacterial products. J Exp Med, 1993, 177:1071.
(1998年12月23日收稿，1999年4月16日修回), 百拇医药