胎肝提取物对培养中4株肝癌细胞增殖和分化的影响
作者：邹清雁 李茹冰 孔祥平 曾平鲁 杨联萍 陈永振
单位：解放军458医院解放军传染病中心(广州 510602)
关键词：肝细胞瘤；生长抑制物；氧化还原酶类；细胞分化
胎肝提取物对培养中4株肝癌细胞增殖和分化的影响 摘 要 目的：观察4月胎肝提取物对QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721人肝癌细胞和Hep A小鼠肝瘤细胞增殖和分化的影响。方法：从4月胎肝中制备提取物，采用[3H]-TdR掺入法和MTT比色法。 结果：100～500 mg/L的胎肝提取物能明显抑制QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721、Hep A等肝癌细胞的DNA合成和脱氢酶活力。对DNA合成的半数抑制浓度(IC50)分别为346.93、 151.18、 182.37、231.03mg/L；对脱氢酶活力的抑制弱于对DNA合成的抑制，IC50分别为1318.1、1599.2、793.8、813.1mg/L。结论：胎肝提取物能够抑制上述4种细胞增殖和促进分化。
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Effect of embryo hepatic extracts on proliferation and differentiation of 4 lines of hepatoma cells in culture
ZOU Qing-Yan LI Ru-Bin KONG Xiang-Ping ZENG Ping-Lu
YANG Lian-Ping CHEN Yong-Zheng
Infectious Disease Center, No. 458 Hospital of PLA, Guangzhou (510602)
Abstract AIM: The effects of embryo hepatic extracts (EHE) on the proliferation and the differentiation of QGY-7703, BEL-7402, SMMC-7721 human hepatoma cell lines and HepA murine hepatoma cell were investigated. METHODS: EHE was extracted from 4-month human embryo,[ 3 H]-TdR incorporation and MTT colorimetric assays were performed. RESULTS: 100～500 mg/L of the extracts can apparently inhibit the DNA syntheses and the dehydrogenase activities of these cells. The half inhibitory concentration(IC50) of DNA syntheses of QGY-7703, BEL-7402, SMMC-7721, HepA hepatoma cells were 346.93, 151.18, 182.37 and 231.03 mg/L. The inhibitory effect of EHE on the dehydrogenase is smaller than that of these cells on DNA syntheses; the IC50 were 1318.1, 1599.2, 793.8, 813.1mg/L respectively. CONCLUSION: EHE can inhibit the proliferation and promote the differentiation of these hepatoma cells.
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MeSH Hepatoma； Growth inhibitors; Oxidoreductases; Cells differentiation
已有研究表明，从4月胎肝中制备的提取物可以抑制BEL-7402细胞的增殖，形态上能促进BEL-7402细胞的分化[1]。胎肝提取物能否抑制其它肝癌细胞的生长和促进分化一直是我们关注的问题，为此我们选4株不同来源的肝癌细胞，观察胎肝提取物对4株肝癌细胞的影响。
材料和方法
(一) 胎肝提取物的制备，参见文献[1]。
(二) 细胞系来源及培养条件：BEL-7402人肝癌细胞引自香港中文大学解剖与临床病理学系；SMMC-7721、QGY-7703人肝癌细胞系购自中国科学院细胞所； Hep A小鼠肝癌细胞系引自中山医科大学实验动物中心。4种细胞株均接种于F12培养液中，内含10%小牛血清，青链霉素各100 mg/L，37℃，5% CO2培养并传代，传代时用胰酶消化。
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(三) 实验方法：细胞浓度为4.0～8.0×104/mL接种于Costar 3 596的96孔板，0.1 mL/孔。置37℃，5% CO2 24 h后换液，分别加入50～500 mg/L的胎肝提取物，设阴性对照孔。72 h后弃上清，分别做MTT[2]比色和[3 H]-TdR掺入[3]的技术操作。
(四) 数据以
表示,所有数据均行方差分析Dunnett法统计处理和对数直线回归计算半数抑制浓度(IC50)
结果
(一) 对细胞DNA合成的影响:胎肝提取物对4株肝癌细胞均有抑制增殖和促进分化的作用，见表1。
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表1 胎肝提取物对肝癌细胞[3H]-TdR掺入的影响
Tab 1 The effect of embryo hepatic extract on the [3 H]-TdR incorporation of the hepatoma cells(counts.min-1,,n=4)
QGY-7703
BEL-7402
SMMC-7721
HepA
, 百拇医药
EHE(mg/L)
500
205.98±53.78*
290.09±21.65**
81.24±13.49**
139.49±16.51**
250
298.72±9.71
392.91±93.92**
128.70±19.92**
, 百拇医药
228.99±32.00**
100
312.38±25.89
426.34±32.07**
182.61±39.20**
480.99±125.38
50
431.36±116.08
777.90±147.93
315.62±55.20
, 百拇医药 530.23±196.39
Control
472.89±180.69
958.72±242.11
324.09±83.20
544.18±164.08
*P<0.05, **P<0.01,vs control; EHE = embryo hepatic extract
(二)对细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活力的影响:胎肝提取物对四株肝癌细胞线粒体脱氢酶活力均有不同的抑制作用，见表2。
表2 胎肝提取物对肝癌细胞琥珀酸脱氢酶活力的影响
, 百拇医药
Tab 2 The effect of embryo hepatic extract on the dehydrogenase activities of the hepatoma cells(OD,,n=4)
QGY-7703
BEL-7402
SMMC-7721
HepA
EHE(mg/L)
500
0.056±0.003**
, 百拇医药
0.084±0.004**
0.050±0.002**
0.053±0.002**
250
0.075±0.005
0.092±0.007**
0.069±0.005*
0.071±0.005**
100
0.080±0.006
, 百拇医药
0.095±0.012**
0.076±0.009
0.090±0.012
50
0.092±0.019
0.115±0.006
0.088±0.011
0.093±0.008
Control
0.086±0.009
0.128±0.016
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0.090±0.011
0.091±0.005
*P<0.05， ** P<0.01,vs control
讨论
恶性肿瘤在形态、功能和代谢等方面类似未分化的胚胎细胞。胚胎细胞是受精卵增殖分化而来，其间必然产生许多与胚胎细胞分化有关的活性物质。我们先前的研究发现，胎肝提取物可以明显地抑制BEL-7402肝癌细胞的生长，形态上出现与二甲亚砜(DMSO)作用相似的分化改变，提示胎肝提取物中含有促进BEL-7402细胞分化的活性物质[1]。胎肝提取物对QGY-7703，BEL-7402，SMMC-7721，HepA同样具有抑制增殖和促进分化的作用(表1)，它们的半数抑制浓度IC50为346.93,151.18,182.37,231.03 mg/L。
, 百拇医药
MTT比色法常用于抗肿瘤药物的药效学试验[4]，MTT比色法主要原理在于检测细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的活力[3]，在一定程度上反映了细胞的生存活力。本试验结果表明，100～500 mg/L胎肝提取物对4种肝癌细胞的酶活力均有不同程度的抑制作用，但它们的半数抑制浓度(IC50)分别为1318.1、1599.2、793.8、813.1 mg/L，均显著高于相应的DNA合成IC50(表1，2)，提示胎肝提取物抑制细胞DNA合成的能力比抑制脱氢酶的活力强。线粒体脱氢酶是细胞有氧代谢的中间酶，分化程度高的肿瘤其有氧代谢相对较活跃，而糖酵解反应较弱，本研究从4种肝癌细胞中均观察到这种特点，说明胎肝提取物在抑制肝癌细胞生长的同时能促进分化。
吴祖泽等[5]报道，人胚肝细胞能分泌低分抑瘤物，可以抑制非实体瘤白血病瘤株细胞的生长，临床上用于治疗白血病起到净化骨髓的作用。而对胎肝提取物能否抑制肝癌等实体瘤的生长和促进肝癌细胞分化，尚未见报道。目前，肿瘤的分化研究已成为肿瘤生物学的一个热门课题，能够诱导肝癌细胞分化的因素很多，如维甲酸，阿霉素，亚硒酸钠，二甲亚砜等化合物[6，7]以及本文所提及的肝细胞分化因子，随着内源性肝分化因子研究的深入必将给肝癌的生物修饰疗法提供一条新途径。
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参考文献
1 邹清雁，孔祥平，李茹冰.胎肝提取物对BEL-7402肝癌细胞的影响.临床肝胆病杂志，1997，13：225.
2 邹清雁，孔祥平，张宜俊，等.乳猪脑提取物和脑活素对培养中胎鼠大脑皮层神经元的影响.天津医药，1994，11：661.
3 孔祥平，张宜俊，邹清雁，等.促肝细胞生长素单克隆抗体的制备及其免疫组化的研究.中国病理生理杂志，1994，10：165.
4 周建军，乐秀芳，韩家娴，等.评价抗癌物质活性的改良MTT方法.中国医药工业杂志，1993，24：455.
5 吴祖泽，裴雪涛，薛惠华.人胎肝细胞分泌的低分子抑瘤物对白血病细胞的抑制作用. 中国应用生理学杂志,1993， 9:20.
6 陈惠黎.肝癌诱导分化治疗基础和临床研究.医药研究通讯，1997，26：20.
7 李茹冰，邹清雁，孔祥平，等.二甲亚砜对人肝癌细胞BEL-7402细胞的影响.中国病理生理杂志，1998，14：117.
(1998年9月22日收稿，1998年12月31日修回), http://www.100md.com
单位：解放军458医院解放军传染病中心(广州 510602)
关键词：肝细胞瘤；生长抑制物；氧化还原酶类；细胞分化
胎肝提取物对培养中4株肝癌细胞增殖和分化的影响 摘 要 目的：观察4月胎肝提取物对QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721人肝癌细胞和Hep A小鼠肝瘤细胞增殖和分化的影响。方法：从4月胎肝中制备提取物，采用[3H]-TdR掺入法和MTT比色法。 结果：100～500 mg/L的胎肝提取物能明显抑制QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721、Hep A等肝癌细胞的DNA合成和脱氢酶活力。对DNA合成的半数抑制浓度(IC50)分别为346.93、 151.18、 182.37、231.03mg/L；对脱氢酶活力的抑制弱于对DNA合成的抑制，IC50分别为1318.1、1599.2、793.8、813.1mg/L。结论：胎肝提取物能够抑制上述4种细胞增殖和促进分化。
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Effect of embryo hepatic extracts on proliferation and differentiation of 4 lines of hepatoma cells in culture
ZOU Qing-Yan LI Ru-Bin KONG Xiang-Ping ZENG Ping-Lu
YANG Lian-Ping CHEN Yong-Zheng
Infectious Disease Center, No. 458 Hospital of PLA, Guangzhou (510602)
Abstract AIM: The effects of embryo hepatic extracts (EHE) on the proliferation and the differentiation of QGY-7703, BEL-7402, SMMC-7721 human hepatoma cell lines and HepA murine hepatoma cell were investigated. METHODS: EHE was extracted from 4-month human embryo,[ 3 H]-TdR incorporation and MTT colorimetric assays were performed. RESULTS: 100～500 mg/L of the extracts can apparently inhibit the DNA syntheses and the dehydrogenase activities of these cells. The half inhibitory concentration(IC50) of DNA syntheses of QGY-7703, BEL-7402, SMMC-7721, HepA hepatoma cells were 346.93, 151.18, 182.37 and 231.03 mg/L. The inhibitory effect of EHE on the dehydrogenase is smaller than that of these cells on DNA syntheses; the IC50 were 1318.1, 1599.2, 793.8, 813.1mg/L respectively. CONCLUSION: EHE can inhibit the proliferation and promote the differentiation of these hepatoma cells.
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MeSH Hepatoma； Growth inhibitors; Oxidoreductases; Cells differentiation
已有研究表明，从4月胎肝中制备的提取物可以抑制BEL-7402细胞的增殖，形态上能促进BEL-7402细胞的分化[1]。胎肝提取物能否抑制其它肝癌细胞的生长和促进分化一直是我们关注的问题，为此我们选4株不同来源的肝癌细胞，观察胎肝提取物对4株肝癌细胞的影响。
材料和方法
(一) 胎肝提取物的制备，参见文献[1]。
(二) 细胞系来源及培养条件：BEL-7402人肝癌细胞引自香港中文大学解剖与临床病理学系；SMMC-7721、QGY-7703人肝癌细胞系购自中国科学院细胞所； Hep A小鼠肝癌细胞系引自中山医科大学实验动物中心。4种细胞株均接种于F12培养液中，内含10%小牛血清，青链霉素各100 mg/L，37℃，5% CO2培养并传代，传代时用胰酶消化。
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(三) 实验方法：细胞浓度为4.0～8.0×104/mL接种于Costar 3 596的96孔板，0.1 mL/孔。置37℃，5% CO2 24 h后换液，分别加入50～500 mg/L的胎肝提取物，设阴性对照孔。72 h后弃上清，分别做MTT[2]比色和[3 H]-TdR掺入[3]的技术操作。
(四) 数据以
表示,所有数据均行方差分析Dunnett法统计处理和对数直线回归计算半数抑制浓度(IC50)结果
(一) 对细胞DNA合成的影响:胎肝提取物对4株肝癌细胞均有抑制增殖和促进分化的作用，见表1。
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表1 胎肝提取物对肝癌细胞[3H]-TdR掺入的影响
Tab 1 The effect of embryo hepatic extract on the [3 H]-TdR incorporation of the hepatoma cells(counts.min-1,
,n=4)QGY-7703
BEL-7402
SMMC-7721
HepA
, 百拇医药
EHE(mg/L)
500
205.98±53.78*
290.09±21.65**
81.24±13.49**
139.49±16.51**
250
298.72±9.71
392.91±93.92**
128.70±19.92**
, 百拇医药
228.99±32.00**
100
312.38±25.89
426.34±32.07**
182.61±39.20**
480.99±125.38
50
431.36±116.08
777.90±147.93
315.62±55.20
, 百拇医药 530.23±196.39
Control
472.89±180.69
958.72±242.11
324.09±83.20
544.18±164.08
*P<0.05, **P<0.01,vs control; EHE = embryo hepatic extract
(二)对细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活力的影响:胎肝提取物对四株肝癌细胞线粒体脱氢酶活力均有不同的抑制作用，见表2。
表2 胎肝提取物对肝癌细胞琥珀酸脱氢酶活力的影响
, 百拇医药
Tab 2 The effect of embryo hepatic extract on the dehydrogenase activities of the hepatoma cells(OD,
,n=4)QGY-7703
BEL-7402
SMMC-7721
HepA
EHE(mg/L)
500
0.056±0.003**
, 百拇医药
0.084±0.004**
0.050±0.002**
0.053±0.002**
250
0.075±0.005
0.092±0.007**
0.069±0.005*
0.071±0.005**
100
0.080±0.006
, 百拇医药
0.095±0.012**
0.076±0.009
0.090±0.012
50
0.092±0.019
0.115±0.006
0.088±0.011
0.093±0.008
Control
0.086±0.009
0.128±0.016
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0.090±0.011
0.091±0.005
*P<0.05， ** P<0.01,vs control
讨论
恶性肿瘤在形态、功能和代谢等方面类似未分化的胚胎细胞。胚胎细胞是受精卵增殖分化而来，其间必然产生许多与胚胎细胞分化有关的活性物质。我们先前的研究发现，胎肝提取物可以明显地抑制BEL-7402肝癌细胞的生长，形态上出现与二甲亚砜(DMSO)作用相似的分化改变，提示胎肝提取物中含有促进BEL-7402细胞分化的活性物质[1]。胎肝提取物对QGY-7703，BEL-7402，SMMC-7721，HepA同样具有抑制增殖和促进分化的作用(表1)，它们的半数抑制浓度IC50为346.93,151.18,182.37,231.03 mg/L。
, 百拇医药
MTT比色法常用于抗肿瘤药物的药效学试验[4]，MTT比色法主要原理在于检测细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的活力[3]，在一定程度上反映了细胞的生存活力。本试验结果表明，100～500 mg/L胎肝提取物对4种肝癌细胞的酶活力均有不同程度的抑制作用，但它们的半数抑制浓度(IC50)分别为1318.1、1599.2、793.8、813.1 mg/L，均显著高于相应的DNA合成IC50(表1，2)，提示胎肝提取物抑制细胞DNA合成的能力比抑制脱氢酶的活力强。线粒体脱氢酶是细胞有氧代谢的中间酶，分化程度高的肿瘤其有氧代谢相对较活跃，而糖酵解反应较弱，本研究从4种肝癌细胞中均观察到这种特点，说明胎肝提取物在抑制肝癌细胞生长的同时能促进分化。
吴祖泽等[5]报道，人胚肝细胞能分泌低分抑瘤物，可以抑制非实体瘤白血病瘤株细胞的生长，临床上用于治疗白血病起到净化骨髓的作用。而对胎肝提取物能否抑制肝癌等实体瘤的生长和促进肝癌细胞分化，尚未见报道。目前，肿瘤的分化研究已成为肿瘤生物学的一个热门课题，能够诱导肝癌细胞分化的因素很多，如维甲酸，阿霉素，亚硒酸钠，二甲亚砜等化合物[6，7]以及本文所提及的肝细胞分化因子，随着内源性肝分化因子研究的深入必将给肝癌的生物修饰疗法提供一条新途径。
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参考文献
1 邹清雁，孔祥平，李茹冰.胎肝提取物对BEL-7402肝癌细胞的影响.临床肝胆病杂志，1997，13：225.
2 邹清雁，孔祥平，张宜俊，等.乳猪脑提取物和脑活素对培养中胎鼠大脑皮层神经元的影响.天津医药，1994，11：661.
3 孔祥平，张宜俊，邹清雁，等.促肝细胞生长素单克隆抗体的制备及其免疫组化的研究.中国病理生理杂志，1994，10：165.
4 周建军，乐秀芳，韩家娴，等.评价抗癌物质活性的改良MTT方法.中国医药工业杂志，1993，24：455.
5 吴祖泽，裴雪涛，薛惠华.人胎肝细胞分泌的低分子抑瘤物对白血病细胞的抑制作用. 中国应用生理学杂志,1993， 9:20.
6 陈惠黎.肝癌诱导分化治疗基础和临床研究.医药研究通讯，1997，26：20.
7 李茹冰，邹清雁，孔祥平，等.二甲亚砜对人肝癌细胞BEL-7402细胞的影响.中国病理生理杂志，1998，14：117.
(1998年9月22日收稿，1998年12月31日修回), http://www.100md.com