MHC-1类基因转移对移植免疫原性的影响*
作者：李 蓁 李树浓 曾文涛 陈规划 朱振宇
单位：
李 蓁 曾文涛 陈规划 中山医科大学附属第一医院外科实验室；李树浓 病理生理教研室；朱振宇 生化教研室(广州 510080)
关键词：主要组织相容性复合物；移植；免疫耐受；基因；MHC-Ⅰ类
中国病理生理杂志990604 摘 要 目的：观察MHC-Ⅰ类基因转移对移植免疫原性的影响。方法：应用混合淋巴细胞培养和动态检测雌性受体BALB/c小鼠体内Y染色体特异的性别决定基因进行研究。结果：通过供体MHC-Ⅰ类基因转移到受体造血细胞，降低了移植后的免疫原性。结论：通过MHC-Ⅰ类基因转移，可以诱导受体对供体产生一定程度的特异性免疫耐受。
The effect of MHC-Ⅰgene transfer on transplantation immunogenicity
, http://www.100md.com
LI Zhen, LI Shu-Nong, ZENG Wen-Tao, CHEN Gui-Hua, ZHU Zhen-Yu
Laboratory of Surgery, The First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou (510080)
Abstract AIM:To look for the effect of MHC-Ⅰgene transfer on transplantation immunogenicity. METHODS: Mixed lymphocyte culture (MLC) is used as the external model of immunological rejection. The method of detecting donor sex determining region of the Y chromosome in the female recipient mice by PCR is the internal model of immunological rejection. RESULTS: Transplantation immunogenicity reduced by MHC-Ⅰgene transfer, and the immunological rejection was slowed down. CONCLUSIONS: Donor-specific immune tolerance has been induced by MHC-Ⅰgene transfer. These may provide a novel way for inhibiting transplantation rejection in human being.
, 百拇医药
MeSH Major histocompatibility complex; Transplantation; Immune tolerance; Gene,MHC classⅠ
目前临床器官移植的主要障碍已不是手术问题，而是由于供受者之间主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)的差异所引起的免疫排斥反应。临床上主要应用大剂量的免疫抑制剂来控制排斥反应，保持移植物的功能，但这样同时降低了机体对感染和肿瘤等的抵抗力。诱导受体对供体组织抗原产生特异性免疫耐受，是解决这一问题的关键[1]。本研究将雄性C57BL/6小鼠的骨髓细胞输注给预先在其造血细胞中转染了C57BL/6 MHC-Ⅰ类基因的雌性BALB/c小鼠。用Y染色体特异的性别决定基因[2]检测雄性供体细胞在雌性受体动物中的存活时间，并用混合淋巴细胞反应(MLC)观察供受体细胞间的组织相容性。为临床移植克服MHC障碍，提供新的途径和理论依据[3，4]。
, http://www.100md.com
材料与方法
(一)动物：雌性BALB/c(H-2d)、雄性C57BL/6(H-2b)近交系小鼠，8～10周龄，18～22 g，由本校实验动物中心提供。
(二)试剂：二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、丝裂霉素C均购自Sigma公司。RPMI1640培养基购自Gibco BRL公司。PCR marker购自华美生物工程公司。
(三)质粒：逆转录病毒重组质粒pXN(N2-B19-H-2Kb cDNA)和空载体N2由美国国立卫生研究院Sandra Doren博士惠赠。
(四)仪器：PCR仪(型号PTC-150， 美国MJ-Research公司产品)。酶联免疫检测仪(DG 3022型，国营华东电子管厂)。
, 百拇医药
(五)混合淋巴细胞培养：用改进的MTT法[5]检测。
(六)动态检测雌性受体BALB/c小鼠体内Y染色体特异的性别决定基因(sex determining region of the Y chromosome, Sry)。
1.引物设计：根据文献报道的小鼠Y染色体特异的Sry核苷酸序列[2]以及引物的设计要求合成引物。利用美国National Biosciences公司编制的Oligo引物分析软件进行电脑辅助设计。引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。扩增长度为449 bp。
2.雄性C57BL/6小鼠的骨髓细胞悬液0.2 mL(浓度为1.5×107/mL)，由尾静脉分别输注给以下3组小鼠：雌性未转染、空载体转染、重组逆转录病毒转染的BALB/c小鼠[6]。每组各10只小鼠，输入细胞后置标准动物实验室喂养。
, http://www.100md.com
3.用PCR动态检测雌性BALB/c小鼠体内的Sry：3、7、10、12、15和30 d。
(七)统计分析方法：实验数据均以
表示。多组间比较采用方差分析及Student-Newman-Keuls检验进行两两比较。差异显著性检验采用双侧检验。所有计算采用SPSS for Windows软件在微型计算机上进行。
结果
(一)双向混合淋巴细胞培养：结果见表1。重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠脾细胞，对C57 BL/6小鼠的脾细胞增殖反应减弱。与未转染和空载体转染的BALB/c小鼠相比，有显著差异(P<0.05)。而空载体转染与未转染的BALB/c小鼠相比，无显著差异(P>0.05)。
表1 小鼠脾细胞体外双向混合培养
, 百拇医药
Tab 1 The two-way mixed culture of murine splenic
cells in vitro (,n=6)
Origin of lymphocytes
OD
1
2
A
C57BL/6
BALB/c
0.424±0.041
, http://www.100md.com
B
C57BL/6
BALB/c(transfection with N2)
0.414±0.034
C
C57BL/6
BALB/c(transfection with pXN)
0.258±0.043*
D
C57BL/6
, http://www.100md.com
C57BL/6
0.158±0.016
E
BALB/c
BALB/c
0.151±0.018
* P<0.05, vs A and B
(二)单向混合淋巴细胞培养：结果见表2。经丝裂霉素C处理后的重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠脾细胞，刺激C57BL/6小鼠脾细胞增殖的能力减弱。与未转染和空载体转染的BALB/c小鼠相比，有显著差异(P<0.05)。而空载体转染与未转染的BALB/c小鼠相比，无显著差异(P>0.05)。C57BL/6小鼠脾细胞经丝裂霉素C处理后，刺激重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠脾细胞增殖的能力减弱。与刺激未转染和空载体转染的BALB/c小鼠脾细胞相比，有显著差异(P<0.05)。而刺激空载体转染与未转染的BALB/c小鼠脾细胞相比，无显著差异(P>0.05)。
, 百拇医药
表2 小鼠脾细胞体外单向混合培养
Tab 2 The one-way mixed culture of murine splenic cells
in vitro (，n=6)
Origin of lymphocytes
OD
1
2
A
C57BL/6
, http://www.100md.com BALB/c(M)
0.312±0.021
B
C57BL/6
BALB/c(transfection with N2) (M)
0.306±0.014
C
C57BL/6
BALB/c(transfection with pXN)(M)
0.168±0.020*
, 百拇医药
D
C57BL/6(M)
BALB/c
0.328±0.015
E
C57BL/6(M)
BALB/c(transfection with N2)
0.319±0.016
F
C57BL/6(M)
BALB/c(transfection with pXN)
, 百拇医药
0.174±0.011*
G
C57BL/6
C57BL/6(M)
0.087±0.011
* P<0.05, vs A and B or D and E respectively
(M): treated with mitomycin C
(三)PCR动态检测雌性受体BALB/c小鼠体内的Sry：结果见图1，2。空载体转染和未转染的雌性受体BALB/c小鼠，10 d时仍可从其血中检测到雄性供体C57BL/6小鼠的Sry， 12、15和30 d的结果则为阴性。重组逆转录病毒载体转染的雌性受体BALB/c小鼠，30 d时仍可从其血中检测到雄性供体C57BL/6小鼠的Sry。
, 百拇医药
Fig 1 Donor Sry in the female recipient mice transferred with MHC-Ⅰgene
M:PCR Marker, 1:d 3, 2:d 7, 3:d 10, 4:d 12, 5: d 15, 6:d 30, 7: Female C57BL/6
图1 PCR动态检测重组载体转染的雌性受体小鼠中供者的Sry
Fig 2 Donor Sry in the non-transferred female recipient mice
M:PCR Marker, 1：Female C57BL/6, 2：d 3, 3：d 7, 4：d 10, 5：d 12, 6：d 15, 7：d 30, 8： Male C57BL/6
, 百拇医药
图2 PCR动态检测未转染的雌性受体小鼠中供者的Sry
讨论
混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture, MLC)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体HLA抗原相容的程度。实验结果显示，重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠脾细胞，对C57BL/6小鼠脾细胞的刺激强度或应答程度都减弱。与未转染和空载体转染的BALB/c小鼠相比，有显著差异(P<0.05)。而空载体转染与未转染的BALB/c小鼠相比，无显著差异(P>0.05)。提示转导了外源H-2Kb基因的BALB/c小鼠，与C57BL/6小鼠之间的组织相容性差异减少，使得两者的刺激或应答能力减弱，细胞增殖也减少。
本研究选择Y染色体特异的Sry基因[2]作为标志，采用PCR技术通过扩增Sry基因部分序列来动态观察雌性受者体内表达供者Sry的情况。该方法具有简便、灵敏和特异等优点，可作为排斥反应的体内模型。若供受体的组织相容性不匹配，则较快发生排斥反应，此时雌性受者体内就不能检测到供者的Sry；若供受体的组织相容性匹配程度高，则可以使排斥反应的发生减弱，雌性受者体内较长时间都能检测到供者的Sry。实验结果表明，空载体转染和未转染的雌性受体BALB/c小鼠，10 d时仍可从其血中检测到雄性供体C57BL/6小鼠的Sry，12、15和30 d的结果则为阴性。重组逆转录病毒载体转染的雌性受体BALB/c小鼠，30 d时仍可从其血中检测到雄性供体C57 BL/6小鼠的Sry。提示转导了外源H-2Kb基因的受体BALB/c小鼠，与供体C57BL/6小鼠之间的组织相容性差异减少，匹配程度增高，从而可以降低移植后的免疫原性，诱导受体对供体产生一定程度的免疫耐受，使排斥反应的发生减弱。
, 百拇医药
本研究结果表明，MHC-Ⅰ类基因转移减少了供受体之间的MHC差异，降低了移植后的免疫原性，从而诱导了供体特异性的免疫耐受。为临床降低移植后的免疫排斥反应提供了理论依据和实验基础，有助于克服器官移植所面临的MHC障碍，给临床移植带来了新的希望。
* 国家自然科学基金资助(No. 39470665)
参考文献
1 Smith CV, Rosengard BR, Guzzete PC, et al. Approaches to transplantation tolerance. Transplant Proc, 1991, 23:2157.
2 Gubbay J, Collignon J, Koopman P, et al. A gene mapping to the sex-determining region of the mouse Y chromosome is a member of a novel family of embryonically expressed genes. Nature, 1990, 346:245.
, http://www.100md.com
3 Ohlen C, Kling G, Hoglund P, et al. Prevention of allogeneic bone marrow graft rejection by H-2 transgene in donor mice. Science, 1989, 246: 666.
4 Bix M, Liao NS, Zijlstra M, et al. Rejection of classⅠMHC-deficient haemopoietic cells by irradiated MHC-matched mice. Nature, 1991,349: 329.
5 Dariusz S, Sarah JS, Richard HC, et al. An improved MTT assay. J Immunol Methods, 1993, 157:203.
6 李 蓁，李树浓，朱振宇. H-2Kb基因导入小鼠造血细胞的研究.中国病理生理杂志,1997，13(6):593.
(1998年12月30日收稿，1999年3月25日修回), http://www.100md.com
单位：
李 蓁 曾文涛 陈规划 中山医科大学附属第一医院外科实验室；李树浓 病理生理教研室；朱振宇 生化教研室(广州 510080)
关键词：主要组织相容性复合物；移植；免疫耐受；基因；MHC-Ⅰ类
中国病理生理杂志990604 摘 要 目的：观察MHC-Ⅰ类基因转移对移植免疫原性的影响。方法：应用混合淋巴细胞培养和动态检测雌性受体BALB/c小鼠体内Y染色体特异的性别决定基因进行研究。结果：通过供体MHC-Ⅰ类基因转移到受体造血细胞，降低了移植后的免疫原性。结论：通过MHC-Ⅰ类基因转移，可以诱导受体对供体产生一定程度的特异性免疫耐受。
The effect of MHC-Ⅰgene transfer on transplantation immunogenicity
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LI Zhen, LI Shu-Nong, ZENG Wen-Tao, CHEN Gui-Hua, ZHU Zhen-Yu
Laboratory of Surgery, The First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou (510080)
Abstract AIM:To look for the effect of MHC-Ⅰgene transfer on transplantation immunogenicity. METHODS: Mixed lymphocyte culture (MLC) is used as the external model of immunological rejection. The method of detecting donor sex determining region of the Y chromosome in the female recipient mice by PCR is the internal model of immunological rejection. RESULTS: Transplantation immunogenicity reduced by MHC-Ⅰgene transfer, and the immunological rejection was slowed down. CONCLUSIONS: Donor-specific immune tolerance has been induced by MHC-Ⅰgene transfer. These may provide a novel way for inhibiting transplantation rejection in human being.
, 百拇医药
MeSH Major histocompatibility complex; Transplantation; Immune tolerance; Gene,MHC classⅠ
目前临床器官移植的主要障碍已不是手术问题，而是由于供受者之间主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)的差异所引起的免疫排斥反应。临床上主要应用大剂量的免疫抑制剂来控制排斥反应，保持移植物的功能，但这样同时降低了机体对感染和肿瘤等的抵抗力。诱导受体对供体组织抗原产生特异性免疫耐受，是解决这一问题的关键[1]。本研究将雄性C57BL/6小鼠的骨髓细胞输注给预先在其造血细胞中转染了C57BL/6 MHC-Ⅰ类基因的雌性BALB/c小鼠。用Y染色体特异的性别决定基因[2]检测雄性供体细胞在雌性受体动物中的存活时间，并用混合淋巴细胞反应(MLC)观察供受体细胞间的组织相容性。为临床移植克服MHC障碍，提供新的途径和理论依据[3，4]。
, http://www.100md.com
材料与方法
(一)动物：雌性BALB/c(H-2d)、雄性C57BL/6(H-2b)近交系小鼠，8～10周龄，18～22 g，由本校实验动物中心提供。
(二)试剂：二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、丝裂霉素C均购自Sigma公司。RPMI1640培养基购自Gibco BRL公司。PCR marker购自华美生物工程公司。
(三)质粒：逆转录病毒重组质粒pXN(N2-B19-H-2Kb cDNA)和空载体N2由美国国立卫生研究院Sandra Doren博士惠赠。
(四)仪器：PCR仪(型号PTC-150， 美国MJ-Research公司产品)。酶联免疫检测仪(DG 3022型，国营华东电子管厂)。
, 百拇医药
(五)混合淋巴细胞培养：用改进的MTT法[5]检测。
(六)动态检测雌性受体BALB/c小鼠体内Y染色体特异的性别决定基因(sex determining region of the Y chromosome, Sry)。
1.引物设计：根据文献报道的小鼠Y染色体特异的Sry核苷酸序列[2]以及引物的设计要求合成引物。利用美国National Biosciences公司编制的Oligo引物分析软件进行电脑辅助设计。引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。扩增长度为449 bp。
2.雄性C57BL/6小鼠的骨髓细胞悬液0.2 mL(浓度为1.5×107/mL)，由尾静脉分别输注给以下3组小鼠：雌性未转染、空载体转染、重组逆转录病毒转染的BALB/c小鼠[6]。每组各10只小鼠，输入细胞后置标准动物实验室喂养。
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3.用PCR动态检测雌性BALB/c小鼠体内的Sry：3、7、10、12、15和30 d。
(七)统计分析方法：实验数据均以
表示。多组间比较采用方差分析及Student-Newman-Keuls检验进行两两比较。差异显著性检验采用双侧检验。所有计算采用SPSS for Windows软件在微型计算机上进行。结果
(一)双向混合淋巴细胞培养：结果见表1。重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠脾细胞，对C57 BL/6小鼠的脾细胞增殖反应减弱。与未转染和空载体转染的BALB/c小鼠相比，有显著差异(P<0.05)。而空载体转染与未转染的BALB/c小鼠相比，无显著差异(P>0.05)。
表1 小鼠脾细胞体外双向混合培养
, 百拇医药
Tab 1 The two-way mixed culture of murine splenic
cells in vitro (
,n=6)Origin of lymphocytes
OD
1
2
A
C57BL/6
BALB/c
0.424±0.041
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B
C57BL/6
BALB/c(transfection with N2)
0.414±0.034
C
C57BL/6
BALB/c(transfection with pXN)
0.258±0.043*
D
C57BL/6
, http://www.100md.com
C57BL/6
0.158±0.016
E
BALB/c
BALB/c
0.151±0.018
* P<0.05, vs A and B
(二)单向混合淋巴细胞培养：结果见表2。经丝裂霉素C处理后的重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠脾细胞，刺激C57BL/6小鼠脾细胞增殖的能力减弱。与未转染和空载体转染的BALB/c小鼠相比，有显著差异(P<0.05)。而空载体转染与未转染的BALB/c小鼠相比，无显著差异(P>0.05)。C57BL/6小鼠脾细胞经丝裂霉素C处理后，刺激重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠脾细胞增殖的能力减弱。与刺激未转染和空载体转染的BALB/c小鼠脾细胞相比，有显著差异(P<0.05)。而刺激空载体转染与未转染的BALB/c小鼠脾细胞相比，无显著差异(P>0.05)。
, 百拇医药
表2 小鼠脾细胞体外单向混合培养
Tab 2 The one-way mixed culture of murine splenic cells
in vitro (
，n=6)Origin of lymphocytes
OD
1
2
A
C57BL/6
, http://www.100md.com BALB/c(M)
0.312±0.021
B
C57BL/6
BALB/c(transfection with N2) (M)
0.306±0.014
C
C57BL/6
BALB/c(transfection with pXN)(M)
0.168±0.020*
, 百拇医药
D
C57BL/6(M)
BALB/c
0.328±0.015
E
C57BL/6(M)
BALB/c(transfection with N2)
0.319±0.016
F
C57BL/6(M)
BALB/c(transfection with pXN)
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0.174±0.011*
G
C57BL/6
C57BL/6(M)
0.087±0.011
* P<0.05, vs A and B or D and E respectively
(M): treated with mitomycin C
(三)PCR动态检测雌性受体BALB/c小鼠体内的Sry：结果见图1，2。空载体转染和未转染的雌性受体BALB/c小鼠，10 d时仍可从其血中检测到雄性供体C57BL/6小鼠的Sry， 12、15和30 d的结果则为阴性。重组逆转录病毒载体转染的雌性受体BALB/c小鼠，30 d时仍可从其血中检测到雄性供体C57BL/6小鼠的Sry。
, 百拇医药
Fig 1 Donor Sry in the female recipient mice transferred with MHC-Ⅰgene
M:PCR Marker, 1:d 3, 2:d 7, 3:d 10, 4:d 12, 5: d 15, 6:d 30, 7: Female C57BL/6
图1 PCR动态检测重组载体转染的雌性受体小鼠中供者的Sry
Fig 2 Donor Sry in the non-transferred female recipient mice
M:PCR Marker, 1：Female C57BL/6, 2：d 3, 3：d 7, 4：d 10, 5：d 12, 6：d 15, 7：d 30, 8： Male C57BL/6
, 百拇医药
图2 PCR动态检测未转染的雌性受体小鼠中供者的Sry
讨论
混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture, MLC)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体HLA抗原相容的程度。实验结果显示，重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠脾细胞，对C57BL/6小鼠脾细胞的刺激强度或应答程度都减弱。与未转染和空载体转染的BALB/c小鼠相比，有显著差异(P<0.05)。而空载体转染与未转染的BALB/c小鼠相比，无显著差异(P>0.05)。提示转导了外源H-2Kb基因的BALB/c小鼠，与C57BL/6小鼠之间的组织相容性差异减少，使得两者的刺激或应答能力减弱，细胞增殖也减少。
本研究选择Y染色体特异的Sry基因[2]作为标志，采用PCR技术通过扩增Sry基因部分序列来动态观察雌性受者体内表达供者Sry的情况。该方法具有简便、灵敏和特异等优点，可作为排斥反应的体内模型。若供受体的组织相容性不匹配，则较快发生排斥反应，此时雌性受者体内就不能检测到供者的Sry；若供受体的组织相容性匹配程度高，则可以使排斥反应的发生减弱，雌性受者体内较长时间都能检测到供者的Sry。实验结果表明，空载体转染和未转染的雌性受体BALB/c小鼠，10 d时仍可从其血中检测到雄性供体C57BL/6小鼠的Sry，12、15和30 d的结果则为阴性。重组逆转录病毒载体转染的雌性受体BALB/c小鼠，30 d时仍可从其血中检测到雄性供体C57 BL/6小鼠的Sry。提示转导了外源H-2Kb基因的受体BALB/c小鼠，与供体C57BL/6小鼠之间的组织相容性差异减少，匹配程度增高，从而可以降低移植后的免疫原性，诱导受体对供体产生一定程度的免疫耐受，使排斥反应的发生减弱。
, 百拇医药
本研究结果表明，MHC-Ⅰ类基因转移减少了供受体之间的MHC差异，降低了移植后的免疫原性，从而诱导了供体特异性的免疫耐受。为临床降低移植后的免疫排斥反应提供了理论依据和实验基础，有助于克服器官移植所面临的MHC障碍，给临床移植带来了新的希望。
* 国家自然科学基金资助(No. 39470665)
参考文献
1 Smith CV, Rosengard BR, Guzzete PC, et al. Approaches to transplantation tolerance. Transplant Proc, 1991, 23:2157.
2 Gubbay J, Collignon J, Koopman P, et al. A gene mapping to the sex-determining region of the mouse Y chromosome is a member of a novel family of embryonically expressed genes. Nature, 1990, 346:245.
, http://www.100md.com
3 Ohlen C, Kling G, Hoglund P, et al. Prevention of allogeneic bone marrow graft rejection by H-2 transgene in donor mice. Science, 1989, 246: 666.
4 Bix M, Liao NS, Zijlstra M, et al. Rejection of classⅠMHC-deficient haemopoietic cells by irradiated MHC-matched mice. Nature, 1991,349: 329.
5 Dariusz S, Sarah JS, Richard HC, et al. An improved MTT assay. J Immunol Methods, 1993, 157:203.
6 李 蓁，李树浓，朱振宇. H-2Kb基因导入小鼠造血细胞的研究.中国病理生理杂志,1997，13(6):593.
(1998年12月30日收稿，1999年3月25日修回), http://www.100md.com