西拉普利和牛磺酸对慢性缺氧肺组织细胞凋亡的影响
作者：黄文杰 邹霞英 姜辉
单位：黄文杰 邹霞英 姜辉 广州军区广州总医院呼吸内科(510010 广州)
关键词：牛磺酸；细胞低氧；肺
中国病理生理杂志/990728 摘 要 目的：初步观察西拉普利和牛磺酸对慢性缺氧肺 组织细胞凋亡的影响。方法：采用原位末端标记法。 结果：缺氧模型及西拉普利组细胞凋亡明显高于其他各组(P<0.01) ，而牛磺酸组、自然恢复组则与正常对照无差异。结论：西拉普利可能诱 发细胞凋亡的作用，细胞凋亡的发生与否可能与肺动脉高压的形成与发展有关。
Influence of cilazapril and taurine on apoptosis of chronic hypo xic lung tissue
HUANG Wen-Jie, ZOU Xia-Ying, JIANG Hui
, http://www.100md.com
Division of Respiratory Medicine, Guangzhou General Hospital Guangzhou (5 10010)
Abstract AIM：The influence of cilazapril and taurine on apopto sis of chronic hypoxic lung tissues was observed. METHOD：The in situ end-labelling procedure was used. RESULT S：The number of all apoptosis in hypoxic model and Cilazapril groups w as much greater than those of other groups(P<0.01). There was no difference between the natural recovery group and normal controls. CONCLUSION：Cilazapril might induce apoptosis, and apoptosis might be related to the forma tion and development of pulmonary hypertension.
, 百拇医药
MeSH Taurine; Cell hypoxia; Lung
细胞凋亡在组织稳态中发挥重要作用，在血管系统生长发育和病理条 件下可出现[1，2]。血管活性物质如一氧化氮(nitric oxide,NO)和血管紧张素 Ⅱ(angiotensio n Ⅱ,Ang Ⅱ)对血管平滑肌细胞的凋亡有调节作用。有人推测，在肺动脉高压的形成过程 中 ，这些调节血管紧张度、细胞增殖和细胞死亡的血管活性物质之间量的失衡可造成稳态平衡 被破坏[3]。为探讨细胞凋亡和缺氧性肺动脉高压之间可能存在的关系，以及一些 扩血管药物对细胞凋亡的影响，我们就西拉普利和牛磺酸对慢性缺氧肺组织细胞凋亡的影响 进行了初步研究。
材料与方法
1.动物选择与分组：Wistar雄性大鼠，体重200 g左右，随机等分为5组，每组6只：A组为 正常对照组；B组为常 压间隙缺氧并饮牛磺酸；C组为缺氧并胃饲西拉普利；D组为缺氧后自然恢复；E组为缺氧模 型，复制后未做任何处理立即处死。
, 百拇医药
2.动物处理：参照薛全福等[4]方法，将B、C、D、E组置于氧浓度为(10±0.5)%的常压缺氧仓 内，每天持续缺氧8 h，共41 d。E组大鼠于第41 d缺氧模型建成后立即处死，而B组大鼠每 天饮含2%牛磺酸的自来水，C组则每天胃饲西拉普利1.25 mg/只，D组只饮自来水。此3组置 于同样的饲养环境中，继续喂养4周后处死，开胸取肺组织做冰冻切片。
3.原位末端标记检测[5]：冰冻切片用双蒸水洗3次，每次3 min。加标记反应液，50 μL反应液中含末端转移酶(TdT,P romega公司)10μL×TdT Buffer,dig-11-dUTP(宝灵曼公司)0.5 nmols,37℃ 1 h，然后于4 ℃过夜。次日用双蒸水洗3次，加羊血清封闭，37℃ 30 min。加入碱性磷酸酶连接的抗地高 辛抗体(anti-dig-Ap,宝灵曼公司)0.67 U/100 μL 37℃ 40 min，双蒸水洗3次后用NBT/BCI P显色，以细胞核染成紫色为阳性判断标准。以不加dig-11-dUTP、不加anti-dig-Ap为阴性 对照。每组切片随机观察20个高倍视野的凋亡细胞数，取其平均值。
, 百拇医药
4.统计处理：用SAS统计学软件进行单因素5水平方差分析。所有数据以均数±标准差表示。
结 果
1.各组大鼠光镜下肺组织改变：E组大鼠光镜下主要改变为肺小动脉中膜肥厚、结缔组织增 多，血管腔严重狭窄或闭塞，有的血管腔还可见均质无细胞结构的物质栓塞。细支气管扩张 、管壁水肿、炎细胞浸润、局限性肺气肿、肺不张、肺间质增宽、炎症。C组和B组炎性细胞 明显少于E组，肺泡扩张较轻，肺小动脉管壁较薄，管腔狭窄不及E组明显，管腔中未见均质 无细胞结构物质栓塞，其中尤以C组更明显。D组上述改变虽较E组轻，但仍比C组和B组严重 ，管腔中仍可见均质无细胞结构的物质栓塞。
2.各组大鼠肺组织细胞凋亡变化：如图1所示，E组和C组凋亡细胞数明显高于其他各组( P<0.01)，以E组值为最高，与C组相比亦有显著性差异(P<0.01)。图2～4分别为 原位末端标记法对正常、E组及C组肺组织的检测照片，可见凋亡细胞核质固缩呈圆形或 马蹄形、环形、附着于核内膜处，核周有环形透亮区。正常肺组织凋亡细胞少见。
, 百拇医药
Fig 1 Comparison of cell number of apoptosis among
all group s(
±s,n=6)
P<0.01, vs A,B,D groups)；**P<0.01, vs other groups
图1 各组凋亡细胞数的比较
Fig 2 Detection of normal lung tissues with
in situ end-labelling(×150)
, 百拇医药
图2 原位末端标记法对正常肺组织的检测
Fig 3 Detection of hypoxic lung tissues with in situ end-labelling, apoptotic cells increased significantly(×150)
图3 原位末端标记法对缺氧肺组织的检测Fig
4 Detection of lung tissues of Cilazapril group with in situ end-label ling, apoptotic cells increased significantly(×150)
, 百拇医药
图4 原位末端标记法对西拉普利治疗组肺组织的检测
讨 论
生物体内各种组织细胞的数量经常保持在一种相对平衡的状态。这种稳态的维持有赖于各类 细胞有规律地分裂、分化和死亡。细胞凋亡是细胞的一种基本生命现象，是一个清除器官或 组织中多余细胞(包括损伤细胞和癌变前细胞)的过程。普遍认为，缺氧可造成细胞死亡，其 死亡的表现形式为坏死。但近年来对细胞一些生化特征变化的观察发现，缺氧可能诱导细胞 凋亡，凋亡和死亡路径可同时被低氧条件激活[6]。肺血管结构改建在肺动脉高压中的作用已愈来愈受到重视，甚 至有人认为肺动脉高压不是功 能性疾病，而是结构性疾病。在慢性缺氧引起的血管损伤、愈合和适应过程中，肺动肺壁的 所有细胞均发生增殖。而血管平滑肌细胞凋亡被认为有助于组织稳态和内膜损伤的减轻 [7]。
缩血管物质Ang Ⅱ可抑制细胞凋亡，而扩血管物质NO则可诱导细胞凋亡[3] 。我们 的研究发现，E组及C组肺组织细胞凋亡数明显高于正常对照、自然恢复及牛磺酸组，提示缺 氧可诱发细胞凋亡，血管紧张素转换酶抑制剂西拉普利可能有诱发细胞凋亡的作用。光镜下 见西拉普利治疗组肺组织损害最轻，可能与此有关。而同样具有扩血管效应的牛磺酸却未见 诱发细胞凋亡，此氨基酸具有细胞保护、调节钙稳态、直接稳定细胞膜结构的作用，究竟是 哪一种作用抑制细胞凋亡尚不清楚，值得进一步探讨。亦有可能它与细胞凋亡的发生与否毫 不关连，因自然恢复组凋亡细胞数亦少。实验结果还提示在缺氧后期肺动脉高压形成后，低 氧已不能诱发凋亡，细胞以增殖为主。Jones等在用野百合碱诱发的进行性肺动脉高压的研 究中发现，细胞凋亡也只在病程的早期发生[7]。
, 百拇医药
综上所述，细胞凋亡可能与缺氧性肺动脉高压的形成和发展有关，寻找有效的诱导细胞凋亡 的药物可能会有助于预防及治疗。但由于目前这方面的报道不多，其与肺动脉高压的确切关 系及作用机理尚不清楚，还有待于进一步研究。
参考文献
1 Cho A, Courtman DW, Langille BL. Apoptosis(programmed cell death) in arteries of the neonatal lamb. Circ Res, 1995,76:168.
2 Han DMK, Haudenschild CC, Hong MK, et al. Evidence for apoptosis in hu man atherogenesis and in a rat vascular injure model. Am J Pathol, 1995,147:267.
, http://www.100md.com
3 Pollman MJ, Yamada T, Horiuchi M, et al. Vasoactive substances regulat e vascular smooth muscle cell apoptosis. countervailing influences of nitric oxi de and angiotension Ⅱ. Circ Res, 1996,79:748.
4 薜全福，谢剑鸣，胡长贵，等.常压缺氧大鼠肺动脉高压模型的建立.中华结核 和呼吸杂志，1989，12：350.
5 Gorczyca W, Gong J, Darzynkiewiez Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptosis cells by the in situ terminal deoxynucleotidy 1 transferas e and nick translation assays. Cancer Res, 1993,53:1945.
, http://www.100md.com
6 Shimizu S, Eguchi Y, Kamiike W, et al. Induction of apoptosis as well as necrossis by hypoxia and predominant prevention of apoptosis by Bcl-2 and Bcl -Xl. Cancer Res, 1996,56:2161.
7 Jones PL, Rabinovitch M. Tenascin-C is induced with progressiv e pulmon ary vascular disease in rats and is functionally related to increased smooth mus cle cell proliferation. Circ Res, 1996,79:1131.
(1997年10月26日收稿，1998年3月10日修回), 百拇医药
单位：黄文杰 邹霞英 姜辉 广州军区广州总医院呼吸内科(510010 广州)
关键词：牛磺酸；细胞低氧；肺
中国病理生理杂志/990728 摘 要 目的：初步观察西拉普利和牛磺酸对慢性缺氧肺 组织细胞凋亡的影响。方法：采用原位末端标记法。 结果：缺氧模型及西拉普利组细胞凋亡明显高于其他各组(P<0.01) ，而牛磺酸组、自然恢复组则与正常对照无差异。结论：西拉普利可能诱 发细胞凋亡的作用，细胞凋亡的发生与否可能与肺动脉高压的形成与发展有关。
Influence of cilazapril and taurine on apoptosis of chronic hypo xic lung tissue
HUANG Wen-Jie, ZOU Xia-Ying, JIANG Hui
, http://www.100md.com
Division of Respiratory Medicine, Guangzhou General Hospital Guangzhou (5 10010)
Abstract AIM：The influence of cilazapril and taurine on apopto sis of chronic hypoxic lung tissues was observed. METHOD：The in situ end-labelling procedure was used. RESULT S：The number of all apoptosis in hypoxic model and Cilazapril groups w as much greater than those of other groups(P<0.01). There was no difference between the natural recovery group and normal controls. CONCLUSION：Cilazapril might induce apoptosis, and apoptosis might be related to the forma tion and development of pulmonary hypertension.
, 百拇医药
MeSH Taurine; Cell hypoxia; Lung
细胞凋亡在组织稳态中发挥重要作用，在血管系统生长发育和病理条 件下可出现[1，2]。血管活性物质如一氧化氮(nitric oxide,NO)和血管紧张素 Ⅱ(angiotensio n Ⅱ,Ang Ⅱ)对血管平滑肌细胞的凋亡有调节作用。有人推测，在肺动脉高压的形成过程 中 ，这些调节血管紧张度、细胞增殖和细胞死亡的血管活性物质之间量的失衡可造成稳态平衡 被破坏[3]。为探讨细胞凋亡和缺氧性肺动脉高压之间可能存在的关系，以及一些 扩血管药物对细胞凋亡的影响，我们就西拉普利和牛磺酸对慢性缺氧肺组织细胞凋亡的影响 进行了初步研究。
材料与方法
1.动物选择与分组：Wistar雄性大鼠，体重200 g左右，随机等分为5组，每组6只：A组为 正常对照组；B组为常 压间隙缺氧并饮牛磺酸；C组为缺氧并胃饲西拉普利；D组为缺氧后自然恢复；E组为缺氧模 型，复制后未做任何处理立即处死。
, 百拇医药
2.动物处理：参照薛全福等[4]方法，将B、C、D、E组置于氧浓度为(10±0.5)%的常压缺氧仓 内，每天持续缺氧8 h，共41 d。E组大鼠于第41 d缺氧模型建成后立即处死，而B组大鼠每 天饮含2%牛磺酸的自来水，C组则每天胃饲西拉普利1.25 mg/只，D组只饮自来水。此3组置 于同样的饲养环境中，继续喂养4周后处死，开胸取肺组织做冰冻切片。
3.原位末端标记检测[5]：冰冻切片用双蒸水洗3次，每次3 min。加标记反应液，50 μL反应液中含末端转移酶(TdT,P romega公司)10μL×TdT Buffer,dig-11-dUTP(宝灵曼公司)0.5 nmols,37℃ 1 h，然后于4 ℃过夜。次日用双蒸水洗3次，加羊血清封闭，37℃ 30 min。加入碱性磷酸酶连接的抗地高 辛抗体(anti-dig-Ap,宝灵曼公司)0.67 U/100 μL 37℃ 40 min，双蒸水洗3次后用NBT/BCI P显色，以细胞核染成紫色为阳性判断标准。以不加dig-11-dUTP、不加anti-dig-Ap为阴性 对照。每组切片随机观察20个高倍视野的凋亡细胞数，取其平均值。
, 百拇医药
4.统计处理：用SAS统计学软件进行单因素5水平方差分析。所有数据以均数±标准差表示。
结 果
1.各组大鼠光镜下肺组织改变：E组大鼠光镜下主要改变为肺小动脉中膜肥厚、结缔组织增 多，血管腔严重狭窄或闭塞，有的血管腔还可见均质无细胞结构的物质栓塞。细支气管扩张 、管壁水肿、炎细胞浸润、局限性肺气肿、肺不张、肺间质增宽、炎症。C组和B组炎性细胞 明显少于E组，肺泡扩张较轻，肺小动脉管壁较薄，管腔狭窄不及E组明显，管腔中未见均质 无细胞结构物质栓塞，其中尤以C组更明显。D组上述改变虽较E组轻，但仍比C组和B组严重 ，管腔中仍可见均质无细胞结构的物质栓塞。
2.各组大鼠肺组织细胞凋亡变化：如图1所示，E组和C组凋亡细胞数明显高于其他各组( P<0.01)，以E组值为最高，与C组相比亦有显著性差异(P<0.01)。图2～4分别为 原位末端标记法对正常、E组及C组肺组织的检测照片，可见凋亡细胞核质固缩呈圆形或 马蹄形、环形、附着于核内膜处，核周有环形透亮区。正常肺组织凋亡细胞少见。
, 百拇医药
Fig 1 Comparison of cell number of apoptosis among
all group s(
±s,n=6)P<0.01, vs A,B,D groups)；**P<0.01, vs other groups
图1 各组凋亡细胞数的比较
Fig 2 Detection of normal lung tissues with
in situ end-labelling(×150)
, 百拇医药
图2 原位末端标记法对正常肺组织的检测
Fig 3 Detection of hypoxic lung tissues with in situ end-labelling, apoptotic cells increased significantly(×150)
图3 原位末端标记法对缺氧肺组织的检测Fig
4 Detection of lung tissues of Cilazapril group with in situ end-label ling, apoptotic cells increased significantly(×150)
, 百拇医药
图4 原位末端标记法对西拉普利治疗组肺组织的检测
讨 论
生物体内各种组织细胞的数量经常保持在一种相对平衡的状态。这种稳态的维持有赖于各类 细胞有规律地分裂、分化和死亡。细胞凋亡是细胞的一种基本生命现象，是一个清除器官或 组织中多余细胞(包括损伤细胞和癌变前细胞)的过程。普遍认为，缺氧可造成细胞死亡，其 死亡的表现形式为坏死。但近年来对细胞一些生化特征变化的观察发现，缺氧可能诱导细胞 凋亡，凋亡和死亡路径可同时被低氧条件激活[6]。肺血管结构改建在肺动脉高压中的作用已愈来愈受到重视，甚 至有人认为肺动脉高压不是功 能性疾病，而是结构性疾病。在慢性缺氧引起的血管损伤、愈合和适应过程中，肺动肺壁的 所有细胞均发生增殖。而血管平滑肌细胞凋亡被认为有助于组织稳态和内膜损伤的减轻 [7]。
缩血管物质Ang Ⅱ可抑制细胞凋亡，而扩血管物质NO则可诱导细胞凋亡[3] 。我们 的研究发现，E组及C组肺组织细胞凋亡数明显高于正常对照、自然恢复及牛磺酸组，提示缺 氧可诱发细胞凋亡，血管紧张素转换酶抑制剂西拉普利可能有诱发细胞凋亡的作用。光镜下 见西拉普利治疗组肺组织损害最轻，可能与此有关。而同样具有扩血管效应的牛磺酸却未见 诱发细胞凋亡，此氨基酸具有细胞保护、调节钙稳态、直接稳定细胞膜结构的作用，究竟是 哪一种作用抑制细胞凋亡尚不清楚，值得进一步探讨。亦有可能它与细胞凋亡的发生与否毫 不关连，因自然恢复组凋亡细胞数亦少。实验结果还提示在缺氧后期肺动脉高压形成后，低 氧已不能诱发凋亡，细胞以增殖为主。Jones等在用野百合碱诱发的进行性肺动脉高压的研 究中发现，细胞凋亡也只在病程的早期发生[7]。
, 百拇医药
综上所述，细胞凋亡可能与缺氧性肺动脉高压的形成和发展有关，寻找有效的诱导细胞凋亡 的药物可能会有助于预防及治疗。但由于目前这方面的报道不多，其与肺动脉高压的确切关 系及作用机理尚不清楚，还有待于进一步研究。
参考文献
1 Cho A, Courtman DW, Langille BL. Apoptosis(programmed cell death) in arteries of the neonatal lamb. Circ Res, 1995,76:168.
2 Han DMK, Haudenschild CC, Hong MK, et al. Evidence for apoptosis in hu man atherogenesis and in a rat vascular injure model. Am J Pathol, 1995,147:267.
, http://www.100md.com
3 Pollman MJ, Yamada T, Horiuchi M, et al. Vasoactive substances regulat e vascular smooth muscle cell apoptosis. countervailing influences of nitric oxi de and angiotension Ⅱ. Circ Res, 1996,79:748.
4 薜全福，谢剑鸣，胡长贵，等.常压缺氧大鼠肺动脉高压模型的建立.中华结核 和呼吸杂志，1989，12：350.
5 Gorczyca W, Gong J, Darzynkiewiez Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptosis cells by the in situ terminal deoxynucleotidy 1 transferas e and nick translation assays. Cancer Res, 1993,53:1945.
, http://www.100md.com
6 Shimizu S, Eguchi Y, Kamiike W, et al. Induction of apoptosis as well as necrossis by hypoxia and predominant prevention of apoptosis by Bcl-2 and Bcl -Xl. Cancer Res, 1996,56:2161.
7 Jones PL, Rabinovitch M. Tenascin-C is induced with progressiv e pulmon ary vascular disease in rats and is functionally related to increased smooth mus cle cell proliferation. Circ Res, 1996,79:1131.
(1997年10月26日收稿，1998年3月10日修回), 百拇医药