金属硫蛋白对急性镉中毒后抗氧化酶的保护作用
作者：金慧英 李法卿 李素芹 谭维国 陈华标
单位：金慧英 李法卿 李素芹 谭维国 陈华标南京军区军事医学研究所 (南京 210002)
关键词：金属硫蛋白；抗氧化酶；镉中毒；过氧化氢酶
中国病理生理杂志/990718 摘 要 目的：探讨金属硫蛋白(MT)对抗氧化酶的保护作 用机制。方法：向大鼠尾静脉注射氯化镉建立镉中毒模型，分别于注射后 不同时间测定肝组织MT的含量和抗氧化酶(SOD,CAT,GSHpx)的活力变化。结果：镉中毒后30 min～3 h,SOD、GSHpx和CAT活力显著降低(P<0.05)，6 h酶活力逐步 恢复；MT的显著增加出现在3 h,6 h达最高峰(131.95±15.15) μg/g肝组织，随着MT的合 成增加，抗氧化酶的活力逐步恢复。结论：镉中毒严重抑制抗氧化酶的活 力，MT对抗氧化酶的活力恢复可能有良好的促进作用。
, http://www.100md.com
Function of metallothionein protect antioxidases
against cadmium toxication
JIN Hui-Ying, LI Fa-Qing, LI Su-Qin, TAN Wei-Guo, CHEN Hua-Biao
Institute of Military Medicine of Nanjing Command PLA, Nanjing (210002)
Abstract AIM and METHODS：To study the functing of metallothion ein (MT) protect antioxidases, we set up rat cadmium toxical model by intravenou s injecting cadmium chloride, then determined the content of MT and changes of a ctivities of antioxidases (SOD, GSHpx, CAT) in cadmium-exposed rat liver of diff erent time course. RESULTS：Activities of SOD, GSHpx, CAT decrease d obviously (P<0.05) in first 30 min～3 h after cadmium injection and recov e red progressively in 6 h; MT appeared at 3 h , reaching its climax at 6 h (131.9 5± 15.15 μg/g, liver). Activities of antioxidases recovered progressively followin g the raise of MT syntheses. CONCLUSION：Cadmium toxication can in h ibite the activities of antioxidases, and MT may be contribute to the recovering of antioxidases.
, http://www.100md.com
MeSH Metallothionein; Antioxidase; Cadmium toxication; Catalase
重金属镉(cadmium, Cd)污染是一项主要的环境及职业公害。急性镉中 毒可对机体造成严重损伤。有研究表明镉可竞争性替代细胞内依赖金属的抗氧化酶中的金属 ，抑制酶的活力。金属硫蛋白(metallothionein, MT)是小分子富含巯基的可诱导蛋白，有7 个 金属结合位点，所以在MT产生后与镉的亲和力显著升高，且MT自身又有清除自由基的作用 。 因而，本题旨在研究急性镉中毒后肝脏抗氧化化酶的变化及MT对抗氧酶活力恢复的促进作用 ，为临床防治镉中毒以及抗氧化剂MT在各种与氧化损伤有关的疾病中的应用奠定基础。
材料与方法
(一)动物：雄性SD大鼠，240～300 g，第二军医大学实验动物中心提供。
, http://www.100md.com
(二)试剂和仪器：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、胆酸钠(E.M.K公司，德国)，二硫二硝基 苯甲酸(DTNB)、还原型谷光甘肽(GSH)(Fluka公司，德国)，其余试剂均为国产分析纯。Hita chi himic CR21低温高速离心机(日立公司，日本)，721分光光度仪(上海第三分析仪器厂) ，Biorad 3550酶标仪(美国)。
(三)方法：
1.大鼠镉中毒模型的建立和分组：56只SD大鼠随机分为7组，实验前自由进食和水。1 组为对照组，用生理盐水尾静脉注射。6个组为实验组，按Cd2+ 2.5 mg/kg体重的剂 量尾 静脉注射氯化镉，分别于注射后0.5 h、 1 h、3 h、 6 h、 24 h、 48 h处死。取肝组织 加0.25%蔗 糖溶液匀浆，4℃，15 000×g离心30 min，取上清测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过 氧化物酶(GSHpx)和过氧化氢酶(CAT)水平。取1 g肝组织用于MT含量的测定。
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2.各项指标的测定：
SOD活力的测定：邻苯三酚自氧化反应终止法[1]。GSHpx活力的测定：催化GSH 氧化法[2]。CAT活力的测定：比色法[3]。MT含量测定：ELISA法。鼠肝组 织匀浆后，4℃ 15 000×g 30 min离心，上清80℃水浴5 min，再4℃ 27 000×g 10 min离 心 ，取上清适当稀释加入96孔板4℃过夜，洗涤，1%牛血清白蛋白封闭，加兔抗鼠MT一抗(自制 )，37℃孵育1 h，洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育，加底物反应20 min后终 止，酶标仪读数并与标准曲线对照计算MT的含量。以MT μg/g肝组织表示。蛋白含量测定： 染料法。
(四)统计方法：实验数据以
±s表示，采用t检验判定组间差异的显著性。
, 百拇医药
结 果
镉中毒后大鼠肝脏MT及抗氧化酶水平的变化，见表1。
表1 镉中毒大鼠肝脏MT及抗氧化酶水平的变化
Tab 1 Changes of liver MT content and antioxidases
level aft er cadmium toxication (±s,n=8) Group
Control
0.5h
1h
3h
, 百拇医药
6h
24h
48h
SOD(U/mg pro)
220.70±38.37
164.17±26.05 *
168.71±
22.23*
152.44±29.07
216.93±43.47
213.17±23.99
, 百拇医药
248.42±53.55
CAT(U/mg pro)
297.73±21.99
127.42±20.73**
1 92 .32±38.06**
108.30±24.82**
166.05±32.00**
16 6.56±24.54**
169.42±16.32**
, 百拇医药
GSHpx(U/g pro)
144.10±30.50
38.31±11.92**
42.18±19.87**
43.54±11.97**
90.63±27.86*
108.53±21.15 *
104.50±10.14*
MT(μg/g liver)
, 百拇医药
19.69±7.37
17.56±2.30
21.33±
3.06*
44.99±5.68**
131.95±15.15**
138.10±
7.28**
141.05±1.15**
*P<0.05, **P<0.01, vs control
, 百拇医药
急性镉中毒后3 h肝脏MT水平为(44.99±5.68) μg/g肝组织，明显高于对照组，6 h 达较高峰(131.95±15.15) μg/g肝组织，24～48 h均维持在高峰水平。
抗氧化酶GSHpx、CAT的活力均显著低于正常对照组(P<0.05)，30 min～30 h活力 很低，6 h时后有显著恢复(P<0.05)；SOD活力在3 h内显著低于对照组(P<0.05 )，6 h时已恢复至正常的94%，48 h恢复正常。
讨 论
急性镉中毒30 min即出现抗氧化酶活力的显著下降，说明镉可直接抑制酶的活力，可能的机 理是镉与酶分子中的金属发生竞争性替代作用，抑制了酶的活力，早在1980年Bauer[ 4]即发现镉可替代SOD中的Zn形成Cu/Cd SOD，从而影响SOD的活力；镉同样可抑制GSHpx 及CAT的活力，酶活力的降低，使自由基的清除受影响，自由基又加重了酶活力的抑制；这 种抑制作用持续加重至3 h。镉可诱导MT合成，其诱导发生在MT的转录水平，诱导后1 h即有 MT的mRNA升高，6～9 h为MT合成的高峰[5]。我们在实验中发现，镉中毒30 min～1 h未见MT含量的明显变化，3 h后MT的含量逐步增加，至6 h达较高峰，为正常组的6.7倍， 以后维持在高峰水平。随着MT合成的显著增加，抗氧化酶的活力逐步恢复，特别是SOD的活 力在48 h时已恢复正常。推测MT合成可显著增加与镉的结合，减少了游离镉对抗氧化酶的抑 制作用，促进酶的活力恢复；同时MT富含巯基的特殊结构使之具有清除自由基和脂质过氧化 的能力，其丰富的还原巯基是自由基结合的最好靶位点，因而间接地减少自由基对抗氧化酶 的抑制，所以MT对抗氧化酶的活力起到了保护作用。
, http://www.100md.com
实验中CAT的活力在镉中毒1 h时比30 min有显著升高，考虑镉中毒30 min时CAT和GSHpx 活力受抑，过氧化氢(H2O2)的清除减少，导致H2O2升高，而CAT作为H2O2浓度 的调节器，H2O2的升高，刺激体内CAT的释放和活力升高[6]，加速分解H2O 2，我们称之为正反馈作用，但镉的抑制作用最终导致了3 h时CAT活力的再次下降。
参考文献
1 静天玉，赵晓瑜.用终止剂改进超氧化物歧化酶邻苯三酚测活法. 生物化学与生物物理进展，1995，22：84.
2 唐琴华，徐晓琴，黄履成，等.血清谷胱甘肽过氧化物酶比色测定法.临床检验 杂志，1993，11：124.
, 百拇医药
3 雷柏平，周伯通，蔡宏伟，等.过氧化氢酶活性的比色测定法.临床检验杂志， 1993，11：73.
4 Bauer R, Demeter I,Hasemann V, et al. Structural properties of the zin c sites in Cu, Zn-superoxide dismutase perturbed angular correlation of GAMMA ray spectroscopy on the Cu, 111 Cd-superoxide dismutase derivative. Biochem Biophy s Res Commun, 1980, 94:1296.
5 Sendelbach L E, Klaassen C D. Kidney synthesizes less metallothionein than liver in response to cadmium chloride and cadmium-MT. Toxicol Appl Pharma col, 1988, 92:95.
6 Chen T, Furst A, Chien P K. The effects of cadmium and iron on cat alase activities in Tubifek. J Am Coll Toxicol, 1994, 13:112.
(1997年12月18日收稿，1998年7月15日修回), http://www.100md.com
单位：金慧英 李法卿 李素芹 谭维国 陈华标南京军区军事医学研究所 (南京 210002)
关键词：金属硫蛋白；抗氧化酶；镉中毒；过氧化氢酶
中国病理生理杂志/990718 摘 要 目的：探讨金属硫蛋白(MT)对抗氧化酶的保护作 用机制。方法：向大鼠尾静脉注射氯化镉建立镉中毒模型，分别于注射后 不同时间测定肝组织MT的含量和抗氧化酶(SOD,CAT,GSHpx)的活力变化。结果：镉中毒后30 min～3 h,SOD、GSHpx和CAT活力显著降低(P<0.05)，6 h酶活力逐步 恢复；MT的显著增加出现在3 h,6 h达最高峰(131.95±15.15) μg/g肝组织，随着MT的合 成增加，抗氧化酶的活力逐步恢复。结论：镉中毒严重抑制抗氧化酶的活 力，MT对抗氧化酶的活力恢复可能有良好的促进作用。
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Function of metallothionein protect antioxidases
against cadmium toxication
JIN Hui-Ying, LI Fa-Qing, LI Su-Qin, TAN Wei-Guo, CHEN Hua-Biao
Institute of Military Medicine of Nanjing Command PLA, Nanjing (210002)
Abstract AIM and METHODS：To study the functing of metallothion ein (MT) protect antioxidases, we set up rat cadmium toxical model by intravenou s injecting cadmium chloride, then determined the content of MT and changes of a ctivities of antioxidases (SOD, GSHpx, CAT) in cadmium-exposed rat liver of diff erent time course. RESULTS：Activities of SOD, GSHpx, CAT decrease d obviously (P<0.05) in first 30 min～3 h after cadmium injection and recov e red progressively in 6 h; MT appeared at 3 h , reaching its climax at 6 h (131.9 5± 15.15 μg/g, liver). Activities of antioxidases recovered progressively followin g the raise of MT syntheses. CONCLUSION：Cadmium toxication can in h ibite the activities of antioxidases, and MT may be contribute to the recovering of antioxidases.
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MeSH Metallothionein; Antioxidase; Cadmium toxication; Catalase
重金属镉(cadmium, Cd)污染是一项主要的环境及职业公害。急性镉中 毒可对机体造成严重损伤。有研究表明镉可竞争性替代细胞内依赖金属的抗氧化酶中的金属 ，抑制酶的活力。金属硫蛋白(metallothionein, MT)是小分子富含巯基的可诱导蛋白，有7 个 金属结合位点，所以在MT产生后与镉的亲和力显著升高，且MT自身又有清除自由基的作用 。 因而，本题旨在研究急性镉中毒后肝脏抗氧化化酶的变化及MT对抗氧酶活力恢复的促进作用 ，为临床防治镉中毒以及抗氧化剂MT在各种与氧化损伤有关的疾病中的应用奠定基础。
材料与方法
(一)动物：雄性SD大鼠，240～300 g，第二军医大学实验动物中心提供。
, http://www.100md.com
(二)试剂和仪器：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、胆酸钠(E.M.K公司，德国)，二硫二硝基 苯甲酸(DTNB)、还原型谷光甘肽(GSH)(Fluka公司，德国)，其余试剂均为国产分析纯。Hita chi himic CR21低温高速离心机(日立公司，日本)，721分光光度仪(上海第三分析仪器厂) ，Biorad 3550酶标仪(美国)。
(三)方法：
1.大鼠镉中毒模型的建立和分组：56只SD大鼠随机分为7组，实验前自由进食和水。1 组为对照组，用生理盐水尾静脉注射。6个组为实验组，按Cd2+ 2.5 mg/kg体重的剂 量尾 静脉注射氯化镉，分别于注射后0.5 h、 1 h、3 h、 6 h、 24 h、 48 h处死。取肝组织 加0.25%蔗 糖溶液匀浆，4℃，15 000×g离心30 min，取上清测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过 氧化物酶(GSHpx)和过氧化氢酶(CAT)水平。取1 g肝组织用于MT含量的测定。
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2.各项指标的测定：
SOD活力的测定：邻苯三酚自氧化反应终止法[1]。GSHpx活力的测定：催化GSH 氧化法[2]。CAT活力的测定：比色法[3]。MT含量测定：ELISA法。鼠肝组 织匀浆后，4℃ 15 000×g 30 min离心，上清80℃水浴5 min，再4℃ 27 000×g 10 min离 心 ，取上清适当稀释加入96孔板4℃过夜，洗涤，1%牛血清白蛋白封闭，加兔抗鼠MT一抗(自制 )，37℃孵育1 h，洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育，加底物反应20 min后终 止，酶标仪读数并与标准曲线对照计算MT的含量。以MT μg/g肝组织表示。蛋白含量测定： 染料法。
(四)统计方法：实验数据以
±s表示，采用t检验判定组间差异的显著性。, 百拇医药
结 果
镉中毒后大鼠肝脏MT及抗氧化酶水平的变化，见表1。
表1 镉中毒大鼠肝脏MT及抗氧化酶水平的变化
Tab 1 Changes of liver MT content and antioxidases
level aft er cadmium toxication (
±s,n=8) GroupControl
0.5h
1h
3h
, 百拇医药
6h
24h
48h
SOD(U/mg pro)
220.70±38.37
164.17±26.05 *
168.71±
22.23*
152.44±29.07
216.93±43.47
213.17±23.99
, 百拇医药
248.42±53.55
CAT(U/mg pro)
297.73±21.99
127.42±20.73**
1 92 .32±38.06**
108.30±24.82**
166.05±32.00**
16 6.56±24.54**
169.42±16.32**
, 百拇医药
GSHpx(U/g pro)
144.10±30.50
38.31±11.92**
42.18±19.87**
43.54±11.97**
90.63±27.86*
108.53±21.15 *
104.50±10.14*
MT(μg/g liver)
, 百拇医药
19.69±7.37
17.56±2.30
21.33±
3.06*
44.99±5.68**
131.95±15.15**
138.10±
7.28**
141.05±1.15**
*P<0.05, **P<0.01, vs control
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急性镉中毒后3 h肝脏MT水平为(44.99±5.68) μg/g肝组织，明显高于对照组，6 h 达较高峰(131.95±15.15) μg/g肝组织，24～48 h均维持在高峰水平。
抗氧化酶GSHpx、CAT的活力均显著低于正常对照组(P<0.05)，30 min～30 h活力 很低，6 h时后有显著恢复(P<0.05)；SOD活力在3 h内显著低于对照组(P<0.05 )，6 h时已恢复至正常的94%，48 h恢复正常。
讨 论
急性镉中毒30 min即出现抗氧化酶活力的显著下降，说明镉可直接抑制酶的活力，可能的机 理是镉与酶分子中的金属发生竞争性替代作用，抑制了酶的活力，早在1980年Bauer[ 4]即发现镉可替代SOD中的Zn形成Cu/Cd SOD，从而影响SOD的活力；镉同样可抑制GSHpx 及CAT的活力，酶活力的降低，使自由基的清除受影响，自由基又加重了酶活力的抑制；这 种抑制作用持续加重至3 h。镉可诱导MT合成，其诱导发生在MT的转录水平，诱导后1 h即有 MT的mRNA升高，6～9 h为MT合成的高峰[5]。我们在实验中发现，镉中毒30 min～1 h未见MT含量的明显变化，3 h后MT的含量逐步增加，至6 h达较高峰，为正常组的6.7倍， 以后维持在高峰水平。随着MT合成的显著增加，抗氧化酶的活力逐步恢复，特别是SOD的活 力在48 h时已恢复正常。推测MT合成可显著增加与镉的结合，减少了游离镉对抗氧化酶的抑 制作用，促进酶的活力恢复；同时MT富含巯基的特殊结构使之具有清除自由基和脂质过氧化 的能力，其丰富的还原巯基是自由基结合的最好靶位点，因而间接地减少自由基对抗氧化酶 的抑制，所以MT对抗氧化酶的活力起到了保护作用。
, http://www.100md.com
实验中CAT的活力在镉中毒1 h时比30 min有显著升高，考虑镉中毒30 min时CAT和GSHpx 活力受抑，过氧化氢(H2O2)的清除减少，导致H2O2升高，而CAT作为H2O2浓度 的调节器，H2O2的升高，刺激体内CAT的释放和活力升高[6]，加速分解H2O 2，我们称之为正反馈作用，但镉的抑制作用最终导致了3 h时CAT活力的再次下降。
参考文献
1 静天玉，赵晓瑜.用终止剂改进超氧化物歧化酶邻苯三酚测活法. 生物化学与生物物理进展，1995，22：84.
2 唐琴华，徐晓琴，黄履成，等.血清谷胱甘肽过氧化物酶比色测定法.临床检验 杂志，1993，11：124.
, 百拇医药
3 雷柏平，周伯通，蔡宏伟，等.过氧化氢酶活性的比色测定法.临床检验杂志， 1993，11：73.
4 Bauer R, Demeter I,Hasemann V, et al. Structural properties of the zin c sites in Cu, Zn-superoxide dismutase perturbed angular correlation of GAMMA ray spectroscopy on the Cu, 111 Cd-superoxide dismutase derivative. Biochem Biophy s Res Commun, 1980, 94:1296.
5 Sendelbach L E, Klaassen C D. Kidney synthesizes less metallothionein than liver in response to cadmium chloride and cadmium-MT. Toxicol Appl Pharma col, 1988, 92:95.
6 Chen T, Furst A, Chien P K. The effects of cadmium and iron on cat alase activities in Tubifek. J Am Coll Toxicol, 1994, 13:112.
(1997年12月18日收稿，1998年7月15日修回), http://www.100md.com