缺氧预处理对自发性高血压大鼠心肌细胞内钙的影响*
作者：刘培庆 饶曼人 王金
单位：
刘培庆：山东省泰山医学院药理教研室； 饶曼人 南京医科大学心血管药理研究室(南京210029)；王金南京大学配位化学国家重点实验室
关键词：低氧；高血压；大鼠；钙；蛋白激酶C；蛋白质类
中国病理生理杂志/990704 摘要 目的：探讨缺氧预处理对后继缺氧再给氧所致心 肌细胞内钙超载的影响及蛋白激酶C(PKC)和百日咳毒素(PTX)敏感的G-蛋白在缺氧预处理的 作用。方法：循环灌流法分离自发性高血压大鼠(SHR)肥大心肌细胞，用Fu ra-2AM测定钙浓度。结果：[Ca2+]。为1.0 mmol/L时，预处理组缺氧再给氧后其心 肌细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为(194.0±24.8) nmol/L，未预处理组为(297.5 ±24.5) nmol/L；无外钙预处理组缺氧再给氧后其心肌细胞[Ca2+]i为(162.0 ±30.7) nmol/L，未预处理组为(236.5±28.3) nmol/L，提示缺氧预处理可减少缺氧再 给氧所致心肌细胞内钙释放及外钙内流。在[Ca2+]。为1.0 mmol/L组，于预处 理前分 别预先给予PKC拮抗剂Staurosporine(10 nmol/L)及Gi-蛋白失活剂百日咳毒素(PTX，200 ng /L)，可见经后继缺氧再给氧后其心肌细胞[Ca2+]i分别为(264.8±19.3)及(25 8.0±27.7) nmol/L，高于缺氧预处理组但低于未预处理组。结论：SH R肥 大心肌细胞，缺氧预处理可减轻后继缺氧再给氧所致心肌细胞内钙超载；PKC及PTX敏感的G- 蛋白可能部分参与缺氧预处理的保护作用。
, 百拇医药
The influence of hypoxic preconditioning on cytosolic
free calci um concentration in cardiomyocyte isolated
from spontaneously hypertensive rats
LIU Pei-Qing, RAO Man-Ren, WANG Jin-Xi
Department of Cardiovascular Pharmacology , Nanjing Medical University, Nanjing (210029)
Abstract AIM：To investigate the influence of hypoxic precondi tioning on cytosolic free calcium concentration [Ca2+]i in myocyte s is olated from spontaneously hypertensive rats(SHR) and to study the actions of Gi- p rotein and protein kinase C in this process. METHODS：Myocytes were isolated by circulating-perfusion with col la genase and cytosolic free calcium concentrations were measured using Fura-2 flu orescence technique with AR-CM-MIC cation measurement system.RESULTS：Hypoxic preconditioning could attenate the increase in [Ca2+]i cau sed by hypoxia and reoxygenation both at 1.0 mmol/L [Ca2+]。 and calc ium-free Hanks solution. Pretreated with pertussis toxin or staurosporine coul d decrease t he elevation of [Ca2+]i. CONCLUSION：Hypoxic precond ition ing has preventing effect on calcium overload in hypertrophied myocyte and both Gi-protein and protein kinase C was involved in this process.
, 百拇医药
MeSH Anoxia; Hypertensions; Rats; Calcium; Protein kinase C; Proteins
近年来研究提示细胞内的信号转导异常在心肌肥厚的发生发展中起着 重要作用。细胞本身由特异的信号转导系统所调控，信号转导途径或相关分子表达异常，可 引起细胞生长及功能失控，导致机体组织病理性改变。G-蛋白作为一族特殊的调节蛋白，以 其特定方式偶联着膜受体与效应器，后者如腺苷酸环化酶、磷脂酶C及离子通道等，参与细 胞跨膜信息传递，其中百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)敏感的G-蛋白主要为抑制性G-蛋 白(Gi-蛋白)，参与心脏活动及功能的调节；蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)则与细胞 许多关键蛋白质的磷酸化有关[1]。近年对缺氧预处理的研究多采用正常动物，与 临床心肌缺血可能有较大差距[2，3]。为探讨缺氧预处理对高血压肥厚心脏的保 护作用及信号转导机制，实验利用分离的SHR心肌细胞，研究了缺氧预处理对后继缺氧再给 氧所致心肌细胞内钙超载的影响，以及PKC和PTX敏感的G-蛋白在缺氧预处理中的作用。
, http://www.100md.com
材料与方法
(一)试剂：百日咳毒素、Staurosporine、Fura-2AM、MEM培养基及胶原酶皆为Sigma产品，E GTA系潮州生物化学厂生产，其余试剂皆为国产分析纯。
(二)动物：自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)购自上海高血压病 研究所，饲养至40周进行心肌细胞分离。此时已证明心肌细胞肥大。
(三)心肌细胞分离方法：参照Inoue报道[4]以0.1%胶原酶进行循环灌流以分离心 肌细胞。镜下可见心肌细胞结构完整，条纹清晰，80%以上胎盼蓝排斥反应阳性。
(四)心肌细胞内游离钙(free calcium,[Ca2+]i)测定方法[5]：利用急 性分离的SHR心肌细胞悬液，用终浓度为5 μmol/L Fura-2AM在37℃水浴中负载25 min，然 后分别以细胞外钙浓度([Ca2+]。)1.0 mmol/L的改良Hanks氏液和无外钙并加 入 1.0 mmol/L EGTA的Hanks氏液清洗细胞三次，以去除细胞外的Fura-2AM。将负载好的细胞 悬液100 μL加入特制的中心有容积孔的载玻片中，以AR-CM-MIC阳离子测定系统(美国SPEX 公司产品，可选取镜下单个心肌细胞描记其荧光变化)，荧光激发波长分别为340 nm和380 n m测定心肌细胞[Ca2+]i。心肌细胞[Ca2+]i计算公式为：[Ca 2+]i＝Kd×(Sb1/Sb2)[(R-Rmins)/(Rmax-R)],其中Kd为Fura-2 -Ca 2+解离常数，R为观察到两激发波长荧光比值(F340/F380)；在37℃下Kd为224 nmol/ L；R max为细胞内Fura-2被Ca2+饱和时的两激发波长荧光比值，通过加入离子载体lon omycin 20 μmol/L测得；Rmin为Fura-2完全游离，未与Ca2+结合时两激发波长的 荧光比值，通过加入EGTA 20 mmol/L测得；Sb1/Sb2为Fura-2在无Ca2+以 及与Ca2+结合达饱和状态下，在380 nm处荧光强度之比。细胞自身荧光在没有负载 Fura-2AM时测定，计算[Ca2+]i前减去细胞自身荧光。
, 百拇医药
(五)缺氧预处理方法：以纯N2排空空气，进行3次5 min预处理，每次间隔5 min，其间通 以95%O2+5%CO2；并设非预处理对照组，观察两组细胞对其后持续30 min纯N2灌注 及再给予95%O2+5% CO2 60 min对心肌细胞[Ca2+]i水平的影响。实验共 分8组细胞，每组测定8个细胞，以观察缺氧预处理对[Ca2+]i水平的影响及PKC及PT X敏感的G-蛋白在缺氧预处理中的作用。具体分组如下：
(a):Fura-2AM 负载后清洗液及细胞悬浮液皆为无钙同时加入EGTA(终浓度为1.0 mmol/L)的 H ank 氏液，3次缺氧预处理后间隔30 min再进行30 min持续纯N2灌注及再给予95%O2+5 % CO260 min，测定心肌细胞[Ca2+]i水平；(b):未进行缺氧预处理直接进行 30 min持续纯N2灌注及再给予95%O2+5%CO2 60 min，其余条件同a组，测定心肌细 胞[Ca2+]i水平；(c):缺氧预处理前以PKC拮抗剂Staurosporine(10 nmol/L)处理 细胞10 min，其余条件同a组；(d):缺氧预处理前以Gi-蛋白失活剂PTX(200 ng/L)处理细胞5 h，其余条件同a组；(e):Fura-2AM负载后以细胞外钙浓度([Ca2+]。)1.0 mmol /L 的改良Hank氏液清洗细胞三次，进行3次缺氧预处理，间隔30 min后再进行30 min持续纯N 2灌注及再给予95%O2+5% CO260 min，测定心肌细胞[Ca2+]i水平；(f): 未进行缺氧预处理，直接进行30 min持续纯N2灌注及再给予95%O2+5%CO2 60 min ，其余条件同e组，测定心肌细胞[Ca2+]i水平；(g):缺氧预处理前以Staurospor ine( 10 nmol/L)处理细胞10 min，其余条件同e组；(h):缺氧预处理前以PTX(200 ng/L)处理细胞 5 h，其余条件同e组。
, 百拇医药
(六)统计学处理：所有数据均以
±s表示。组间数据处理根据方差齐性分析结 果，采用t检验或校正t检验。
结 果
以AR-CM-MIC阳离子测定系统测定各组心肌细胞[Ca2+]i，结果见表1 。
结果可见无论细胞悬液中有无Ca2+，缺氧再给氧后非缺氧预处理组心肌 细胞[Ca2+]i明显高于缺氧预处理组，且[Ca2+]。为1.0 mmol/L时 非缺氧预处理组与缺氧预处理组[Ca2+]i差值较无外Ca2+时二者差异明 显 ，提示缺氧预处理可减少缺氧再给氧所致内钙释放和外钙内流。悬液中无Ca2+组于 缺氧预处理前分别预先给予PKC拮抗剂Staurosporine及Gi-蛋白失活剂PTX，经后继缺氧再给 氧后其心肌细胞[Ca2+]i高于单纯缺氧预处理组，与未预处理组无显著差异；悬 液中外Ca2+为1.0 mmol/L时，于缺氧预处理前分别预先给予Staurosporine及PTX ，经后继缺氧再给氧后其心肌细胞[Ca2+]i高于单纯缺氧预处理组，但低于未预 处理组。
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表1 缺氧预处理对缺氧再给氧SHR心肌细胞内钙含量的影响
Tab 1 Effects of hypoxic preconditioning on the [Ca2+ ]i in myocytes
of SHR following hypoxic reoxygenation(±s，n=8) Group
[Ca2+ ]o(mmol/L)
[Ca2+]i(nmol/L)
a(HPC)
0
, http://www.100md.com
186.4±21.5**
b(Non-HPC)
0
304.5±41.6＃＃
c(ST 10 nmol/L,HPC)
0
276.5±35.2＃＃
d(PTX 200 ng/L,HPC)
0
288.2±32.6＃＃
, http://www.100md.com e(HPC)
1.0
232.5±24.3**
f(Non-HPC)
1.0
385.4±46.7＃＃
g(ST 10 nmol/L, HPC)
1.0
316.5±43.1**＃＃
h(PTX 200 ng/L,HPC)
1.0
, 百拇医药
336.3±37.4**＃＃
**P<0.01,vs non-HPC; ＃P<0.05，＃＃P<0.01，vs HPC; HPC＝hypoxia preconditioning; ST=Staurosporine
讨 论
近年来人们对缺血预处理的心脏的保护作用进行了广泛研究，已在多种动物得到证实 。其保护作用主要涉及后继持久缺血(或缺血再灌)所致的心脏功能下降、缩小心梗面积 及降低严重心律失常的发生率等。但研究多限于正常动物且其保护作用的时相、范围报道不 一，其信号机制尚未阐明[2，3，6]，特别是对肥厚心脏的保护作用未引起人们 足够重视。心肌肥厚作为心血管疾病的独立危险因子，与心血管意外的发生关系密切。Gi- 蛋白、PKC及Ca2+皆为重要的信使分子，在细胞跨膜信息传递、细胞功能调节等方 面具有重要作用。近年来研究提示Gi蛋白及PKC功能异常在高血压及心肌肥厚发生发展中 可能具有重要作用[7～9]。而心肌细胞内Ca2+既是其兴奋收缩的 关键物质，在维持细胞的电生理特性方面亦具有重要作用；细胞内Ca2+代谢紊乱与 心肌肥厚的发生发展及心肌缺血缺氧损伤、心律失常等有密切关系[10]，钙超载 是许多细胞最终死亡的共同途径。本实验利用AR-CM-MIC阳离子测定系统测定单个心肌细胞 [Ca2+]i，方法精确可靠：以[Ca2+]i变化为指标反映从细胞水平研究 缺氧预处理在SHR肥厚心肌细胞的保护作用及PTX敏感的G-蛋白及PKC在缺氧预处理中的作用 ，目前尚未见报道。本实验结果可见无论细胞悬液中有无Ca2+，缺氧给氧均可导 致心肌细胞钙超载，而缺氧预处理具有明显减轻后继缺氧再给氧所致心肌细胞钙超载作用， 其机制可能涉及到减少外钙内流及内钙释放两个方面。缺氧预处理能够减轻缺氧再给氧所 致肥大 心肌细胞内钙超载，而心肌细胞缺氧预处理与在体缺血预处理相似，提示缺血预处理在自发 性高血压大鼠肥厚心脏仍具有保护作用，预先给予PKC拮抗剂Staurosporine或Gi-蛋白失活 剂PTX可抑制缺氧预处理减轻心肌细胞内钙超载的作用，说明缺氧预处理保护作用与PTX敏感 的G-蛋白及PKC有关。
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*国家自然科学基金资助(39570819)
参考文献
1 袁予辉，王迪浔.G-蛋白与血管反应性.生理科学进展，1994，2 5：319.
2 Piacentni L, Wanwright CL, Parratt JR, et al. The antiarrhythmic effec t of ischemic preconditioning in isolated rat heart involves a pertussis toxin s ensitive mechanism. Cardiovasc Res, 1993,27:674.
3 Lawson CS, Coltart DJ, Hearse DJ. The antiarrhythmic action of ischemi c preconditioning in rat heart dose not involve functional Gi protein. Cardiovas c Res, 1993,27:681.
, 百拇医药
4 Inoue I. Relationship between left ventricular hypertrophy and intrace llular sodium and calcium concentration. Circulation, 1989,80(SupplⅡ):Ⅱ536.
5 Berridge MJ. Inostiol triphosphate and calcium signalling. Nature, 199 3,361:315.
6 Toombs CF, Wiltse AL, Shebuski RJ, et al. Ischemic preconditioning fai ls to limit infart size in resperined rabbit myocardium: implication of norepip hrine release in the preconditioning effect. Circulation, 1993,88(pt 1):2351.
, 百拇医药
7 Kanagy NJ, Webb RC. Increased responsiveness and decreased expression of G proteins in deoxycorticosterone hypertension. Hypertension, 1996,27(part 2) :740.
8 Fleminsg JW, Wisler PL, Watanabe AM. Signal transduction by G-protein mechanism. Circulation, 1993,85:420.
9 金有豫.跨膜信号转导在缺氧预处理中的作用.基础医学与临床，1997，17：13 .
10 Inoue I, Fugu T, Htsuki T, et al. Relationship between left ventricu lar hypertrophy and intracellular sodium and calcium concentration Circulation, 1989,80 (SupplⅡ):536.
(1997年12月31日收稿，1998年6月24日修回), http://www.100md.com
单位：
刘培庆：山东省泰山医学院药理教研室； 饶曼人 南京医科大学心血管药理研究室(南京210029)；王金南京大学配位化学国家重点实验室
关键词：低氧；高血压；大鼠；钙；蛋白激酶C；蛋白质类
中国病理生理杂志/990704 摘要 目的：探讨缺氧预处理对后继缺氧再给氧所致心 肌细胞内钙超载的影响及蛋白激酶C(PKC)和百日咳毒素(PTX)敏感的G-蛋白在缺氧预处理的 作用。方法：循环灌流法分离自发性高血压大鼠(SHR)肥大心肌细胞，用Fu ra-2AM测定钙浓度。结果：[Ca2+]。为1.0 mmol/L时，预处理组缺氧再给氧后其心 肌细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为(194.0±24.8) nmol/L，未预处理组为(297.5 ±24.5) nmol/L；无外钙预处理组缺氧再给氧后其心肌细胞[Ca2+]i为(162.0 ±30.7) nmol/L，未预处理组为(236.5±28.3) nmol/L，提示缺氧预处理可减少缺氧再 给氧所致心肌细胞内钙释放及外钙内流。在[Ca2+]。为1.0 mmol/L组，于预处 理前分 别预先给予PKC拮抗剂Staurosporine(10 nmol/L)及Gi-蛋白失活剂百日咳毒素(PTX，200 ng /L)，可见经后继缺氧再给氧后其心肌细胞[Ca2+]i分别为(264.8±19.3)及(25 8.0±27.7) nmol/L，高于缺氧预处理组但低于未预处理组。结论：SH R肥 大心肌细胞，缺氧预处理可减轻后继缺氧再给氧所致心肌细胞内钙超载；PKC及PTX敏感的G- 蛋白可能部分参与缺氧预处理的保护作用。
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The influence of hypoxic preconditioning on cytosolic
free calci um concentration in cardiomyocyte isolated
from spontaneously hypertensive rats
LIU Pei-Qing, RAO Man-Ren, WANG Jin-Xi
Department of Cardiovascular Pharmacology , Nanjing Medical University, Nanjing (210029)
Abstract AIM：To investigate the influence of hypoxic precondi tioning on cytosolic free calcium concentration [Ca2+]i in myocyte s is olated from spontaneously hypertensive rats(SHR) and to study the actions of Gi- p rotein and protein kinase C in this process. METHODS：Myocytes were isolated by circulating-perfusion with col la genase and cytosolic free calcium concentrations were measured using Fura-2 flu orescence technique with AR-CM-MIC cation measurement system.RESULTS：Hypoxic preconditioning could attenate the increase in [Ca2+]i cau sed by hypoxia and reoxygenation both at 1.0 mmol/L [Ca2+]。 and calc ium-free Hanks solution. Pretreated with pertussis toxin or staurosporine coul d decrease t he elevation of [Ca2+]i. CONCLUSION：Hypoxic precond ition ing has preventing effect on calcium overload in hypertrophied myocyte and both Gi-protein and protein kinase C was involved in this process.
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MeSH Anoxia; Hypertensions; Rats; Calcium; Protein kinase C; Proteins
近年来研究提示细胞内的信号转导异常在心肌肥厚的发生发展中起着 重要作用。细胞本身由特异的信号转导系统所调控，信号转导途径或相关分子表达异常，可 引起细胞生长及功能失控，导致机体组织病理性改变。G-蛋白作为一族特殊的调节蛋白，以 其特定方式偶联着膜受体与效应器，后者如腺苷酸环化酶、磷脂酶C及离子通道等，参与细 胞跨膜信息传递，其中百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)敏感的G-蛋白主要为抑制性G-蛋 白(Gi-蛋白)，参与心脏活动及功能的调节；蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)则与细胞 许多关键蛋白质的磷酸化有关[1]。近年对缺氧预处理的研究多采用正常动物，与 临床心肌缺血可能有较大差距[2，3]。为探讨缺氧预处理对高血压肥厚心脏的保 护作用及信号转导机制，实验利用分离的SHR心肌细胞，研究了缺氧预处理对后继缺氧再给 氧所致心肌细胞内钙超载的影响，以及PKC和PTX敏感的G-蛋白在缺氧预处理中的作用。
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材料与方法
(一)试剂：百日咳毒素、Staurosporine、Fura-2AM、MEM培养基及胶原酶皆为Sigma产品，E GTA系潮州生物化学厂生产，其余试剂皆为国产分析纯。
(二)动物：自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)购自上海高血压病 研究所，饲养至40周进行心肌细胞分离。此时已证明心肌细胞肥大。
(三)心肌细胞分离方法：参照Inoue报道[4]以0.1%胶原酶进行循环灌流以分离心 肌细胞。镜下可见心肌细胞结构完整，条纹清晰，80%以上胎盼蓝排斥反应阳性。
(四)心肌细胞内游离钙(free calcium,[Ca2+]i)测定方法[5]：利用急 性分离的SHR心肌细胞悬液，用终浓度为5 μmol/L Fura-2AM在37℃水浴中负载25 min，然 后分别以细胞外钙浓度([Ca2+]。)1.0 mmol/L的改良Hanks氏液和无外钙并加 入 1.0 mmol/L EGTA的Hanks氏液清洗细胞三次，以去除细胞外的Fura-2AM。将负载好的细胞 悬液100 μL加入特制的中心有容积孔的载玻片中，以AR-CM-MIC阳离子测定系统(美国SPEX 公司产品，可选取镜下单个心肌细胞描记其荧光变化)，荧光激发波长分别为340 nm和380 n m测定心肌细胞[Ca2+]i。心肌细胞[Ca2+]i计算公式为：[Ca 2+]i＝Kd×(Sb1/Sb2)[(R-Rmins)/(Rmax-R)],其中Kd为Fura-2 -Ca 2+解离常数，R为观察到两激发波长荧光比值(F340/F380)；在37℃下Kd为224 nmol/ L；R max为细胞内Fura-2被Ca2+饱和时的两激发波长荧光比值，通过加入离子载体lon omycin 20 μmol/L测得；Rmin为Fura-2完全游离，未与Ca2+结合时两激发波长的 荧光比值，通过加入EGTA 20 mmol/L测得；Sb1/Sb2为Fura-2在无Ca2+以 及与Ca2+结合达饱和状态下，在380 nm处荧光强度之比。细胞自身荧光在没有负载 Fura-2AM时测定，计算[Ca2+]i前减去细胞自身荧光。
, 百拇医药
(五)缺氧预处理方法：以纯N2排空空气，进行3次5 min预处理，每次间隔5 min，其间通 以95%O2+5%CO2；并设非预处理对照组，观察两组细胞对其后持续30 min纯N2灌注 及再给予95%O2+5% CO2 60 min对心肌细胞[Ca2+]i水平的影响。实验共 分8组细胞，每组测定8个细胞，以观察缺氧预处理对[Ca2+]i水平的影响及PKC及PT X敏感的G-蛋白在缺氧预处理中的作用。具体分组如下：
(a):Fura-2AM 负载后清洗液及细胞悬浮液皆为无钙同时加入EGTA(终浓度为1.0 mmol/L)的 H ank 氏液，3次缺氧预处理后间隔30 min再进行30 min持续纯N2灌注及再给予95%O2+5 % CO260 min，测定心肌细胞[Ca2+]i水平；(b):未进行缺氧预处理直接进行 30 min持续纯N2灌注及再给予95%O2+5%CO2 60 min，其余条件同a组，测定心肌细 胞[Ca2+]i水平；(c):缺氧预处理前以PKC拮抗剂Staurosporine(10 nmol/L)处理 细胞10 min，其余条件同a组；(d):缺氧预处理前以Gi-蛋白失活剂PTX(200 ng/L)处理细胞5 h，其余条件同a组；(e):Fura-2AM负载后以细胞外钙浓度([Ca2+]。)1.0 mmol /L 的改良Hank氏液清洗细胞三次，进行3次缺氧预处理，间隔30 min后再进行30 min持续纯N 2灌注及再给予95%O2+5% CO260 min，测定心肌细胞[Ca2+]i水平；(f): 未进行缺氧预处理，直接进行30 min持续纯N2灌注及再给予95%O2+5%CO2 60 min ，其余条件同e组，测定心肌细胞[Ca2+]i水平；(g):缺氧预处理前以Staurospor ine( 10 nmol/L)处理细胞10 min，其余条件同e组；(h):缺氧预处理前以PTX(200 ng/L)处理细胞 5 h，其余条件同e组。
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(六)统计学处理：所有数据均以
±s表示。组间数据处理根据方差齐性分析结 果，采用t检验或校正t检验。结 果
以AR-CM-MIC阳离子测定系统测定各组心肌细胞[Ca2+]i，结果见表1 。
结果可见无论细胞悬液中有无Ca2+，缺氧再给氧后非缺氧预处理组心肌 细胞[Ca2+]i明显高于缺氧预处理组，且[Ca2+]。为1.0 mmol/L时 非缺氧预处理组与缺氧预处理组[Ca2+]i差值较无外Ca2+时二者差异明 显 ，提示缺氧预处理可减少缺氧再给氧所致内钙释放和外钙内流。悬液中无Ca2+组于 缺氧预处理前分别预先给予PKC拮抗剂Staurosporine及Gi-蛋白失活剂PTX，经后继缺氧再给 氧后其心肌细胞[Ca2+]i高于单纯缺氧预处理组，与未预处理组无显著差异；悬 液中外Ca2+为1.0 mmol/L时，于缺氧预处理前分别预先给予Staurosporine及PTX ，经后继缺氧再给氧后其心肌细胞[Ca2+]i高于单纯缺氧预处理组，但低于未预 处理组。
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表1 缺氧预处理对缺氧再给氧SHR心肌细胞内钙含量的影响
Tab 1 Effects of hypoxic preconditioning on the [Ca2+ ]i in myocytes
of SHR following hypoxic reoxygenation(
±s，n=8) Group[Ca2+ ]o(mmol/L)
[Ca2+]i(nmol/L)
a(HPC)
0
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186.4±21.5**
b(Non-HPC)
0
304.5±41.6＃＃
c(ST 10 nmol/L,HPC)
0
276.5±35.2＃＃
d(PTX 200 ng/L,HPC)
0
288.2±32.6＃＃
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1.0
232.5±24.3**
f(Non-HPC)
1.0
385.4±46.7＃＃
g(ST 10 nmol/L, HPC)
1.0
316.5±43.1**＃＃
h(PTX 200 ng/L,HPC)
1.0
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336.3±37.4**＃＃
**P<0.01,vs non-HPC; ＃P<0.05，＃＃P<0.01，vs HPC; HPC＝hypoxia preconditioning; ST=Staurosporine
讨 论
近年来人们对缺血预处理的心脏的保护作用进行了广泛研究，已在多种动物得到证实 。其保护作用主要涉及后继持久缺血(或缺血再灌)所致的心脏功能下降、缩小心梗面积 及降低严重心律失常的发生率等。但研究多限于正常动物且其保护作用的时相、范围报道不 一，其信号机制尚未阐明[2，3，6]，特别是对肥厚心脏的保护作用未引起人们 足够重视。心肌肥厚作为心血管疾病的独立危险因子，与心血管意外的发生关系密切。Gi- 蛋白、PKC及Ca2+皆为重要的信使分子，在细胞跨膜信息传递、细胞功能调节等方 面具有重要作用。近年来研究提示Gi蛋白及PKC功能异常在高血压及心肌肥厚发生发展中 可能具有重要作用[7～9]。而心肌细胞内Ca2+既是其兴奋收缩的 关键物质，在维持细胞的电生理特性方面亦具有重要作用；细胞内Ca2+代谢紊乱与 心肌肥厚的发生发展及心肌缺血缺氧损伤、心律失常等有密切关系[10]，钙超载 是许多细胞最终死亡的共同途径。本实验利用AR-CM-MIC阳离子测定系统测定单个心肌细胞 [Ca2+]i，方法精确可靠：以[Ca2+]i变化为指标反映从细胞水平研究 缺氧预处理在SHR肥厚心肌细胞的保护作用及PTX敏感的G-蛋白及PKC在缺氧预处理中的作用 ，目前尚未见报道。本实验结果可见无论细胞悬液中有无Ca2+，缺氧给氧均可导 致心肌细胞钙超载，而缺氧预处理具有明显减轻后继缺氧再给氧所致心肌细胞钙超载作用， 其机制可能涉及到减少外钙内流及内钙释放两个方面。缺氧预处理能够减轻缺氧再给氧所 致肥大 心肌细胞内钙超载，而心肌细胞缺氧预处理与在体缺血预处理相似，提示缺血预处理在自发 性高血压大鼠肥厚心脏仍具有保护作用，预先给予PKC拮抗剂Staurosporine或Gi-蛋白失活 剂PTX可抑制缺氧预处理减轻心肌细胞内钙超载的作用，说明缺氧预处理保护作用与PTX敏感 的G-蛋白及PKC有关。
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*国家自然科学基金资助(39570819)
参考文献
1 袁予辉，王迪浔.G-蛋白与血管反应性.生理科学进展，1994，2 5：319.
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(1997年12月31日收稿，1998年6月24日修回), http://www.100md.com