降钙素基因相关肽预适应对大鼠缺血/再灌注心肌的作用
作者：欧阳伟 钱学贤 李志梁 付向阳 王素华
单位：钱学贤 李志梁 付向阳 王素华 第一军医大学珠江医院心内科(广州 510282)；欧阳伟 珠江医院核医学科
关键词：
中国病理生理杂志/990730
降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP) 是心脏 和血管感觉神经末梢释放的一种重要效应递质。在离体豚鼠心脏中，5 min短暂缺血即可引 起明显的CGRP释放。提示CGRP可能是一种内源性心肌保护物质。在离体大鼠模型中，CGRP预 适应不仅对缺血/再灌注心肌具有保护作用，而且对阿霉素、内皮素-1、氧自由基或长时间 心跳停博处理心肌也具有保护作用。本文旨在探讨于完整大鼠模型中，CGRP预适应是否也和 离体心脏一样能模拟缺血预适应(ischemic preconditioning, IPC)的心肌保护作用，且这 种心肌保护作用是否由ATP敏感钾(ATP-sensitive potassium, KATP)通道介导。
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材料与方法
一、材料：
健康雄性SD大鼠，体重250～350 g，由本校动物中心提供；CGRP由军事医学科学院基础所提 供；硝基四唑氮兰(nitro blue tetrazolium, NBT)为Serva产品；优降糖(glibenclamide, GLI,用10% Tween-80和无水酒精溶解)和Evans Blue均为Sigma产品。
二、动物模型的复制：
用3%戊巴比妥钠(60 mg/kg，iv)麻醉大鼠。行气管插管，小动物人工呼吸机室内空气通气， 频率65～70次/min，潮气量3～4 mL。实验期间维持血pH、PaO2和PaCO2在正常范围。颈 动脉插管监测血压。颈静脉插管补液和给药。持续记录心电变化。开胸暴露心脏，用穿有3- 0缝合线的3/8弯针钩绕左冠状动脉前降支主支。线两端共穿过一根聚乙稀小管以形成闭环。 拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血，放松闭环即发生 再灌注。结扎前1 min给予肝素(250 U/kg)。
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三、实验分组：
将72只大鼠随机分为6组，每组12只。
I30min/R2h组：接受30 min缺血/2 h再灌注；IPC+ I30 min/R2 h 组：先行3次5 min缺血/5 min再灌注，然后缺血30 min/再灌注2 h；GLI+IPC+I30 min /R2 h组：先静注GLI(0.3 mg/kg)，30 min后行3次5 min缺血/5 min再灌注，然后 缺血30 min，再灌注2 h；CGRP+I30 min/R2 h组：先静注CGRP(10 μg/kg)，2 0 min后再行30 min缺血/2 h再灌注：GLI+CGRP+I30 min/R2 h组：先静注GL I (0.3 mg/kg)，30 min后再静注CGRP(10 μg/kg)，20 min后再行30 min缺血/2 h再灌注；GL I+I30 min/R2 h组：先静注GLI(0.3 mg/kg)，60 min后行30 min缺血/2 h再灌 注。
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I30 min/R2 h、 GLI+IPC+I30 min/R2 h、 GLI+CGRP+I30 m in/R2 h和GLI+I30 min/R2 h组在给药前、持续 缺血前即刻、缺血末和再灌注未分别用Backman自动生化分析仪测定血糖。
四、梗塞大小的测定：
再灌注2 h后，重新拉紧闭环使冠脉阻塞。从静脉导管中注入5% Evans Blue 1 mL，待大鼠 眼球变蓝后，用10%氯化钾杀死大鼠。切除心脏，放置-4 ℃冰箱30 min后取出。从心尖向心 底方向将心脏均匀切为7～8片，灌注区染为蓝色，非灌注区不染色。在解剖显微镜下小心将 蓝色区与未染色区分离。将未染色区置于pH 7.4、 0.5 mg/mL的NBT溶液中，并放于37 ℃ 水箱孵化20 min。坏死区因无脱氢酶故不染色，未坏死区因含有活性的脱氢酶故染为紫蓝色 。在解剖显微镜下，小心将染色区与未染色区 分离。将蓝色区、紫蓝色区和未染色区用电子天平称重。紫蓝色区和未染色区之和为危险区 (area at risk, AAR)，未染色区为坏死区(infarct size, IS)，梗塞大小用IS在AAR中所占 的百分比表示。
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五、退出试验的标准：
有下列情况之一的大鼠将退出试验：(1)当灌注染色后，AAR不足心脏重的15%；(2)结扎冠状 动脉失败或未发现再灌注者；(3) 过度出血并致血压下降者；(4)呼吸心跳停止超过 30 s者；(5)实验过程中血压低于9.3 kPa或心率低于240 beat/min。
六、统计处理：
所有数据用
±s表示，两组均值的比较用非配对t检验。两组以上的均值 比较用随机设计的方差分析和q检验。
结 果
一、一般情况：
72只大鼠完成了本实验。实验中有13只大鼠未满足本实验的入选标准而退出研究。退出的大 鼠按最初的随机分组原则重新补上。
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二、血压和心率变化：
CGRP+I30 min/R2 h和GLI+CGRP+I30 min/R2 h组静注CGRP 10 mi n后，平均动脉压(MAP)分别较相应的基础值平均降低3.7和2.9 kPa(P<0.01)。心率 (HR)分别较基础值升高16和12 b/min，但均无明显差异。所有6组大鼠30 min缺血前即刻 、再灌注前即刻和再灌注末时的MAP和HR与相应基础值比较无显著差别。
三、血糖水平的变化：
I30 min/R2 h组(6.94±1.33和6.60±0.78 mmol/L)血糖在缺血末和再灌 注末时与相应基础值(6.77±0.94 mmol/L)比均无显著差异。GLI+IPC+I30 min/R 2 h(4.16±0.44和3.77±0.50 mmol/L)、GLI+CGRP+I30 min/R2 h (3.82±0.44和3.44±0.50 mmol/L)和GLI+I30 min/R2 h(3.88±0.50和 3.60±0.50 mmol/L)组在缺血末和再灌注末时 的血糖水平均显著低于相应基础值(6.60±0.66，6.66±0.66和6.82±0.78 mmol/L) (P<0.01)。
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四、梗塞大小的变化：
6组大鼠在体重、心脏重和AAR方面均无显著差别。IPC+I30 min/R2 h组的IS (0.04±0.04 g vs 0.13±0.03 g,P<0.01)和IS/AAR(15.7%±9.0 % vs 5 2.8%±14.2%，P<0.01)均显著低于I30min/R2h组。CGRP+I30min /R2h组的 IS(0.08±0.04 g vs 0.13±0.03 g，P<0.01)和IS/AAR(28.8%±13.2% vs 54.0%±14.7%，P<0.01)也显著低于I30min/R2h组，但程度均 不及I PC+I30min/R2h明显(P<0.05)。 GLI+IPC+I30min/R2h组和GLI+CGRP+I30min/R2h 组的IS和IS/AAR与对照组相比均无显著差别。
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讨 论
CGRP是迄今降压作用最强的多肽。在离体大鼠模型中，CGRP预适应对缺血/再灌注、阿霉 素 等处理的心肌均具有保护作用。本研究在在体大鼠模型中也发现，CGRP预适应具有显著的限 制 心肌梗塞范围的作用，但其作用不及IPC明显，提示除CGRP外，还有其他内源性物质参与IPC 的心肌保护作用。
Noma首先证实心肌中存在有KATP通道。该通道是否开放取决于细胞内ATP浓度。在ATP 高浓度时，该通道关闭；在低浓度(如缺血时)该通道开放。Gross等首先显示，犬心肌IPC是 由KATP通道介导的。随后其他研究也发现KATP也介导猪、兔和人的IPC。以往 的研究认为，KATP通道不介导大鼠的心肌IPC。但近年来有两项研究表明，在在体大 鼠模型中，KATP通道阻滞剂GLI能完全取消IPC的心肌保护作用。提示大鼠心肌IPC也 由K ATP通道介导。本研究也证实了这一点。有研究表明，许多内源性心肌保护物质参与心肌 保护作用，其机理均与KATP通道激活密切有关。本研究也表明，在在体大鼠模型中，KATP通道阻断剂GLI能取消CGRP预适应限制心肌梗塞范围作用，提示CGRP预适应的 心肌保护作用也可能是由KATP通道介导的。
* 国家自然科学基金资助(No.39770348)
(1998年11月2日收稿，1999年4月15日修回), http://www.100md.com
单位：钱学贤 李志梁 付向阳 王素华 第一军医大学珠江医院心内科(广州 510282)；欧阳伟 珠江医院核医学科
关键词：
中国病理生理杂志/990730
降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP) 是心脏 和血管感觉神经末梢释放的一种重要效应递质。在离体豚鼠心脏中，5 min短暂缺血即可引 起明显的CGRP释放。提示CGRP可能是一种内源性心肌保护物质。在离体大鼠模型中，CGRP预 适应不仅对缺血/再灌注心肌具有保护作用，而且对阿霉素、内皮素-1、氧自由基或长时间 心跳停博处理心肌也具有保护作用。本文旨在探讨于完整大鼠模型中，CGRP预适应是否也和 离体心脏一样能模拟缺血预适应(ischemic preconditioning, IPC)的心肌保护作用，且这 种心肌保护作用是否由ATP敏感钾(ATP-sensitive potassium, KATP)通道介导。
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材料与方法
一、材料：
健康雄性SD大鼠，体重250～350 g，由本校动物中心提供；CGRP由军事医学科学院基础所提 供；硝基四唑氮兰(nitro blue tetrazolium, NBT)为Serva产品；优降糖(glibenclamide, GLI,用10% Tween-80和无水酒精溶解)和Evans Blue均为Sigma产品。
二、动物模型的复制：
用3%戊巴比妥钠(60 mg/kg，iv)麻醉大鼠。行气管插管，小动物人工呼吸机室内空气通气， 频率65～70次/min，潮气量3～4 mL。实验期间维持血pH、PaO2和PaCO2在正常范围。颈 动脉插管监测血压。颈静脉插管补液和给药。持续记录心电变化。开胸暴露心脏，用穿有3- 0缝合线的3/8弯针钩绕左冠状动脉前降支主支。线两端共穿过一根聚乙稀小管以形成闭环。 拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血，放松闭环即发生 再灌注。结扎前1 min给予肝素(250 U/kg)。
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三、实验分组：
将72只大鼠随机分为6组，每组12只。
I30min/R2h组：接受30 min缺血/2 h再灌注；IPC+ I30 min/R2 h 组：先行3次5 min缺血/5 min再灌注，然后缺血30 min/再灌注2 h；GLI+IPC+I30 min /R2 h组：先静注GLI(0.3 mg/kg)，30 min后行3次5 min缺血/5 min再灌注，然后 缺血30 min，再灌注2 h；CGRP+I30 min/R2 h组：先静注CGRP(10 μg/kg)，2 0 min后再行30 min缺血/2 h再灌注：GLI+CGRP+I30 min/R2 h组：先静注GL I (0.3 mg/kg)，30 min后再静注CGRP(10 μg/kg)，20 min后再行30 min缺血/2 h再灌注；GL I+I30 min/R2 h组：先静注GLI(0.3 mg/kg)，60 min后行30 min缺血/2 h再灌 注。
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I30 min/R2 h、 GLI+IPC+I30 min/R2 h、 GLI+CGRP+I30 m in/R2 h和GLI+I30 min/R2 h组在给药前、持续 缺血前即刻、缺血末和再灌注未分别用Backman自动生化分析仪测定血糖。
四、梗塞大小的测定：
再灌注2 h后，重新拉紧闭环使冠脉阻塞。从静脉导管中注入5% Evans Blue 1 mL，待大鼠 眼球变蓝后，用10%氯化钾杀死大鼠。切除心脏，放置-4 ℃冰箱30 min后取出。从心尖向心 底方向将心脏均匀切为7～8片，灌注区染为蓝色，非灌注区不染色。在解剖显微镜下小心将 蓝色区与未染色区分离。将未染色区置于pH 7.4、 0.5 mg/mL的NBT溶液中，并放于37 ℃ 水箱孵化20 min。坏死区因无脱氢酶故不染色，未坏死区因含有活性的脱氢酶故染为紫蓝色 。在解剖显微镜下，小心将染色区与未染色区 分离。将蓝色区、紫蓝色区和未染色区用电子天平称重。紫蓝色区和未染色区之和为危险区 (area at risk, AAR)，未染色区为坏死区(infarct size, IS)，梗塞大小用IS在AAR中所占 的百分比表示。
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五、退出试验的标准：
有下列情况之一的大鼠将退出试验：(1)当灌注染色后，AAR不足心脏重的15%；(2)结扎冠状 动脉失败或未发现再灌注者；(3) 过度出血并致血压下降者；(4)呼吸心跳停止超过 30 s者；(5)实验过程中血压低于9.3 kPa或心率低于240 beat/min。
六、统计处理：
所有数据用
±s表示，两组均值的比较用非配对t检验。两组以上的均值 比较用随机设计的方差分析和q检验。结 果
一、一般情况：
72只大鼠完成了本实验。实验中有13只大鼠未满足本实验的入选标准而退出研究。退出的大 鼠按最初的随机分组原则重新补上。
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二、血压和心率变化：
CGRP+I30 min/R2 h和GLI+CGRP+I30 min/R2 h组静注CGRP 10 mi n后，平均动脉压(MAP)分别较相应的基础值平均降低3.7和2.9 kPa(P<0.01)。心率 (HR)分别较基础值升高16和12 b/min，但均无明显差异。所有6组大鼠30 min缺血前即刻 、再灌注前即刻和再灌注末时的MAP和HR与相应基础值比较无显著差别。
三、血糖水平的变化：
I30 min/R2 h组(6.94±1.33和6.60±0.78 mmol/L)血糖在缺血末和再灌 注末时与相应基础值(6.77±0.94 mmol/L)比均无显著差异。GLI+IPC+I30 min/R 2 h(4.16±0.44和3.77±0.50 mmol/L)、GLI+CGRP+I30 min/R2 h (3.82±0.44和3.44±0.50 mmol/L)和GLI+I30 min/R2 h(3.88±0.50和 3.60±0.50 mmol/L)组在缺血末和再灌注末时 的血糖水平均显著低于相应基础值(6.60±0.66，6.66±0.66和6.82±0.78 mmol/L) (P<0.01)。
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四、梗塞大小的变化：
6组大鼠在体重、心脏重和AAR方面均无显著差别。IPC+I30 min/R2 h组的IS (0.04±0.04 g vs 0.13±0.03 g,P<0.01)和IS/AAR(15.7%±9.0 % vs 5 2.8%±14.2%，P<0.01)均显著低于I30min/R2h组。CGRP+I30min /R2h组的 IS(0.08±0.04 g vs 0.13±0.03 g，P<0.01)和IS/AAR(28.8%±13.2% vs 54.0%±14.7%，P<0.01)也显著低于I30min/R2h组，但程度均 不及I PC+I30min/R2h明显(P<0.05)。 GLI+IPC+I30min/R2h组和GLI+CGRP+I30min/R2h 组的IS和IS/AAR与对照组相比均无显著差别。
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讨 论
CGRP是迄今降压作用最强的多肽。在离体大鼠模型中，CGRP预适应对缺血/再灌注、阿霉 素 等处理的心肌均具有保护作用。本研究在在体大鼠模型中也发现，CGRP预适应具有显著的限 制 心肌梗塞范围的作用，但其作用不及IPC明显，提示除CGRP外，还有其他内源性物质参与IPC 的心肌保护作用。
Noma首先证实心肌中存在有KATP通道。该通道是否开放取决于细胞内ATP浓度。在ATP 高浓度时，该通道关闭；在低浓度(如缺血时)该通道开放。Gross等首先显示，犬心肌IPC是 由KATP通道介导的。随后其他研究也发现KATP也介导猪、兔和人的IPC。以往 的研究认为，KATP通道不介导大鼠的心肌IPC。但近年来有两项研究表明，在在体大 鼠模型中，KATP通道阻滞剂GLI能完全取消IPC的心肌保护作用。提示大鼠心肌IPC也 由K ATP通道介导。本研究也证实了这一点。有研究表明，许多内源性心肌保护物质参与心肌 保护作用，其机理均与KATP通道激活密切有关。本研究也表明，在在体大鼠模型中，KATP通道阻断剂GLI能取消CGRP预适应限制心肌梗塞范围作用，提示CGRP预适应的 心肌保护作用也可能是由KATP通道介导的。
* 国家自然科学基金资助(No.39770348)
(1998年11月2日收稿，1999年4月15日修回), http://www.100md.com