细胞凋亡的DNA缺口原位检测法*
作者：郝红缨 张萍 张翼军 王申五
单位：
郝红缨 武警总医院血液科(北京100039)；张萍 王申五 北京医科大学血液病研究所；张翼军 第三军医大学西南医院血液科
关键词：
中国病理生理杂志990825 与细胞增殖、分化一样，细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫调节及肿瘤发生等方面发挥重要的作用。为使细胞凋亡的检测既简便易行，又直观可靠，我们参考有关文献[1]，改良了一种DNA缺口的末端转移酶原位检测法。
材料与方法
一、材料：
1.取对数生长期的K562细胞(由北京医科大学人民医院血液病研究所细胞生物室提供)，以含10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃，5% CO2、饱和湿度下培养。
, http://www.100md.com
2.足叶乙甙为北京医药工业研究所实验药厂产品，终浓度为20 μg/mL，作用时间分别为12、 24、 48、 72 h；同时设未加药物的对照组。
二、方法：
实验组、对照组K562细胞于培养后不同时间取出，手工涂片，晾干后用1.5%多聚甲醛-戊二醛固定10 min，PBS洗片两次后65℃烤1 h，0.03% Triton X-100洗片两次后蛋白酶K(10 μg/mL)37℃消化10 min，1.5%多聚甲醛-戊二醛固定1 min，依次给50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水各3 min，加入末端转移酶工作液20 μL(Promega公司，0.7%反应缓冲液，0.1 mmol/L Biotin-11-dUTP,末端转移酶0.5 μL)37℃作用30 min(阴性对照不加工作液)，洗脱液(0.1%Triton X-100,0.5%牛血清白蛋白)洗片2次，阻断液(50 g/L脱脂奶粉，100 mmol/L Tris. HCl,150 mmol/L NaCl,0.2 g/L叠氮钠)室温作用15 min后每片加入链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶联接物(SA-Ap)15 μL(美国BRL公司)，碱性磷酸酶稀释液45 μL,37℃保温30 min，四氮唑蓝(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)20 μL于37℃作用1 h，三蒸水洗净后光镜下观察。若DNA出现缺口，则细胞内显示紫蓝色颗粒或絮状物。用QUANTIMET970图像分析仪(军事医学科学院仪器中心图像分析室)对标本进行扫描，随机选取10个细胞，计算出信号的积分光密度(IOD)，以表示DNA缺口出现的多少，结果用计量资料的t检验测试。
, 百拇医药
结 果
K562细胞在足叶乙甙作用下，随时间延长，显色逐渐加深，表明凋亡后断裂的缺口逐渐增多。K562细胞加入足叶乙甙后24 h IOD值与培养前相比差异显著(P<0.05)，说明有明显的缺口出现(表1)。
表1 K562细胞加入足叶乙甙后不同时相DNA缺口的原位检测结果
Tab 1 Results of DNA nick in situ assay in K562 cells induced by etopside after different periods (IOD) Group
0
12
, 百拇医药
24
48
72 (h)
Experiment
491.1247±146.5633
551.5672±87.1200
626.321±106.048*
720.003±127.858**
1149.0731±661.8990**
Control
, 百拇医药
490.8300±90.2240
490.1320±92.3770
487.588±101.364
495.794±113.375
490.6930±108.2400
*P<0.05,** P<0.01,vs control
讨 论
随着对细胞凋亡研究的深入，出现了多种检测细胞凋亡的方法，如细胞形态学观察、DNA片段电泳、流式细胞仪分析等。细胞形态在凋亡后期才出现明显的改变。DNA片段的降解被认为是细胞凋亡的最重要特征之一，但DNA片段的提取繁锁、费时，且需要的细胞数量多[2]；流式细胞仪不能将细胞凋亡的发生在组织细胞中原位显示出来，这些方法都有利有弊。DNA缺口的末端转移酶原位检测法与现有的许多TUNEL反应(TdT-mediate dUTP-x-nick end labeling)试剂盒相比，由于使用图像分析而达到半定量，说服力更强，更为直观。实际工作中应将上述几种方法结合起来，综合分析。
, 百拇医药
实验发现，在足叶乙甙诱导的K562细胞凋亡过程中，随时间延长，凋亡细胞逐渐增多。我们在每一时相点也同时进行了细胞形态观察及DNA片段电泳，发现：足叶乙甙处理后的K562细胞在12 h即有明显的DNA缺口形成，而在48 h方才出现DNA ladder，这一方面说明DNA缺口的原位检测更加灵敏，另一方面说明凋亡的过程似乎是由DNA缺口形成至DNA ladder出现，将在以后的研究中进一步探讨。
* 国家自然科学基金资助(No.39470316)
参考文献
1 Gavrieli I,Sherman Y,Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119(3):493.
2 Alexei G,Basnakian S,Jiu James. A rapid and sensitive assay for the detection of DNA fragmentation during early phases of apoptosis.Nucleic Acids Res,1994,22(13):2 714.
(1997年12月1日收稿，1998年3月3日修回), 百拇医药
单位：
郝红缨 武警总医院血液科(北京100039)；张萍 王申五 北京医科大学血液病研究所；张翼军 第三军医大学西南医院血液科
关键词：
中国病理生理杂志990825 与细胞增殖、分化一样，细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫调节及肿瘤发生等方面发挥重要的作用。为使细胞凋亡的检测既简便易行，又直观可靠，我们参考有关文献[1]，改良了一种DNA缺口的末端转移酶原位检测法。
材料与方法
一、材料：
1.取对数生长期的K562细胞(由北京医科大学人民医院血液病研究所细胞生物室提供)，以含10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃，5% CO2、饱和湿度下培养。
, http://www.100md.com
2.足叶乙甙为北京医药工业研究所实验药厂产品，终浓度为20 μg/mL，作用时间分别为12、 24、 48、 72 h；同时设未加药物的对照组。
二、方法：
实验组、对照组K562细胞于培养后不同时间取出，手工涂片，晾干后用1.5%多聚甲醛-戊二醛固定10 min，PBS洗片两次后65℃烤1 h，0.03% Triton X-100洗片两次后蛋白酶K(10 μg/mL)37℃消化10 min，1.5%多聚甲醛-戊二醛固定1 min，依次给50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水各3 min，加入末端转移酶工作液20 μL(Promega公司，0.7%反应缓冲液，0.1 mmol/L Biotin-11-dUTP,末端转移酶0.5 μL)37℃作用30 min(阴性对照不加工作液)，洗脱液(0.1%Triton X-100,0.5%牛血清白蛋白)洗片2次，阻断液(50 g/L脱脂奶粉，100 mmol/L Tris. HCl,150 mmol/L NaCl,0.2 g/L叠氮钠)室温作用15 min后每片加入链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶联接物(SA-Ap)15 μL(美国BRL公司)，碱性磷酸酶稀释液45 μL,37℃保温30 min，四氮唑蓝(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)20 μL于37℃作用1 h，三蒸水洗净后光镜下观察。若DNA出现缺口，则细胞内显示紫蓝色颗粒或絮状物。用QUANTIMET970图像分析仪(军事医学科学院仪器中心图像分析室)对标本进行扫描，随机选取10个细胞，计算出信号的积分光密度(IOD)，以表示DNA缺口出现的多少，结果用计量资料的t检验测试。
, 百拇医药
结 果
K562细胞在足叶乙甙作用下，随时间延长，显色逐渐加深，表明凋亡后断裂的缺口逐渐增多。K562细胞加入足叶乙甙后24 h IOD值与培养前相比差异显著(P<0.05)，说明有明显的缺口出现(表1)。
表1 K562细胞加入足叶乙甙后不同时相DNA缺口的原位检测结果
Tab 1 Results of DNA nick in situ assay in K562 cells induced by etopside after different periods (IOD) Group
0
12
, 百拇医药
24
48
72 (h)
Experiment
491.1247±146.5633
551.5672±87.1200
626.321±106.048*
720.003±127.858**
1149.0731±661.8990**
Control
, 百拇医药
490.8300±90.2240
490.1320±92.3770
487.588±101.364
495.794±113.375
490.6930±108.2400
*P<0.05,** P<0.01,vs control
讨 论
随着对细胞凋亡研究的深入，出现了多种检测细胞凋亡的方法，如细胞形态学观察、DNA片段电泳、流式细胞仪分析等。细胞形态在凋亡后期才出现明显的改变。DNA片段的降解被认为是细胞凋亡的最重要特征之一，但DNA片段的提取繁锁、费时，且需要的细胞数量多[2]；流式细胞仪不能将细胞凋亡的发生在组织细胞中原位显示出来，这些方法都有利有弊。DNA缺口的末端转移酶原位检测法与现有的许多TUNEL反应(TdT-mediate dUTP-x-nick end labeling)试剂盒相比，由于使用图像分析而达到半定量，说服力更强，更为直观。实际工作中应将上述几种方法结合起来，综合分析。
, 百拇医药
实验发现，在足叶乙甙诱导的K562细胞凋亡过程中，随时间延长，凋亡细胞逐渐增多。我们在每一时相点也同时进行了细胞形态观察及DNA片段电泳，发现：足叶乙甙处理后的K562细胞在12 h即有明显的DNA缺口形成，而在48 h方才出现DNA ladder，这一方面说明DNA缺口的原位检测更加灵敏，另一方面说明凋亡的过程似乎是由DNA缺口形成至DNA ladder出现，将在以后的研究中进一步探讨。
* 国家自然科学基金资助(No.39470316)
参考文献
1 Gavrieli I,Sherman Y,Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119(3):493.
2 Alexei G,Basnakian S,Jiu James. A rapid and sensitive assay for the detection of DNA fragmentation during early phases of apoptosis.Nucleic Acids Res,1994,22(13):2 714.
(1997年12月1日收稿，1998年3月3日修回), 百拇医药